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Neuroscience

एक Published: December 5, 2012 doi: 10.3791/4320
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

हम एक तकनीक का वर्णन करने के लिए रिकॉर्ड extracellularly और नसों, मांसपेशियों, और व्यक्तिगत पहचान की न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित

Protocol

1. समाधान की तैयारी

  1. मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान है कि समुद्री जल में पशुओं को रखा जाता है (~ 1,000 millosmolar) isotonic है तैयार, वांछित मात्रा के स्तर पर एक बड़ी सुराही के निशान. इस स्तर के लगभग 80% करने के लिए आसुत जल के साथ जग भरें, और बाहर मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate की उचित मात्रा में वजन करने के लिए एक अंतिम मात्रा में 333 मिमी समाधान बनाने. सुराही मैग्नीशियम क्लोराइड जोड़ें, ढक्कन बंद और सख्ती से हिला तक मैग्नीशियम क्लोराइड पूरी तरह से भंग कर रहा है, और फिर आसुत जल जोड़ने जब तक अंतिम मात्रा तक पहुँच जाता है.
  2. के Aplysia खारा तैयार, फिर वांछित मात्रा के स्तर पर एक बड़ी सुराही के निशान, और आसुत जल के साथ इस स्तर के लगभग 80% को भरने के लिए. हलचल प्लेट पर जग प्लेस, जग में हलचल बार जगह और हलचल प्लेट पर बारी.
  3. एक एक करके, वजन और सुराही के लिए जोड़ने निम्नलिखित पदार्थों की उचित मात्रा में इन चोर बनानेअंतिम मात्रा में centrations: 460 मिमी सोडियम क्लोराइड, 10 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 22 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate, 33 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट heptahydrate, 10 मिमी कैल्शियम क्लोराइड dihydrate, 10 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी MOPS.
  4. एक बार विलेय पूरी तरह से भंग कर रहे हैं, एक पीएच मीटर का उपयोग करने के लिए समाधान के पीएच को मापने. धीरे धीरे 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड जोड़ने के लिए 7.5 की एक अंतिम मूल्य के लिए पीएच बढ़ा. यदि आप गलती से भी ज्यादा सोडियम हाइड्रोक्साइड जोड़ने के लिए, आप 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़ने के लिए पीएच कम कर सकते हैं.
  5. आसुत जल जोड़ें जब तक अंतिम मात्रा तक पहुँच जाता है.
  6. फ्रिज में बैक्टीरियल वृद्धि, दुकान समाधान धीमी जब तक एक प्रयोग के लिए आवश्यक है. ध्यान दें कि तापमान Aplysia मोटर कार्यक्रम को प्रभावित कर सकते हैं. हम सावधानी से तापमान की निगरानी नहीं करते हैं, लेकिन सेटअप के पूरा होने के बाद तैयारी आम तौर पर कमरे के तापमान के निकट हैं.

2. रिकॉर्डिंग डिश तैयार

  1. प्रयोग के दौरान, मुख जन समाधान में निलंबित कर दिया जाएगाएक दौर 100 (व्यास) मिमी x 50 मिमी (ऊंचाई) Pyrex पकवान. यह पकवान मुख जन, एक संकीर्ण, ऊंचा बीच मंच है जहां मुख ganglia Sylgard पर टिकी हैं, और एक अलग, ऊंचा वापस कक्ष जहां मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि अलग है के लिए एक सामने कक्ष होना चाहिए. Sylgard में एक पायदान मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि कक्ष मुख ganglia मंच कनेक्ट होना चाहिए. 1 आंकड़ा देखें, निर्दिष्ट प्रमुख आयाम बात जब पकवान के निर्माण.
  2. इस पकवान बनाने के लिए, एक दौर 100 x 50 मिमी Pyrex पकवान के साथ शुरू करते हैं. Sylgard तैयार उत्पाद के साथ दिए गए निर्देश के बाद. पकवान के निर्माण की आवश्यकता होगी Sylgard के कई pours, जिसके बीच में Sylgard सेट करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए.
  3. 1 डालना डिश में Sylgard के उच्चतम स्तर, मुख और मस्तिष्क कक्षों (आकृति 1 देखें) के बीच में दीवार बनाने के लिए है. अन्य वर्गों से पकवान के इस हिस्से को ब्लॉक. क्ले मॉडलिंग का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैबंद वर्गों को रोकने के लिए दीवारों. एक फ्लैट की दीवार के लिए गत्ते का एक टुकड़ा एक क्ले मॉडलिंग समर्थन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. एक घुमावदार दीवार (जो मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि युक्त कक्ष के आकार को कम कर देता है) के लिए, क्ले मॉडलिंग अकेले दीवार के लिए आधार के रूप में उपयोग. कोट प्लास्टिक की चादर के साथ सभी दीवारों जहां वे आसानी से हटाने के लिए Sylgard संपर्क करेंगे.
  4. एक बार मुख और मस्तिष्क कक्षों के बीच की दीवार के लिए अंतरिक्ष से अवरुद्ध कर दिया गया के रूप में 2.3 में वर्णित है, किनारों पर तंग जवानों को सुनिश्चित करने के लिए रिसाव को कम करने के लिए, इस अंतरिक्ष में Sylgard लगभग पकवान के शीर्ष पर डालना. Sylgard सेट रातोंरात चलो, और यकीन है कि यह पूरी तरह से जारी रखने से पहले सेट कर दिया जाता है. एक गर्म स्थान में पकवान लाना तेजी से स्थापित प्रेरित करेगा.
  5. अगला, मुख ganglia मंच और मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि चैम्बर (फिर से, 1 चित्रा, जो पूरा डिश में इन ganglia के स्थानों से पता चलता है देखें) डाला जाना चाहिए. पिछले अवरुद्ध दीवारों निकालें और एक नई दीवार बनाने के लिए एक diमध्य अनुभाग के लिए रवाना मुख ganglia मंच ब्लॉक के फ्लैट Sylgard दीवार से 0.5 सेमी रुख. कोई दीवारों वापस कक्ष जो मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि पकड़ बनाने के लिए आवश्यक हैं. Sylgard दोनों वर्गों में शीर्ष स्तर से नीचे के बारे में 3 मिमी की ऊंचाई डालो. मस्तिष्क कक्ष बस थोड़ा मुख ganglia मंच की तुलना में कम होना चाहिए. फिर, Sylgard रातोंरात सेट.
  6. अन्त में, सामने कक्ष (यानी, कक्ष में जो मुख जन निलंबित कर दिया जाएगा) डालना. कोई दीवारें आवश्यक हैं. चित्रा 1 में निर्दिष्ट के रूप में उपयुक्त ऊंचाई डालो.
  7. अंतिम चरण के लिए एक पायदान मुख ganglia मंच और मस्तिष्क कक्ष को जोड़ने में कटौती करने के लिए है. निशान की गहराई मुख ganglia मंच के स्तर के रूप में ही किया जाना चाहिए. एक स्केलपेल ब्लेड पायदान में कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चित्रा 1 पूरा पकवान दिखाता है.

3. इलेक्ट्रोड तैयारी

  1. ई खींचो कोशिकीएकल बैरल केशिका गिलास का उपयोग कर एक ज्वलंत ब्राउन micropipette डांड़ी से lectrodes. इलेक्ट्रोड आंतरिक diameters के बारे में 40 सुक्ष्ममापी हो और उनके resistances के बारे में 0.1 MΩ होना चाहिए. डांड़ी में FT345B रेशा के साथ, हमारे ठेठ डांड़ी कार्यक्रम सेटिंग्स 480 हीट, 50 खींचो, वेल 13, और 20 समय कर रहे हैं, लेकिन कृपया ध्यान दें कि सेटिंग filaments के लिए अलग अलग हो जाएगा. इस कार्यक्रम के एक एकल खींचने में कोई मंच आग चमकाने के साथ इलेक्ट्रोड बनाता है. शुरू करने से पहले एक प्रयोग है, backfill Aplysia खारा के साथ बाह्य इलेक्ट्रोड.
  2. तंत्रिका और मांसपेशी रिकॉर्डिंग के लिए हुक इलेक्ट्रोड बनाएँ 2 Cullins और Chiel 4 द्वारा वर्णित है कि एक समान प्रोटोकॉल के बाद, सिवाय इसके कि व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड एक दूसरे के चारों ओर लिपटा होना जरूरी नहीं है. इन इलेक्ट्रोड बनाने के लिए कदम 3.3-3.13 में पालन करें.
  3. तामचीनी लेपित 0.001 इंच व्यास स्टेनलेस स्टील के बारे में 60 सेमी की लंबाई के लिए तार का एक टुकड़ा काट. क्ले मॉडलिंग की एक गेंद को संलग्नतार के प्रत्येक के अंत के लिए, तार पकड़ हवा में अपनी मध्य बिंदु पर, और एक दूसरे के आसपास मिट्टी के दो गेंदों को स्पिन करने के लिए एक दूसरे के आसपास तार लपेटो (इस capacitative यात्रियों को कम कर देता है).
  4. एक गेंद, और टेप करने के लिए तार स्थगित तार के दूसरे छोर में मिट्टी के दो गेंदों में शामिल होने से तार के दो सिरों को एक साथ पकड़.
  5. अपने अंगूठे पर गोंद का एक glob रखने, अपने अंगूठे और तर्जनी के तार पर एक साथ को छू, और उन्हें तार पर चल रहे घरेलू सिलिकॉन गोंद में तार की पूरी लंबाई के कोट. चलो गोंद रातोंरात सूखी.
  6. गोंद dries के बाद, एक सपाट सतह पर एक द्विनेत्री विदारक माइक्रोस्कोप के तहत तार जगह. तार कि पहले बीच था, दो अलग - अलग एक साथ मुड़ तारों में जिसके परिणामस्वरूप के अंत काटो. यह एक अंतर इलेक्ट्रोड है.
  7. टेप का उपयोग करने के लिए एक जगह में इलेक्ट्रोड के छोर की पकड़. संदंश का उपयोग करने के लिए गोंद और तामचीनी पट्टी, एक अंत में दोनों तारों को तैयार करने के लिए लगभग 2 सेमी ओच तामचीनी की छीन तार के बारे में 1 सेमी के साथ मुक्त तार. मिलाप तारों के प्रत्येक के लिए एक सोने संबंधक पिन, और पिन के आसपास जगह प्रयोगशाला टेप रखने के लिए उन्हें अलग.
  8. इलेक्ट्रोड के दूसरे छोर पर, तारों के बारे में मुफ्त तार के 3 मिमी के लिए तैयार है. एक तार के पिछले लगभग 1 मिमी से तामचीनी निकालें, और इस तार वापस मोड़ और बाहर का रास्ता. इस संदर्भ तार है. यह महत्वपूर्ण है कि दो तारों के नंगे तार एक दूसरे को छू नहीं है.
  9. अन्य तार से तामचीनी सिलिकॉन गोंद के लिए सभी तरह से निकालें. एक हुक में इस तार ट्विस्ट और यह बारे में 1 मिमी की लंबाई में कटौती. यह हुक तंत्रिका या मांसपेशी को जोड़ना होगा. एक छोटी हुक का प्रयोग अधिक से अधिक स्थिरता प्रदान करता है जब तंत्रिका इलेक्ट्रोड के लिए किया जा रहा है जुड़ा हुआ है.
  10. एक मल्टीमीटर का उपयोग करने के लिए सत्यापित करें कि इलेक्ट्रोड ठीक से निर्माण किया है और बरकरार. एक सोने की एक तार की नोक के लिए सम्मान के साथ लगभग 200-500 ohms के प्रतिरोध पढ़ने संबंधक होना चाहिए, और अन्य स्वर्ण कनेक्टया इसी तरह की अन्य तार के सापेक्ष पढ़ने चाहिए.
  11. अगर वहाँ एक तार पर एक अक्षुण्ण संबंध नहीं है, यह संभव हो सकता है फिर से पट्टी तार के अंत करने के लिए और फिर से मिलाप एक या दोनों सोने connectors इन कनेक्शन बनाने के लिए हो सकता है. यदि दोनों सोने connectors दोनों तारों के साथ कनेक्शन है, इलेक्ट्रोड दो नंगे तारों संपर्क कर सकते हैं. यह संभव है कि इस समस्या को खत्म करने के लिए दूसरे छोर को ठीक हो सकता है, अन्यथा, इलेक्ट्रोड खारिज किया जाना चाहिए.
  12. के रूप में कई इलेक्ट्रोड के रूप में प्रयोग के लिए आवश्यक हैं के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. हुक इलेक्ट्रोड जा सकता है अंत कि तंत्रिका से जुड़ा हुआ है में कटौती और नए हुक बनाने, जब तक तार कई का उपयोग करता है के बाद भी कम हो जाता है के द्वारा प्रयोग करने के लिए प्रयोग से फिर से इस्तेमाल किया. हर बार यह किया है, मल्टीमीटर का उपयोग करने के लिए सत्यापित करें कि इलेक्ट्रोड बरकरार है.
  13. प्रयोगों, लेबल इलेक्ट्रोड और उनके केबलों के दौरान विभिन्न इलेक्ट्रोड का ट्रैक रखने. प्रयोगशाला टेप के विभिन्न रंगों का प्रयोग उपयोगी है.

  1. 200-300 के बारे में छ वजन के एक स्वस्थ पशु चुनें. जब समुद्री शैवाल के साथ प्रस्तुत किया है, जानवर 3-5 सेकंड के नियमित अंतराल पर मजबूत protractions के साथ काटने का उत्पादन करना चाहिए.
  2. पशु को एक विदारक ट्रे में रखें और 50% शरीर के वजन isotonic मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान के बारे में इंजेक्शन द्वारा anesthetize. एक के बारे में 15 से 30 डिग्री के कोण पर सिरिंज के साथ 1 मध्यम निकट और जानवर की पूंछ की ओर इशारा करते हुए, इंजेक्शन. इंजेक्शन के बाद, धीरे पशु की सतह मैग्नीशियम क्लोराइड फैल मालिश. अतिरिक्त इंजेक्शन के रूप में जानवर के सिर की ओर इशारा करते हुए सिरिंज के साथ की जरूरत है.
  3. बाद जानवर कोमल स्पर्श उत्तेजनाओं के लिए प्रत्युत्तर देना बंद कर देता है, ट्रे, पृष्ठीय पक्ष पशु पूंछ में एक पिन और प्रत्येक पूर्वकाल मूंछ में एक पिन के साथ, पिन.
  4. चुटकी और सिर के बीच में पशुओं की त्वचा उठा rhinophores पीछे संदंश का प्रयोग करें. एमake पशु सिर के पार बिंदु आयोजित किया जा रहा है एक राज्याभिषेक बस के पीछे, चीरा. फिर एक midsagittal मुँह की ओर rhinophores के बीच में आगे जा रहा चीरा बनाने के लिए, मुख जन को उजागर.
  5. संदंश का प्रयोग करने के लिए आप के करीब त्वचा के प्रालंब मुख जन से दूर खींच और नसों और संयोजी ऊतक है कि शरीर की दीवार के लिए संलग्न करने के लिए पूरी तरह से मुख जन से त्वचा की इस प्रालंब अलग के माध्यम से कटौती. किसी भी नसों या मुख बड़े पैमाने पर करने के लिए आंतरिक ऊतक में कटौती नहीं करने के लिए सुनिश्चित हो.
  6. संदंश प्रयोग हड़पने के लिए और घुटकी पकड़. घेघा पश्च के माध्यम से बात करने के लिए आयोजित किया जा रहा काटें. घेघा पर खींचो मुख जन उठाने के रूप में निम्नलिखित कटौती बना रहे हैं.
  7. मुख जन के पीछे, फुफ्फुस, मस्तिष्क और पेडल ganglia फार्म एक अंगूठी मस्तिष्क मस्तिष्क मुख connectives (CBCs) मुख ganglia जुड़ी नाड़ीग्रन्थि साथ,. इन रिंग मुख जन से जुड़ी ganglia छोड़ दो, और सभी के अन्य भागों में इन ganglia से पेश नसों में कटौतीशरीर.
  8. मुख मास के आसपास के सभी संयोजी ऊतक के माध्यम से काटें, जारी रखने के लिए मुख जन उठा के रूप में इसे कम शरीर से जुड़ा हो जाता है. एक बार मुख जन ही मुँह में संलग्न है, घेघा और मुख जन सीधे ऊपर आयोजित किया जाना चाहिए.
  9. बस एक अंतिम जबड़े के लिए पूर्वकाल में कटौती करने के लिए शरीर से मुख जन मुक्त बनाओ. 50% isotonic मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान और 50% Aplysia खारा के समाधान में मुख जन प्लेस क्रम में आंशिक anesthetization बनाए रखने के जब इलेक्ट्रोड संलग्न हैं.
  10. मुख जन रखें, समाधान के साथ Sylgard नीचे के साथ एक पेट्री डिश में. फुफ्फुस और पेडल ganglia मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि उनके कनेक्शन काटने से निकालें. मस्तिष्क मुखी और मस्तिष्क मुख connectives (CBCs) के माध्यम से मुख जन ganglia जुड़ी नाड़ीग्रन्थि छोड़ दो, मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि और मुख जन के बीच अन्य कनेक्शन (सम्बन्ध) विच्छेद करना. घुटकी और कम लंबाई लार ग्रंथियों छाँटो तो वे जी नहीं करतेएट रास्ते में.

5. हुक इलेक्ट्रोड अनुलग्नक

  1. रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए, हुक इलेक्ट्रोड विभिन्न नसों और मांसपेशियों के एक नंबर के लिए संलग्न किया जा सकता है के रूप में प्रयोग के लिए उपयुक्त (2 चित्रा),.
  2. पैटर्न Cullins और Chiel 4 vivo में प्रदर्शन विशेषताएँ, तंत्रिका radular के लिए इलेक्ट्रोड, I2 मांसपेशी, और मुख नसों 2 और 3 देते हैं. साथ में, इन रिकॉर्डिंग प्रमुख मुख 3,7,8 बड़े पैमाने पर करने के लिए आंतरिक मांसपेशियों के लिए मोटर न्यूरॉन्स की गतिविधियों को दिखाने के लिए, और I2 रिकॉर्डिंग 3, मुख तंत्रिकाओं से त्याग चरण 2 और 3 2 रिकॉर्डिंग से व्याक्षेप चरण की पहचान की अनुमति , 5,8, और भोजन radular तंत्रिका रिकॉर्डिंग 2 से grasper के बंद होने का समय है. एक अतिरिक्त हुक इलेक्ट्रोड संलग्न पैटर्न उत्तेजना के लिए मुख तंत्रिका 2 की एक शाखा है. इलेक्ट्रोड के अनुलग्नक कि demonstrat के समान प्रक्रिया का पालनCullins और Chiel 4 एड, और निम्न चरणों में वर्णित है.
  3. प्रत्येक इलेक्ट्रोड लगाव के लिए, एक मोटे मैनिप्युलेटर पर इलेक्ट्रोड जगह. मैनिप्युलेटर करने के लिए, अपने अंत पर एक मगरमच्छ क्लिप के साथ एक लकड़ी की छड़ी टेप और क्लिप का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रोड के अंत पकड़. क्लिप सिलिकॉन कोटिंग के अंत से पहले के बारे में 1 सेमी सिलिकॉन लेपित इलेक्ट्रोड के अनुभाग संलग्न करना चाहिए. मैनिप्युलेटर का उपयोग करने के लिए मुख जन के पास हुक इलेक्ट्रोड की स्थिति.
  4. अपने पक्ष पर मुख जन और स्थिरता के लिए पकवान के पक्ष के खिलाफ रखा, radular तंत्रिका है, जो सबसे मुश्किल इलेक्ट्रोड लगाव प्रस्तुत साथ शुरू करते हैं. यह तंत्रिका तक पहुँचने के लिए दो विकल्प हैं.
  5. मुख नाड़ीग्रन्थि के नीचे से radular तंत्रिका परियोजनाओं और दो शाखाओं में I2 मांसपेशियों के नीचे चला जाता है. सबसे पहले देखते हैं, कि radular तंत्रिका मांसपेशियों के काटने के बिना पहुँचा जा सकता है. घ, धीरे तरफ सफेद I2 मांसपेशी मुख ganglia संलग्न म्यान धक्काओ इस म्यान काटने के लिए नहीं. अगर तंत्रिका पहुँचा जा सकता है, एक हुक में टिप तुला के साथ संदंश तंत्रिका की एक शाखा लिफ्ट का उपयोग करें.
  6. यदि radular तंत्रिका इस तरह से सुलभ नहीं है, एक दूसरा विकल्प पतली I2 मांसपेशी नीचे तंत्रिका का पता लगाने, और I2 में एक छोटा सा चीरा के लिए तंत्रिका बेनकाब करना है. इस चीरा मांसपेशियों की दो परतों के माध्यम से जाना चाहिए. कांटे की शकल संदंश प्रयोग radular तंत्रिका की एक शाखा मांसपेशियों के नीचे से बाहर खींच.
  7. मैनिप्युलेटर का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रोड के तंत्रिका करने के लिए अगले हुक स्थिति. हुक में तंत्रिका जगह, यह मददगार है जबकि एक साथ संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करने के लिए आयोजित किया जा रहा तंत्रिका के दो हिस्सों के बीच अलगाव पैदा करने के लिए कांटे की शकल संदंश में तंत्रिका पकड़.
  8. बाद तंत्रिका हुक में सुरक्षित है, मैनिप्युलेटर उपयोग के लिए तंत्रिका मुख जन से दूर जब तक यह तना हुआ है उठा, लेकिन overstretch नहीं है.
  9. एक Kimwipe लो और कसकर एक कोने के लिए एक छोटे से बाती फार्म मोड़. इस बाती का प्रयोग करने के लिए सूखीइलेक्ट्रोड के अंत और तंत्रिका की धारा है कि कांटे की शकल है.
  10. घुमावदार टिप संदंश के दूसरे सेट का प्रयोग करने के लिए कांटे की शकल तंत्रिका को त्वरित जेल सुपर गोंद का एक glob लागू. तार और तंत्रिका के बीच संपर्क के बिंदु पर आवेदन शुरू. सुनिश्चित करें कि हुक गोंद के साथ पूरी तरह से कवर किया जाता है, और कि संदर्भ तार की नोक गोंद (चित्रा 3) के साथ शामिल नहीं है.
  11. एक polyethylene टयूबिंग गोंद पर डिश है, जो करने के लिए सेट गोंद की सतह को प्रेरित करेगा से समाधान लागू अनुलग्नक के साथ एक सिरिंज का प्रयोग करें. समाधान के साथ अच्छी तरह से गोंद स्नान करने के लिए सुनिश्चित करें कि गोंद ठीक से सेट कर लें.
  12. मैनिप्युलेटर प्रयोग तंत्रिका पर तनाव जारी है, और तब क्लिप से इलेक्ट्रोड जारी. यह एक हुक इलेक्ट्रोड संलग्न करने की प्रक्रिया पूरी होती है.
  13. I2 मांसपेशी इलेक्ट्रोड अगले संलग्न होना चाहिए. हम I2 बजाय अपने innervating तंत्रिका से इंग्लैंड गतिविधि मांसपेशियों से EMG गतिविधि रिकॉर्ड है क्योंकि I2 तंत्रिका बहुत smaकरूँगा और एक अक्षुण्ण मुख मास में उपयोग करने के लिए मुश्किल है. मुख 2 तंत्रिका के पास का उपयोग करने के लिए कांटे की शकल संदंश I2 की मांसपेशी के एक या दो बैंड उठा, और संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करने में मदद उन्हें पेशी के बाकी से अलग है. I2 अलग भाग मुख तंत्रिका 2 या 3 मोटाई समान होना चाहिए. खत्म नहीं अलग (जो मांसपेशियों वितंत्रीकरण करना हो सकता है) सावधान रहो. संलग्न ही radular तंत्रिका के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया के साथ एक हुक इलेक्ट्रोड.
  14. अगले करने के लिए देते हैं इलेक्ट्रोड है कि मुख 2 तंत्रिका की एक शाखा के लिए. यह शाखा विद्युत मोटर कार्यक्रमों 9 प्रेरित करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं. इससे पहले मुख 2 तंत्रिका पार्श्व नाली में I1 मांसपेशी के नीचे चला जाता है, तंत्रिका trifurcates, शाखा के लिए पहली बार एक शाखा के लिए रवाना विभाजित है. शाखाओं काफी छोटे हैं, तो इलेक्ट्रोड लगाव देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. उसी प्रक्रिया का पालन करने के लिए इलेक्ट्रोड देते हैं.
  15. मुख 2 और 3 नसों आसानी से पहुँचा रहे हैं. उसी प्रक्रिया का पालन करने के लिए, चुनाव संलग्नमुख नाड़ीग्रन्थि और पार्श्व नाली के बीच लगभग आधे रास्ते trodes.
  16. न्यूरॉन्स एकतरफा बनाम द्विपक्षीय अनुमानों के साथ भेद करने में मदद करने के लिए, यह भी उपयोगी है मुख जन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मुख तंत्रिका 2 शाखा एक के दूसरे पक्ष पर मुख नसों इलेक्ट्रोड 2 और 3 देते हैं, क्योंकि कुछ न्यूरॉन्स ipsilateral बनाम अलग प्रतिक्रिया . contralateral BN2 एक उत्तेजना.

6. नाड़ीग्रन्थि पोजिशनिंग और म्यान Thinning

  1. मुख जन दौर 100 x 50 मिमी Pyrex पकवान खंड 2 में वर्णित करने के लिए ले जाया जाएगा. चित्रा 1 देखें.
  2. मस्तिष्क और मुख कक्षों के बीच पायदान वैक्यूम तेल की एक पतली परत लागू, एक pipet टिप का उपयोग करने के लिए वैक्यूम तेल के एक glob लेने और यह पायदान पर फैला. हमने पाया है कि वैक्यूम तेल रिसाव वेसिलीन से बेहतर कम से कम. Aplysia खारा के साथ सामने चैम्बर भरें. ध्यान पेट्री डिश से सामने chamb मुख जन चालयह बड़ा पकवान के एर, यकीन है कि इलेक्ट्रोड का कोई भी कसकर खींच रहे हैं, जो तंत्रिकाओं को तोड़ सकता है.
  3. यदि पकवान म्यान thinning के लिए एक और द्विनेत्री विदारक माइक्रोस्कोप के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए, हुक इलेक्ट्रोड के साथ बहुत सावधान रहना. समूह मुख द्रव्यमान का एक पक्ष पर एक साथ इलेक्ट्रोड, और भी मुख द्रव्यमान का एक साथ दूसरे पक्ष पर इलेक्ट्रोड समूह. ध्यान से प्रयोगशाला टेप है कि संबंधक पिन शामिल लोभी द्वारा इलेक्ट्रोड पकड़, फिर यकीन है कि इलेक्ट्रोड का कोई भी कसकर खींच रहे हैं.
  4. जब पकवान खुर्दबीन के नीचे तैनात है, इलेक्ट्रोड पकवान और पकवान के बगल में मंच पर बाकी के पक्षों पर धीरे लिपटी चाहिए.
  5. ब्रेक के दौरान और प्रयोग के चरणों के बीच, मुख जन एक मछलीघर airstone का उपयोग कर कक्ष में खारा aerate.
  6. मस्तिष्क मुख (CBCs) connectives पायदान के माध्यम से चल रहा है के साथ वापस में मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि पिन. अधिक निर्वात जी लागूCBCs से अधिक rease, तो पकवान के दोनों भागों के लिए और अधिक Aplysia खारा जोड़ने तो, ganglia पूरी तरह से डूबे हुए हैं. सुनिश्चित करें कि वैक्यूम जोडी तेल की मात्रा भी मस्तिष्क या मुख कक्षों में खारा के स्तर की तुलना में अधिक है, इसलिए कोई रिसाव कक्षों के बीच होता है. इस स्तर पर, मुख जन तो सामने चैम्बर के नीचे पर आराम के रूप में नसों और ganglia पर खींचने के लिए भी जबरदस्ती चाहिए.
  7. मध्य मंच पर मुख ganglia पिन. नसों कि अभी भी मुख जन से जुड़े होते हैं हानिकारक से बचने के लिए, केवल दो नसों के बीच म्यान पर पिन जगह. CBCs के पक्ष पर दो और पिंस जोड़ें खिंचाव और उन्हें लंगर.
  8. मुख ganglia फ्लैट या ब्याज के न्यूरॉन्स के स्थान के आधार पर घुमाया रखें. मुख नाड़ीग्रन्थि घुमाने, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए सीबीसी के कुछ अतिरिक्त म्यान हड़पने और यह नीचे पिन मुख नसों के बीच 2 और 3. फिर सेल निकायों कि वापस चैम्बर के लिए आसन्न हैं और easi नहीं किया जा सकता है की सबसेमुख नाड़ीग्रन्थि के ऊपर से पहुँचा ly देखा जा सकता है. अन्त में, मुख मुख जन की ओर करने के लिए आसन्न नाड़ीग्रन्थि मुख नाड़ीग्रन्थि के आंदोलन को कम करने की म्यान पर दो पिनों जोड़ने. चित्रा 4 देखें.
  9. ठीक संदंश प्रयोग मुख वापस चैम्बर के लिए आसन्न नाड़ीग्रन्थि की म्यान हड़पने, और फिर दूर सेल निकायों को प्रकाश में लाने के बिना ठीक कैंची के साथ अतिरिक्त म्यान में कटौती. आदेश में क्षति को कम से कम करने के लिए, केवल म्यान के सेल शरीर को देखने के लिए आवश्यक राशि को हटा दें.

7. उत्तेजना और रिकॉर्डिंग

  1. म्यान पूरा हो गया है के thinning के बाद, उनके केबलों कि एम्पलीफायरों कनेक्ट पर कुर्सियां ​​इलेक्ट्रोड पिंस देते हैं. फिर, यकीन है कि इलेक्ट्रोड कसकर नहीं खींच लिया, जबकि यह कर रहे हैं. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड सही ढंग से उनके उपयुक्त केबल जुड़े होते हैं और छोर सही है कि.
  2. किसी भी शेष मैग्नीशियम क्लोराइड धोने की जगह Aplysiमुख ताजा Aplysia नमक के साथ जन कक्ष में खारा.
  3. मुख जन, anterodorsal के जबड़े कार्टिलेज को मोर्चे पर नरम ऊतकों के माध्यम से एक रेशम सिवनी धागे, और क्ले मॉडलिंग के दो टुकड़े का उपयोग करने के लिए पकवान के किनारे करने के लिए सीवन देते हैं, इस प्रकार अपने पूर्वकाल अंत से मुख जन निलंबित. ध्यान दें कि पीछे के अंत मुख मुख ganglia जुड़ी नसों द्वारा निलंबित कर दिया गया है.
  4. एक गिलास कोशिकी इलेक्ट्रोड पकड़ इतना है कि इलेक्ट्रोड टिप मुख नाड़ीग्रन्थि पास है मैनिप्युलेटर स्थिति.
  5. पता लगाने और एक न्यूरॉन की पहचान, मैनिप्युलेटर का उपयोग करने के लिए धीरे बाह्य इलेक्ट्रोड की टिप न्यूरॉन सोमा (5 चित्रा) से अधिक म्यान पर नीचे प्रेस. एक उत्तेजक वर्तमान लागू करें, और फिर चैनल है कि रिकॉर्डिंग मोड सोमा उत्तेजित क्रम में कोशिकी इलेक्ट्रोड और नसों पर इसी गतिविधि (6 चित्रा) पर गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है स्विच. संदर्भ लेंप्रकाशित नाड़ीग्रन्थि नक्शे और तंत्रिका न्यूरॉन्स की पहचान करने में मदद के लिए और अनुमानों मांसपेशी innervations (7,8 उदाहरण के लिए) सहित न्यूरॉन वर्णन.
  6. खिला कार्यक्रमों, स्थिति पकवान की ओर है तो मुख द्रव्यमान का है कि सामने और साइड विचारों को एक साथ देखा जा सकता है (दर्पण के स्थान schematically चित्र 1 में दिखाया है) पर एक दर्पण की वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए दोनों के सामने और देखने के अपने क्षेत्र में दृश्य के साथ एक वीडियो कैमरा की स्थिति.
  7. वीडियो और electrophysiological रिकॉर्डिंग दोनों कैमरे के दृश्य में एक इलेक्ट्रॉनिक टाइमर और AxoGraph, कंप्यूटर रिकॉर्ड और electrophysiological डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता कार्यक्रम में एक चैनल के लिए एक टीटीएल पल्स भेजकर सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है. यह नाड़ी एक समय मुद्दा यह है कि बिल्कुल वैसा ही है जो फ़ाइलों पर सिंक्रनाइज़ किया जा सकता AxoGraph और वीडियो रिकॉर्डिंग में आधारित है, प्रदान करता है.
  8. के बाद एक न्यूरॉन स्थित है, अपनी गतिविधि अलग खिला की तरह व्यवहार है, जो ca में दर्ज किया जा सकता हैn हासिल हो जैसा कि नीचे वर्णित है.
  9. करने के लिए प्रेरित अस्वीकृति की तरह मोटर कार्यक्रमों को प्रोत्साहित करने के लिए, BN2 हर्ट्ज 2 मिसे 1, 9 दालों (हमारा अनुभव है कि इस उत्तेजना को मज़बूती से इस सेटिंग में egestive पैटर्न उत्पन्न) के एक लंबे समय ट्रेन के साथ. पैटर्न उत्तेजना की अवधि के लिए जारी रखने के लिए और बाद शीघ्र ही उत्तेजना समाप्त होता है जब तक जारी रख सकते हैं.
  10. काट की तरह मोटर 12 कार्यक्रमों को प्रेरित करने के लिए, प्रमस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि पर सीधे ठोस carbachol की कुछ क्रिस्टल की जगह है. वैकल्पिक रूप से, अगर carbachol जोखिम के नियंत्रित स्तर आवश्यक है, 1 और 10 के बीच में मिमी carbachol Aplysia खारा के समाधान का उपयोग करें. उच्च सांद्रता अधिक प्रतिक्रियाओं उपज की संभावना हैं. दोहराए पैटर्न आम तौर पर 5 मिनट, और नीचे से चलाने के शुरू होने से पहले लगभग 10 से 15 मिनट के लिए पिछले के भीतर शुरू करते हैं.
  11. करने के लिए प्रेरित निगलने की तरह मोटर 13 कार्यक्रमों, carbachol लागू करने के लिए, और मुख जन तक इंतजार मजबूत के काटने उत्पन्न. फिर, एक काटने के दौरान एक पट्टी जगहसमुद्री शैवाल के (सूखे लेवर) इतना है कि radula समुद्री शैवाल (7 चित्रा) grasps पशु के मुंह में. कफन आमतौर पर लंबाई में 5 सेमी तक 0.5 सेमी चौड़ा कर रहे हैं.
  12. 1 carbachol प्रेरित पैटर्न की श्रृंखला के बाद, यह अक्सर अतिरिक्त carbachol प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए संभव है. अच्छी तरह से बाहर मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि कक्ष में Aplysia खारा धोने, हटाने और नमक की जगह कम से कम तीन बार. Carbachol फिर से लागू करने से पहले कम से कम 20 मिनट रुको. 40 मिनट के लिए प्रतीक्षा की जा रही है और अधिक विश्वसनीय परिणाम हो सकता है.

संयुक्त राज्य अमेरिका में इस समय पशुओं invertebrate एक संस्थागत पशु का उपयोग करें और देखभाल समिति द्वारा औपचारिक मंजूरी की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, हम यह सुनिश्चित किया है कि Aplysia के सभी उपचार के नुकसान को कम करने के लिए और जानवर को दुख है, और सभी dissections जबकि जानवर पूरी तरह anesthetized है कर रहे हैं कि.

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Discussion

पिछले काम बरकरार जानवर में और अलग ganglia के रूप में इस तरह के कम तैयारी, में Aplysia मोटर कार्यक्रम की विशेषता है. बरकरार जानवर में, हालांकि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग 5 प्राप्त किया गया है, इस तरह के प्रयोगों बहुत मुश्किल है, और इलेक्ट्रोड न्यूरॉन से भोजन के दौरान न्यूरॉन को स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है. पृथक ganglia में खिला तंत्रिका गतिविधि से प्रेरित आंदोलनों को देखा नहीं जा सकता. निलंबित मुख जन तैयारी इन दो छोरों के बीच के अंतर को पुल.

अन्य अर्द्ध बरकरार तैयारी पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन निलंबित मुख जन तैयारी महत्वपूर्ण लाभ है. एक तैयारी अर्द्ध बरकरार, होंठ और मुख जन अभी भी जुड़े थे लेकिन तैयारी पूर्ण खिला आंदोलनों के लिए बहुत कम हो गया था 14 मनाया जा. एक खिला सिर तैयारी 15,16 इन विट्रो में आंदोलनों को खिलाने की अनुमति दी अवलोकन. हालांकि वें,सिर तैयारी खिला अधिक जटिल की तुलना में स्थापित करने के लिए निलंबित कर दिया मुख जन यहाँ वर्णित था, और केवल मुख नाड़ीग्रन्थि में मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के लिए उपयोग नहीं प्रदान. खिला सिर तैयारी के लिए एक लाभ यह है, कि होंठ और पूर्वकाल स्पर्शक की उपस्थिति एक प्राकृतिक प्रोत्साहन के माध्यम से काट पैटर्न की पीढ़ी की अनुमति दी, समुद्री शैवाल के आवेदन. हालांकि यह प्रयोग और अधिक कठिन बना होता है, यह संभव हो सकता है के लिए तैयारी गठबंधन, मुख जन से जुड़ी होंठ छोड़ने जबकि भी व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के लिए उपयोग करने के लिए मुख ganglia लगाए.

पैटर्न Aplysia में दूध पिलाने डालने वाला या जो भोजन grasper, अतिकाल और मोटर कार्यक्रमों के त्याग चरणों सापेक्ष बंद radular तंत्रिका, पर गतिविधि के समय पर आधारित egestive के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है. यदि radular तंत्रिका गतिविधि त्याग चरण के रूप में एक ही समय में होता है, पैटर्न ingestive, क्योंकि grasper बंद है और retracting के रूप में यह मुख गुहा में भोजन खींचने का प्रयास करता है. यदि radular तंत्रिका गतिविधि व्याक्षेप चरण के दौरान होता है, पैटर्न egestive हैं है, क्योंकि grasper बंद है और सामग्री मुख गुहा 2 से बाहर धक्का protracting.

काटना, भोजन समझ करने का प्रयास, और निगलने, पहले से ही समझा भोजन 1,2 के परिवहन: डालने वाला पैटर्न कम से कम दो अलग उप - प्रकार होते में विभाजित किया जा सकता है. हालांकि, इन विट्रो काम (जैसे 14,17,18) में सबसे / घूस बाह्यक्षेपण (वन और प्राणि) डाइकोगैमी पर ही ध्यान केंद्रित किया है, प्रयास करने के लिए निगलने से काट भेद नहीं है. दो 16,19 अध्ययन इन विट्रो डालने वाला पैटर्न में काट की तरह और निगलने की तरह समूहों में वर्गीकृत किया है. इन अध्ययनों के पहले में, पैटर्न अलग ganglia में मनाया गया, अगर मुख जन से जुड़े खिला आंदोलनों को देखा जा सकता है, इस तर्क मजबूत होगी किसे पैटर्न काटने और निगलने vivo में देखा का प्रतिनिधित्व करते हैं. दूसरे अध्ययन में, पैटर्न एक खिला सिर तैयारी में मनाया गया, तो पैटर्न मनाया आंदोलनों के आधार पर वर्गीकृत किया गया है, लेकिन मुख नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की कोई रिकॉर्डिंग प्राप्त किया गया.

काटने, निगल, और अस्वीकृति - निलंबित मुख जन तैयारी व्यवहार के सभी तीन प्रकार का पालन करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है, जबकि एक साथ प्रमुख मुख तंत्रिकाओं और मांसपेशियों से गतिविधि की रिकॉर्डिंग, और दोनों उत्तेजक और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग. कोशिकी न्यूरॉन 6 तकनीक इस तैयारी में एक और महत्वपूर्ण अग्रिम है, क्योंकि मजबूत खिला - तरह हासिल आंदोलनों लगभग निश्चित रूप से एक intracellular इलेक्ट्रोड हटाना होगा. व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की कोशिकी रिकॉर्डिंग के साथ, मोटर कार्यक्रम के दौरान इन 'न्यूरॉन्स की गतिविधि के समय का पता लगाया हो सकता है जब यह अकेले तंत्रिका रिकॉर्डिंग के साथ मुश्किल होगा, कर सकते हैं क्योंकि कई अलग अलग इकाइयों च कर रहे हैंएक साथ iring.

हमने देखा है कि निलंबित मुख जन में खिला आंदोलनों गुणात्मक vivo में देखा है उन लोगों के लिए समान दिखाई देते हैं. महत्वपूर्ण बात है, उत्तेजनाओं (carbachol और मुख तंत्रिका 2 शाखा एक उत्तेजना, क्रमशः) अधिक कम तैयारी में इस्तेमाल किया गया है, और हमारे लग रहा है कि उत्तेजनाओं शारीरिक आंदोलनों उत्पन्न अन्य सेटिंग्स में उनके उपयोग के लिए विश्वसनीयता lends काटने और अस्वीकृति पैटर्न उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके विपरीत, निगलने पैटर्न उत्पन्न करते हैं, तो हम एक प्राकृतिक खाद्य प्रोत्साहन (एक समुद्री शैवाल पट्टी) जो पृथक ganglia को लागू नहीं किया जा सकता है के साथ एक कृत्रिम प्रोत्साहन (carbachol) संयुक्त. हम यह भी कहा है कि निलंबित मुख जन में तंत्रिका पैटर्न vivo पैटर्न में इसी तरह से अधिक कम तैयारी में प्राप्त की, सुझाव संवेदी प्रतिक्रिया CPG से पैटर्न को आकार देने में महत्वपूर्ण हो सकती पैटर्न होना दिखाई देते हैं. उदाहरण के लिए, अलग गिरोह में मोटर कार्यक्रमlia आम तौर पर कई बार अब बरकरार पशुओं में मोटर कार्यक्रमों की तुलना अवधि में कर रहे हैं, जबकि निलंबित मुख जन में मोटर कार्यक्रमों को आम तौर पर कर रहे हैं ज्यादा अवधि में बरकरार जानवरों (अप्रकाशित डेटा) में मोटर कार्यक्रमों के लिए करीब. निलंबित मुख द्रव्यमान का एक अन्य लाभ यह है कि एक साथ की ओर है और खिला तंत्र के सामने विचार प्राप्त किया जा सकता है. सामने का दृश्य जो कि vivo में देखा जाएगा के मुंह से एक समान दृष्टिकोण प्रदान करता है, जबकि जबड़े की मांसपेशियों के संकुचन के बेहतर अवलोकन की अनुमति. मुख मांसपेशी संकुचन की ओर देखने अवलोकन और मांसपेशियों के नीचे grasper के आगे और पिछड़े आंदोलन की अनुमति देता है, यह आसान अलग व्यवहार के दौरान biomechanical परिवर्तन को समझने के लिए कर रही है.

इस तैयारी में, हम से दर्ज की गई है पाँच (radular तंत्रिका और द्विपक्षीय मुख नसों 2 और 3) नसों और I2 मांसपेशी को एक साथ, और की पहचान पर दो कोशिकी इलेक्ट्रोड रखानाड़ीग्रन्थि में तंत्रिका कोशिकाओं. यह संभव हो सकता है के लिए अतिरिक्त नसों और / या मांसपेशियों से रिकॉर्ड करने के लिए, अगर experimenter वांछित होगा. यह भी के लिए प्रोत्साहित करने के लिए और मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि में न्यूरॉन्स, जो कि मस्तिष्क मुख interneurons की उत्तेजना, एक आम तकनीक 17,19, मोटर vivo व्यवहार में इसी तरह के कार्यक्रमों लाती में जानकारी दे सकता है रिकॉर्ड संभव होगा. हालांकि ऐसा करने के लिए तैयार करने की तकनीकी कठिनाई बढ़ जाती है, मुख 15 धमनी के छिड़काव की तैयारी मजबूत और लंबे समय तक चलने व्यवहार (अप्रकाशित टिप्पणियों) उत्पन्न करने के लिए अनुमति दे सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस शोध NIH अनुदान NS047073 और NSF अनुदान DMS1010434 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Fisher Scientific S671 Biological, Certified
Potassium chloride Fisher Scientific P217 Certified ACS
Magnesium chloride hexahydrate Acros Organics 19753 99%
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63 Certified ACS
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientifc C79 Certified ACS
Glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS buffer Acros Organics 17263 99%
Carbachol Acros Organics 10824 99%
Sodium hydroxide Fisher Scientific SS255 Certified
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Certified
Single-barreled capillary glass A-M Systems 6150
Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC Sutter Instruments Filament used: FT345B
Enamel coated stainless steel wire California Fine Wire 0.001D, coating h
Household Silicone II Glue GE
Duro Quick-Gel superglue Henkel corp.
A-M Systems model 1700 amplifier A-M Systems Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle
Pulsemaster Multi-Channel Stimulator World Precision Instruments A300
Stimulus Isolator World Precision Instruments A360
AxoGraph X AxoGraph Scientific
Veeder-Root Totalizing Counter Danaher C342-0562
Gold Connector Pins Bulgin SA3148/1
Gold Connector Sockets Bulgin SA3149/1
Sylgard 184 Silicone Elastomer Dow Corning
100 x 50 mm Crystalizing Dish Pyrex
High Vacuum Grease Dow Corning
Pipet Tips Fisher Scientific 21-375D
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10
Modeling Clay Sargent Art 22-4400
Silk Sutures Ethicon K89OH
Whisper Air Pump Tetra 77849
Aquarium Tubing Eheim 7783 12/16 mm
Elite Airstone Hagen A962
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Yaki Sushi Nori Seaweed Rhee Bros
Kimwipes Kimberly-Clark 34155

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References

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एक<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; Eliciting और रिकॉर्डिंग में शारीरिक आंदोलनों के साथ दूध पिलाने की मोटर कार्यक्रम के लिए तैयारी<em&gt; Aplysia californica</em
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McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320, doi:10.3791/4320 (2012).

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