Summary
We beschrijven een techniek om extracellulair op te nemen en te stimuleren van zenuwen, spieren, en individuele geïdentificeerde neuronen
Abstract
Multifunctionaliteit, het vermogen van een perifere structuur meerdere, verschillende gedragingen 1 te genereren, kunnen dieren snel hun gedrag passen aan veranderende omstandigheden. De mariene weekdier Aplysia californica biedt een soepel systeem voor de studie van multifunctionaliteit. Tijdens het voeden, Aplysia genereert een aantal verschillende soorten van gedrag met behulp van dezelfde voedselopnameapparaat, de buccale massa. De ganglia die bepalen deze gedragingen bevatten een aantal grote, geïdentificeerde neuronen die toegankelijk zijn voor elektrofysiologische studie. De activiteit van deze neuronen is beschreven in motor's die kunnen worden onderverdeeld in twee types, ingestive en egestive's, gebaseerd op de timing van neurale activiteit die sluit het voedsel grijper ten opzichte van de neurale activiteit die protracts of trekt de grijper 2. Echter in geïsoleerde ganglia, de spierbewegingen die zou produceren deze gedrag afwezig, waardoor hetmoeilijker om zeker of de waargenomen motor programma's correlaten van real gedrag. In vivo, zenuwen en spieren opnamen verkregen overeenkomt met voeren programma 2,3,4, maar het is zeer moeilijk om direct van individuele neuronen 5. Bovendien, in vivo, kan ingestive programma verder worden onderverdeeld in beten en slikt 1,2, een onderscheid dat is moeilijk om in de meeste eerder beschreven in vitro preparaten.
De geschorste buccale massa voorbereiding (figuur 1) overbrugt de kloof tussen geïsoleerde ganglia en intacte dieren. In dit preparaat, ingestive gedrag - zowel bijten en slikken - kan egestive en gedrag (afstoting) worden opgewekt, tegelijk als individuele neuronen kunnen worden opgenomen van en gestimuleerd met extracellulaire elektroden 6. De voeding bewegingen in verband met deze verschillende gedragingen kunnen worden recorded, gekwantificeerd en direct gerelateerd aan de motor programma. De motor programma's in de geschorste buccale massa voorbereiding lijken meer vergelijkbaar met die waargenomen in vivo dan zijn motorische programma's opgewekt in geïsoleerde ganglia. Aldus kan de motor programma in dit preparaat meer rechtstreeks verband houden met in vivo gedrag, tegelijkertijd, individuele neuronen toegankelijk zijn voor opname en stimulatie dan in intacte dieren. Bovendien, als een tussenstap tussen geïsoleerde ganglia en intacte dieren, bevindingen uit de geschorste buccale massa kan helpen bij de interpretatie van de gegevens die zijn verkregen in zowel de meer gereduceerde en meer intact instellingen. De geschorste buccale massa voorbereiding is een nuttig instrument voor het karakteriseren van de neurale aansturing van multifunctionaliteit in Aplysia.
Protocol
1. Bereiding van Oplossingen
- Om magnesium chloride oplossing die isotonisch het zeewater waarin de dieren worden gehouden (~ 1.000 millosmolar) bereiden markeren een grote kan op het niveau van het gewenste volume. Vul de kan met gedestilleerd water tot ongeveer 80% van dit niveau, en wegen de benodigde hoeveelheid van magnesiumchloride-hexahydraat om een 333 mM oplossing in het uiteindelijke volume te creëren. Voeg de magnesiumchloride aan de kan, sluit het deksel en schud krachtig tot het magnesiumchloride volledig is opgelost, en vervolgens gedestilleerd water toegevoegd tot het uiteindelijke volume is bereikt.
- Om Aplysia zoutoplossing te bereiden, opnieuw markeren een grote kruik op het niveau van het gewenste volume, en vul met gedestilleerd water tot ongeveer 80% van dit niveau. Plaats de kan op een roerplaat, plaats een roerstaaf in de kan, en zet de roerplaat.
- Een voor een, afwegen en toevoegen aan de kan van de juiste hoeveelheden van de volgende stoffen naar deze con creërentraties in het eindvolume: 460 mM natriumchloride, 10 mM kaliumchloride, 22 mM magnesiumchloride hexahydraat, 33 mM magnesiumsulfaat heptahydraat, 10 mM calciumchloride dihydraat, 10 mM glucose, 10 mM MOPS.
- Zodra de opgeloste stoffen volledig opgelost, een pH meter om de pH van de oplossing te meten. Voeg langzaam 1 M natriumhydroxide om de pH te verhogen tot een eindwaarde van 7,5. Als u per ongeluk te veel toe te voegen natriumhydroxide, kunt u 1 M zoutzuur om de pH te verlagen.
- Gedestilleerd water toegevoegd tot het uiteindelijke volume is bereikt.
- Om de groei van bacteriën, op te slaan oplossingen vertragen in de koelkast totdat het nodig is voor een experiment. Merk op dat de temperatuur kan Aplysia motorische programma's beïnvloeden. We hebben geen nauwlettend de temperatuur, maar na installatie is voltooid, de voorbereidingen zijn in het algemeen in de buurt kamertemperatuur.
2. Voorbereiding van opname Dish
- Tijdens het experiment zullen de buccale massa worden opgeschort in oplossing ineen rond 100 mm (diameter) x 50 mm (hoogte) Pyrex schaal. Dit gerecht moet een voorkamer voor de buccale massa, een smalle, verhoogde midden platform waar de buccale ganglia is gevestigd op Sylgard, en een aparte, verhoogde achterkamer waar de cerebrale ganglion is geïsoleerd. Een inkeping in de Sylgard moet verbinden de buccale ganglia platform om de cerebrale ganglion kamer. Zie figuur 1, verwijzend naar de opgegeven sleuteldimensies de geconstrueerde schaal.
- Om dit gerecht te maken, te beginnen met een ronde 100 x 50 mm Pyrex schotel. Bereid Sylgard volgens de instructies die bij het product. Constructie van de schaal vereist verschillende giet van Sylgard, waartussen de Sylgard moet kunnen stellen.
- De eerste pour is om het hoogste niveau van Sylgard in de schotel, de wand tussen de buccale en cerebrale kamers (zie figuur 1). Blokkeren dit gedeelte van de schotel van de andere secties. Klei kan worden gebruikt om te bouwenwanden voor het blokkeren van secties. Voor een vlakke wand kan een stuk karton worden gebruikt, met een klei backing. Een gebogen wand (waardoor de grootte van de kamer die de cerebrale ganglion), alleen klei gebruikt als basis voor de wand. Smeer alle muren met plastic omslag, waar ze de Sylgard voor gemakkelijker verwijderen van contact.
- Nadat de ruimte voor de wand tussen de buccale en cerebrale kamers is afgesloten zoals beschreven in punt 2.3, waarbij afdichtingen aan de randen om lekkage te minimaliseren Sylgard giet in deze ruimte bijna naar de top van de schaal. 'S nachts laat de Sylgard set, en zorg ervoor dat deze volledig is ingesteld voordat u verder gaat. Aanbrengen van de schotel in een warme plaats zal induceren een snellere instelling.
- Vervolgens moet de buccale ganglia platform en cerebrale ganglion kamer worden uitgestort (opnieuw, zie figuur 1, waaruit blijkt de locaties van deze ganglia in het voltooide schotel). Verwijder de vorige muren, en maak een nieuwe muur een dihouding 0,5 cm van de vlakke Sylgard wand van het middelste gedeelte te blokkeren uit de buccale ganglia platform. Geen muren nodig om de achterkamer die de cerebrale ganglion houdt maken. Pour Sylgard in beide delen tot een hoogte van ongeveer 3 mm onder het hoogste niveau. De cerebrale kamer moet net iets lager dan de buccale ganglia platform. Nogmaals, laat de Sylgard 's nachts in te stellen.
- Tot slot giet de voorste kamer (dat wil zeggen, de kamer waarin de buccale massa zal worden opgeschort). Geen muren nodig. Giet de juiste hoogte als aangegeven in figuur 1.
- De laatste stap is te snijden een inkeping het aansluiten van de buccale ganglia platform en de cerebrale kamer. De diepte van de uitsparing moet hetzelfde zijn als het niveau van de buccale ganglia platform. Een scalpel kan worden gebruikt om de inkeping. Figuur 1 toont de voltooide schotel.
3. Elektrode Voorbereiding
- Trek extracellulaire electrodes van single-barreled capillair glas met behulp van een Flaming-Brown micropipet trekker. De elektroden binnendiameter moet ongeveer 40 pm en de weerstanden moeten MQ ongeveer 0,1. Met de FT345B gloeidraad in de trekker, onze typische trekker programma-instellingen zijn warmte 480, Pull 50, Vel 13, en tijd 20, maar er rekening mee dat instellingen verschillend zijn voor verschillende filamenten. Het programma legt de elektroden in een pull zonder vuur-polijsten podium. Voordat u begint met een experiment, backfill de extracellulaire elektroden met Aplysia zoutoplossing.
- Maak haak elektroden voor zenuw en spier opname 2 volgens een vergelijkbaar protocol als beschreven door Cullins en Chiel 4, behalve dat afzonderlijke elektroden niet om rond elkaar. De stappen op deze elektroden te creëren volgen 3,3-3,13.
- Snijd een stuk van geëmailleerd, 0,001 inch diameter roestvrij stalen draad met een lengte van ongeveer 60 cm. Bevestig een bal van kleiaan elk uiteinde van de draad houdt de draad in de lucht op zijn middelpunt, en draaien de twee ballen klei rond elkaar om de draden wikkelen elkaar (dit vermindert capacitieve transiënten).
- Tezamen de twee uiteinden van de draad door samenvoegen van de twee ballen klei tot een bal en tape het andere uiteinde van de draad om de draad te schorten.
- Smeer de gehele lengte van de draad in het huishouden siliconen lijm door het plaatsen van een glob van lijm op je duim, het aanraken van je duim en wijsvinger samen op de draad, en actief is ze over de draad. Laat de lijm een nacht drogen.
- Nadat de lijm droogt, plaats de draad op een vlakke ondergrond onder een binoculaire stereomicroscoop. Knip het uiteinde van de draad die eerder het midden, resulterend in twee afzonderlijke draden elkaar gedraaid. Dit is een differentiële elektrode.
- Gebruik tape om een van de uiteinden van de elektrode op zijn plaats houden. Behulp van een tang om strippen lijm en glazuur bereiden beide draden aan een einde ongeveer 2 cm hebben of gratis draad met ongeveer 1 cm van de draad ontdaan van email. Soldeer een gouden pin connector aan elk van de draden en plaats lab tape rond de pinnen te houden gescheiden.
- Aan het andere uiteinde van de elektrode, bereidt de draden tot ongeveer 3 mm vrije draad hebben. Verwijder het glazuur van ongeveer 1 mm van een draad en buig deze draad heen en uit de weg. Dit is de referentie draad. Het is cruciaal dat de twee draden niet hebben blanke draad raken elkaar.
- Verwijder het glazuur van de andere draad tot aan de siliconenlijm. Twist draad in een haak en snijden tot een lengte van ongeveer 1 mm. Deze haak zal hechten aan de zenuw of spier. Met een korte haak een grotere stabiliteit wanneer de zenuw wordt aan de elektrode.
- Gebruik een multimeter om te controleren of de elektrode goed geconstrueerd en intact. Een gouden connector moet een weerstandswaarde van ongeveer 200-500 ohm met betrekking tot de punt van een draad, en de andere verbinding goudof zou een soortgelijke lezing opzichte van de andere draad.
- Als er geen intact aansluiting op een draad, kan het mogelijk opnieuw strippen het einde van de draad opnieuw soldeer een of beide connectors goud deze verbindingen. Als beide vergulde connectoren hebben connecties met beide draden, kan de elektrode twee blanke draden contact maken. Het is mogelijk om het andere uiteinde oplossing voor dit probleem te elimineren, anders de elektrode moet worden weggegooid.
- Herhaal deze procedure zo elektroden nodig voor het experiment. Haak elektroden worden hergebruikt van experiment tot experiment door het afsnijden het uiteinde dat aan de zenuw en nieuwe haken, totdat de draad te kort na vele toepassingen. Elke keer dat dit gebeurt, gebruikt u de multimeter om te controleren of de elektrode intact is.
- Om bij te houden van de verschillende elektroden te houden tijdens experimenten, label elektroden en hun kabels. Met behulp van verschillende kleuren van lab tape is nuttig.
- Kies een gezond dier van ongeveer 200-300 g gewicht. Wanneer gepresenteerd met zeewier, moet het dier te produceren beten met een sterke protractions met regelmatige tussenpozen van 3-5 sec.
- Plaats het dier in een ontleedmicroscoop tray en verdoven door het injecteren van ongeveer 50% lichaamsgewicht isotone magnesiumchlorideoplossing. Maak de eerste injectie met de spuit ongeveer 15 tot 30 graden, in het midden en de richting van de staart van het dier. Na injectie zachtjes masseren het oppervlak van het dier te verspreiden de magnesiumchloride. Tot verdere injecties indien nodig met de spuit richting van de kop van het dier.
- Nadat het dier niet meer reageert op zachte tactiele stimuli, het dier tot pin om de lade, dorsale zijde, met een pin in de staart en een pin in elke voorste tentakel.
- Gebruik een tang om knijpen en het dier de huid te heffen in het midden van het hoofd, achter de rhinophores. Make een coronale incisie over het hoofd van het dier, net achter de punt wordt gehouden. Maak vervolgens een sagittale incisie de toekomst tussen de rhinophores in de richting van de mond, het blootstellen van de buccale massa.
- Tang om de huidflap dichter bij het wegrijden van de buccale massa en door de zenuwen en bindweefsel die hechten aan de lichaamswand deze flap van huid volledig scheiden van de buccale massa gesneden. Zorg ervoor dat er geen zenuwen of weefsel die inherent zijn aan de buccale massa te snijden.
- Gebruik een tang om te grijpen en houd de slokdarm. Knip de slokdarm posterior op het punt te worden gehouden. Trek aan de slokdarm naar de buccale massa te tillen als de volgende sneden worden gemaakt.
- Achter de buccale massa, de cerebrale, pleurale, en pedaal ganglia vormen een ring, met de cerebrale ganglion aan de buccale ganglia van de cerebrale-buccale connectieven (CBC). Laat deze ring ganglia aan de buccale massa en snijd alle zenuwen uitsteekt vanaf deze ganglia naar andere delen vanhet lichaam.
- Knip het bindweefsel rond de buccale massa blijft de buccale massa omhoog omdat het minder met het lichaam. Zodra de buccale massa wordt alleen bevestigd aan de mond, dient de slokdarm en buccale massa recht omhoog worden gehouden.
- Maak een final cut net anterieur van de kaken naar de buccale massa te bevrijden van het lichaam. Plaats de buccale massa in een oplossing van 50% isotone magnesiumchlorideoplossing en 50% Aplysia zoutoplossing om gedeeltelijke verdoving handhaven terwijl elektroden zijn bevestigd.
- Plaats de buccale massa in oplossing, in een petrischaal met Sylgard bodem. Verwijder de pleura en het pedaal ganglia door te snijden hun verbindingen met de cerebrale ganglion. Laat de cerebrale ganglion aan de buccale ganglia en de buccale massa via de cerebrale-buccale connectieven (CBC), verbreken de andere verbindingen tussen de cerebrale ganglion en buccale massa. Knip de slokdarm en speekselklieren te korte lengtes zodat ze niet get in de weg.
5. Hook Elektrode Attachment
- Voor opname en stimulatie, haak elektroden worden bevestigd aan een aantal verschillende zenuwen en spieren, afhankelijk van het experiment (figuur 2).
- Patronen zoals aangetoond in vivo door Cullins en Chiel 4 karakteriseren, hechten de elektroden radular zenuw, de I2 spieren en zenuwen buccale 2 en 3. Samen vormen deze opnames tonen de activiteit van de motorneuronen voor de grote spieren die inherent zijn aan de buccale massa 3,7,8, en laat de identificatie van de protractie fase van het I2-opname 3, de retractiefase van de buccale zenuwen 2 en 3 opnames 2 , 5,8, en de timing van de sluiting van het voedsel grijper van de radular zenuw opname 2. Bevestig een extra haak elektrode tot een van buccale zenuw 2 Branch voor patroon stimulatie. Bevestiging van elektroden volgens een soortgelijke procedure als die DEMONSTRATed. by Cullins en Chiel 4, en wordt beschreven in de volgende stappen.
- Voor elke elektrode bijlage plaats de elektrode op een grove manipulator. Om de manipulator, tape een houten stok met een alligator clip op zijn einde en het gebruik van de clip aan het uiteinde van de elektrode te houden. De clip moet hechten aan de silicone beklede deel van de elektrode ongeveer 1 cm voor het einde van de siliconen. Gebruik de manipulator aan de haak elektrode in de buurt van de buccale massa te plaatsen.
- De buccale massa op zijn kant geplaatst en tegen de zijkant van de schaal voor stabiliteit, beginnen de radular zenuw die het moeilijkst electrode bevestiging geeft. Er zijn twee opties voor het openen van deze zenuw.
- De radular zenuw projecten van onder de buccale ganglion en gaat onder de I2 spier in twee takken. Ten eerste, zien of de radular zenuw kan worden geopend zonder dat de spier. Duw vernietiging van het witte omhulsel het bevestigen van de buccale ganglia naar de I2 spier; do niet snijden deze schede. Als de zenuw toegankelijk is, een tang met de punt gebogen in een hoek op een tak van de zenuw op te heffen.
- Als de radular zenuw niet toegankelijk op deze manier een tweede optie is om de zenuw vinden onder de dunne I2 spier, en een kleine incisie in I2 de zenuw bloot te maken. Deze incisie moet gaan door middel van twee lagen van de spier. Gebruik de haak tang om een tak van de radular zenuw trek van onder de spier.
- Gebruik de manipulator naar de elektrode de haak naast de zenuw te positioneren. De zenuw plaatsen in de haak, is het nuttig om de zenuw houden in de haakvormige forceps tegelijkertijd met een andere tang om de scheiding tussen de twee helften van de zenuw gehouden maken.
- Na de zenuw is veilig in de haak, gebruikt u de manipulator naar de zenuw weg te tillen van de buccale massa totdat het is strak, maar niet te veel uitrekken.
- Neem een Kimwipe en strak draai de ene hoek naar een kleine pit te vormen. Gebruik deze kous samen, zodat de te drogenuiteinde van de elektrode en het deel van zenuw die is vastgehaakt.
- Gebruik een andere set van gebogen-tip een tang om een glob van Quick Gel superlijm van toepassing op de haak zenuw. Begin de applicatie op het punt van contact tussen draad en zenuw. Zorg ervoor dat de haak volledig is bedekt met lijm, en dat de punt van de referentiedraad niet bedekt is met lijm (figuur 3).
- Gebruik een spuit met een polyethyleen buis bevestiging aan oplossing ingang van de schotel op de lijm, waarbij het oppervlak van de lijm in te stellen zal veroorzaken. Zorg ervoor dat de lijm grondig wassen met een oplossing zodat de lijm goed wordt.
- Gebruik de manipulator om de druk op de zenuw ontgrendelen en de elektrode los van de clip. Hiermee is de procedure voor het bevestigen van een haak elektrode.
- De I2 spier elektrode moet vervolgens worden bevestigd. We nemen EMG-activiteit van de I2 spieren, eerder dan ENG activiteit van de innerveren zenuw, omdat de I2 zenuw is zeer small en moeilijk toegankelijk in een intacte buccale massa. Nabij buccale zenuw 2 gebruikt de haakvormige forceps een of twee banden van de I2 spier te heffen en een pincet gebruiken om ze te scheiden van de rest van de spier. Het gedeelte van I2 gescheiden moet gelijk in dikte buccale zenuw 2 of 3. Wees voorzichtig niet te over-gescheiden (dat kan de spier denervate). Bevestig een haak elektrode met dezelfde procedure voor de radular zenuw.
- De volgende elektrode te bevestigen, is dat voor de tak van een van de buccale zenuw 2. Deze tak kan elektrisch worden gestimuleerd om te induceren motorische programma 9. Voordat buccale zenuw 2 gaat onder de I1 spieren aan de laterale groef, de zenuw trifurcates, tak a is de eerste tak af te splitsen. De takken zijn vrij klein, zodat de elektrode bevestiging moet worden gedaan met zorg. Volg dezelfde procedure om de elektrode te bevestigen.
- Buccale zenuwen 2 en 3 zijn gemakkelijk toegankelijk. Volg dezelfde procedure, het bevestigen van de elektroden ongeveer halverwege tussen de buccale ganglion en laterale groef.
- Te kunnen onderscheiden neuronen met unilaterale versus bilaterale projecties is het ook nuttig elektroden buccale zenuwen 2 en 3 bevestigen aan de andere kant van de buccale massa en buccale zenuw 2 tak een, omdat sommige neuronen verschillend reageren op ipsilaterale vs . contralaterale BN2-a stimulatie.
6. Het plaatsen van de Ganglion en dunner de schede
- De buccale massa zal worden verplaatst naar de ronde 100 x 50 mm Pyrex schaal beschreven in hoofdstuk 2. Zie Figuur 1.
- Breng een dun laagje van vacuüm vet aan op de inkeping tussen de cerebrale en buccale kamers, met behulp van een pipet tip om pick-up een glob van vacuüm vet en het verspreid over de inkeping. We hebben gevonden dat vet vacuum minimaliseert lekkage beter dan vaseline. Vul de voorste kamer met Aplysia zoutoplossing. Verplaats voorzichtig de buccale massa van de petrischaal naar voren chamber van deze grotere schotel, ervoor te zorgen dat geen van de elektroden stevig worden getrokken, die kunnen breken de zenuwen.
- Als de schotel moet worden overgedragen aan een andere binoculaire stereomicroscoop voor het verdunnen van de schede, heel voorzichtig zijn met de haak elektroden. Group de elektroden aan een zijde van de buccale massa elkaar en groep de elektroden aan de andere kant van de buccale massa samen. Zorgvuldig Houd de elektroden door het vastgrijpen van de lab tape dat de connectorpinnen dekt, nogmaals ervoor te zorgen dat geen van de elektroden goed zijn getrokken.
- Wanneer de schotel bevindt zich onder de microscoop moet de elektroden voorzichtig gedrapeerd over de wanden van de capsule en rust op het platform naast de schotel.
- Tijdens de pauzes en tussen fasen van het experiment, beluchten de zoutoplossing in de buccale massa kamer met behulp van een aquarium luchtsteen.
- Speld de cerebrale ganglion in de rug met de cerebrale-buccale connectieven (CBC) die door de inkeping. Breng meer vacuum grease over de CBC, dan meer Aplysia zout toe te voegen aan beide delen van de schotel, zodat de ganglia worden volledig ondergedompeld zijn. Waarborgen dat de hoeveelheid toegevoegd vacuüm vet is hoger dan het niveau van zout in zowel de cerebrale of buccale kamers dus geen lekkage tussen de kamers. In dit stadium moet de buccale massa, zodat op de bodem van de voorste kamer, om niet te krachtig trekken aan de zenuwen en ganglia.
- Speld de buccale ganglia op de middelste platform. Om beschadiging van de zenuwen die nog aan de buccale massa alleen plaats kunnen op de huls tussen twee zenuwen. Voeg twee pinnen aan de zijkant van de CBC te rekken en verankeren.
- Houd de buccale ganglia plat of geroteerd op basis van de locatie van de neuronen plaats. Om de buccale ganglion draaien, maken gebruik van fijne tang op enige speling in schede van de CBC te grijpen en speld het naar beneden tussen de buccale zenuwen 2 en 3. Dan de meeste van de cellichamen die nabij de achterkamer en mag niet EASIly vanuit de top van de buccale ganglion te zien. Voeg als laatste twee pennen op de mantel van de buccale ganglion nabij de buccale zijde massa om de beweging van de buccale ganglion minimaliseren. Zie afbeelding 4.
- Gebruik fijne tang om de mantel van de buccale ganglion nabij de achterkamer grijpen en knip het overtollige omhulsel met fijne schaar zonder blootstellen van de cellichamen. Om schade te minimaliseren, verwijderen de hoeveelheid mantel moet de cellichamen zien.
7. Stimulatie en opname
- Na verdunning van het omhulsel is voltooid, sluit u alle elektrodepennen om hun contacten aan de kabels van de versterkers. Nogmaals, zorg ervoor dat de elektroden niet zijn strak getrokken terwijl je dit doet. Zorg ervoor dat de elektroden correct zijn aangesloten op de juiste kabels en dat de polariteiten correct zijn.
- Uit te spoelen eventuele resterende magnesiumchloride, vervang dan de Aplysieen zoutoplossing in de buccale massa kamer met verse Aplysia zoutoplossing.
- Steek een zijden hechtdraad door het zachte weefsel aan de voorzijde van de buccale massa anterodorsal de kaak kraakbeen en gebruik twee stukken klei aan de hechting hechten aan de rand van de schaal, zodat de schorsing buccale massa van het voorste uiteinde. Merk op dat het achterste uiteinde is opgehangen aan de buccale zenuwen aan de buccale ganglia.
- Plaats een manipulator die een glas extracellulaire elektrode zodat de elektrode is bij de buccale ganglion.
- Te lokaliseren en te identificeren van een neuron, gebruikt u de manipulator om voorzichtig op de punt van de extracellulaire elektroden naar beneden op de huls over het neuron soma (Figuur 5). Breng een stimulatiestroom en schakel het kanaal dat wordt gebruikt om de soma wekken de opnamestand om de activiteit opnemen op de extracellulaire elektrode en bijbehorende activiteit op de zenuwen (Figuur 6). Verwijzengepubliceerde ganglion kaarten en neuron beschrijvingen, met inbegrip van zenuw projecties en spieren innervatie, (bijv. 7,8) voor hulp bij het identificeren van neuronen.
- Voor video-opnamen te voeden's achtereenvolgens een spiegel aan de zijkant van de schaal, zodat voor-en zijaanzichten van de buccale massa tegelijkertijd zichtbaar (locatie van de spiegel wordt schematisch weergegeven in figuur 1). Plaats een video-camera met zowel de voor-en zijaanzichten in zijn gezichtsveld.
- Video en elektrofysiologische opnames kunnen worden gesynchroniseerd door het sturen van een TTL-puls zowel een elektronische timer met het oog van de camera en een kanaal in AxoGraph, het computerprogramma wordt gebruikt om op te nemen en te analyseren elektrofysiologische gegevens. Deze puls een tijdstip dat exact hetzelfde in de AxoGraph en video-opnames op basis waarvan de bestanden kunnen worden gesynchroniseerd.
- Nadat een neuron is gevestigd, kan de activiteit worden opgenomen in verschillende dier-achtige gedrag, waarvan ca.n opgewekt worden zoals hieronder beschreven.
- Voor het induceren van afwijzing-achtige motorische programma's, te stimuleren BN2-a met een lange sleep van 2 Hz, 1 ms pulsen 9 (onze ervaring is dat deze stimulatie betrouwbaar egestive patronen genereert in deze setting). Doorzetten voor de duur van de stimulatie en kan doorgaan tot kort na de stimulatie stopt.
- Om bijten-achtige motor programma's 12 induceren, plaats een paar kristallen van vaste carbachol direct op de cerebrale ganglion. Als alternatief, als een gecontroleerd niveau van carbachol blootstelling nodig een oplossing van 1 tot 10 mM carbachol in Aplysia zoutoplossing. Hogere concentraties zijn eerder reacties opleveren. Zich herhalende patronen beginnen meestal binnen 5 minuten en duren ongeveer 10 tot 15 minuten voor het begin te lopen naar beneden.
- Om laten inslikken-achtige motorische programma's 13, toe te passen carbachol, en wacht tot de buccale massa genereert sterke bijt. Dan, tijdens een hapje, plaats een stripzeewier (gedroogd laver) in het dier mond zodat de radula het zeewier (Figuur 7) grijpt. Strips zijn gewoonlijk 0,5 cm breed en 5 cm lang.
- Na de eerste reeks carbachol geïnduceerde patronen, is het vaak mogelijk om extra carbachol reacties. Grondig wassen de Aplysia zoutoplossing in de cerebrale ganglion kamer, verwijderen en vervangen van de zoutoplossing ten minste driemaal. Wacht ten minste 20 minuten vóór het aanbrengen carbachol opnieuw. Wachten tot 40 minuten kan betrouwbaardere resultaten.
Op dit moment in de Verenigde Staten, zijn ongewervelde dieren geen formele goedkeuring van een institutionele dier gebruik en het onderhoud commissie. We hebben echter gezorgd dat alle behandelingen van Aplysia schade te minimaliseren en lijden van het dier, en dat alle secties worden uitgevoerd terwijl het dier volledig verdoofd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerder werk heeft het kenmerk Aplysia motor's in het intacte dier en in gereduceerde preparaten, zoals geïsoleerde ganglia. In het intacte dier, hoewel opnamen van individuele neuronen zijn verkregen 5, dergelijke experimenten zeer moeilijk en elektroden kan worden verplaatst van neuron tot neuron tijdens het voeden. In geïsoleerde ganglia, kan het voeden van bewegingen veroorzaakt door neurale activiteit niet in acht worden genomen. De geschorste buccale massa voorbereiding overbrugt de kloof tussen deze twee uitersten.
Andere semi-preparaten intact in eerdere studies, maar de gesuspendeerde buccale massa preparaat heeft belangrijke voordelen. In een semi-intacte voorbereiding werden de lippen en buccale massa nog steeds verbonden, maar de voorbereiding was te beperkt voor een volledige voeding bewegingen in acht worden genomen 14. Een voeding hoofd voorbereiding 15,16 toegestaan observatie van het voeden van de bewegingen in vitro. Echter, thvoedt hoofd voorbereiding was ingewikkelder op te zetten dan de geschorste buccale massa hier beschreven, en alleen toegang krijgen tot individuele neuronen in de cerebrale ganglion, niet in de buccale ganglion. Er is een voordeel voor de voeding hoofd preparaat, dat de aanwezigheid van de lippen en anterior tentakels kon de generatie bijten patronen door een natuurlijke stimulus, toepassing van zeewier. Hoewel het zou het experiment moeilijker kan het mogelijk zijn de preparaten te combineren, waarbij de lippen aan de buccale massa pinnen tegelijkertijd de buccale ganglia toegang tot individuele neuronen.
Het voeden van patronen in Aplysia kan worden aangemerkt als ingestive of egestive gebaseerd op de timing van de activiteit op de radular zenuw, die het voedsel grijper, ten opzichte van de verlenging en intrekking fasen van motorische programma's sluit. Als radular zenuwactiviteit optreedt op hetzelfde tijdstip als de retractiefase, patronen ingestive, omdat de grijper sluit en terugtrekken als het pogingen om voedsel te trekken in de mondholte. Als radular activiteit van de nervus optreedt tijdens de protractie fase patronen zijn egestive, omdat de grijper sluit en traineerde om materiaal te duwen uit de mondholte 2.
Ingestive patronen kunnen worden onderverdeeld in ten minste twee verschillende subtypen: bijten, probeert te begrijpen voedsel en slikken, transport van reeds begrepen voedingsmiddelen 1,2. Echter, de meeste in vitro werk (bijv. 14,17,18) alleen gericht op de inname / egestion tweedeling, niet proberen te bijten onderscheiden van slikken. Twee studies 16,19 geclassificeerd in vitro ingestive patronen in bijten-achtige en slikken-achtige groepen. In de eerste van deze studies werden de waargenomen patronen in geïsoleerde ganglia, als de bijbehorende voeding bewegingen van de buccale massa kon worden waargenomen, zou het argument versterken dat dese patronen vertegenwoordigen de bijten en slikken gezien in vivo. In het tweede onderzoek werden de waargenomen patronen in een voeding hoofd preparaat, zodat patronen werden ingedeeld op basis van waargenomen bewegingen, maar geen opnamen van buccale ganglion neuronen werden verkregen.
De geschorste buccale massa voorbereiding biedt een manier om alle drie de typen van gedrag te observeren - bijten, slikken, en afwijzing - terwijl gelijktijdig de activiteit van belangrijke buccale zenuwen en spieren, en zowel stimulerend en het opnemen van individuele neuronen. De extracellulaire neuron techniek 6 is een belangrijk voordeel in dit preparaat, omdat de sterke voeding-achtige bewegingen opgewekt vrijwel zeker los een intracellulaire elektrode. Met extracellulaire opnames van individuele neuronen, kan de timing van deze neuronen 'activiteit tijdens motorische programma's worden vastgesteld wanneer dit zou alleen moeilijk met zenuw-opnamen, omdat veel verschillende eenheden zijn fInhuur tegelijkertijd.
We hebben gezien dat het voeden van bewegingen in de geschorste buccale massa lijken kwalitatief vergelijkbaar met die in vivo. Belangrijker stimuli gebruikt bijten en afstoting figuren genereren (carbachol en buccale zenuw 2 branch een stimulatie, respectievelijk) werden gebruikt in preparaten nog kleiner en onze bevinding dat de stimuli fysiologische bewegingen genereren leent geloofwaardigheid hun gebruik in andere omgevingen. Daarentegen is slikken figuren genereren combineerden we een kunstmatige stimulus (carbachol) met een natuurlijk voedsel stimulus (een zeewier strip) die niet kunnen worden toegepast op geïsoleerde ganglia. We hebben ook waargenomen dat de neurale patronen in de gesuspendeerde buccale massa lijken meer op in vivo patronen dan zijn patronen verkregen in meer verminderd preparaten suggereert sensorische feedback van belang kan zijn bij het vormgeven van de patronen van het CPG. Bijvoorbeeld, motorische programma's in geïsoleerde bendelia doorgaans veel langer duurden dan motor's in intacte dieren, terwijl motor programma in de gesuspendeerde buccale massa meestal veel dichter in tijd tot motorische programma in intacte dieren (ongepubliceerde gegevens). Een ander voordeel van de gesuspendeerde buccale massa dat gelijktijdige zij-en vooraanzichten van de voerinrichting worden verkregen. Het vooraanzicht geeft een overeenkomstig aanzicht van de mond die zou worden gezien in vivo, terwijl betere waarneming van de kaak spiercontractie. Het zijaanzicht maakt waarneming van buccale spiercontracties en de voorwaartse en achterwaartse beweging van de grijper onder de spieren, het gemakkelijker te begrijpen biomechanische veranderingen tijdens de verschillende gedragingen.
In dit preparaat, hebben we opgenomen van maximaal vijf zenuwen (radular zenuw en bilaterale buccale zenuwen 2 en 3) en I2 spieren gelijktijdig en geplaatst tot twee extracellulaire elektroden dan geïdentificeerdzenuwcellen in de ganglion. Het is mogelijk om van extra zenuwen en / of spieren, indien gewenst de experimentator. Het zou ook mogelijk stimuleren en opnemen van neuronen in de cerebrale ganglion, die inzicht kunnen geven in de vraag of stimulatie van cerebrale buccale interneuronen, een techniek 17,19, induceert motor soortgelijke programma's in vivo gedrag. Hoewel dit te doen verhoogt de technische moeilijkheid van de voorbereiding, kon perfusie van de buccale slagader 15 kan de voorbereiding tot een sterkere en langduriger gedrag (niet gepubliceerde observaties) te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door NIH subsidie NS047073 en NSF subsidie DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
