Summary
Se describe una técnica para registrar extracelularmente y estimular los nervios, los músculos y las neuronas individuales identificados
Abstract
Multifuncionalidad, la capacidad de una estructura periférica de generar comportamientos múltiples y distintas 1, permite a los animales adaptarse rápidamente su comportamiento a los cambios del entorno. El molusco marino Aplysia californica proporciona un sistema tratable para el estudio de la multifuncionalidad. Durante la alimentación, Aplysia genera varios tipos distintos de comportamientos utilizando el mismo aparato de alimentación, la masa bucal. Los ganglios que controlar estos comportamientos contener un número de neuronas grandes, identificados que son accesibles para el estudio electrofisiológico. La actividad de estas neuronas se ha descrito en los programas motores que se pueden dividir en dos tipos, programas de ingestión y egestive, basado en el tiempo de la actividad neural que se cierra la pinza de agarre de alimentos relativa a la actividad neural que prolonga o se retrae la pinza 2. Sin embargo, en los ganglios aislados, los movimientos musculares que se producen estos comportamientos están ausentes, por lo que esmás difícil estar seguro de si los programas de motores observados son correlatos de los comportamientos reales. En grabaciones vivo, nerviosas y musculares se han obtenido correspondiente a los programas de alimentación 2,3,4, pero es muy difícil de grabar directamente de las neuronas individuales 5. Además, en vivo, programas de ingestión puede ser dividida en picaduras y 1,2 traga, una distinción que es difícil de hacer en la mayoría se ha descrito previamente en preparaciones in vitro.
La preparación de la masa suspendida bucal (Figura 1) cierra la brecha entre los ganglios aislados y animales intactos. En esta preparación, los comportamientos de ingestión - incluyendo tanto mordiendo y tragando - y comportamientos egestive (rechazo) puede ser obtenido, al mismo tiempo, como las neuronas individuales pueden ser grabadas desde y estimulado con electrodos extracelulares 6. Los movimientos de alimentación asociados con estas conductas diferentes puede ser RecorDED, cuantificado y relacionado directamente con los programas motores. Los programas de motor en la preparación de la masa suspendida bucal parecen ser más similares a los observados in vivo que son los programas de motor provocada en los ganglios aislado. Así, los programas de motor en esta preparación puede ser más directamente relacionada con el comportamiento in vivo; al mismo tiempo, las neuronas individuales son más accesibles para registro y estimulación que en los animales intactos. Además, como un paso intermedio entre los ganglios aislado y animales intactos, los hallazgos de la masa suspendida bucal puede ayudar en la interpretación de los datos obtenidos en configuraciones tanto más reducidas y más intacta. La preparación de la masa suspendida bucal es una herramienta útil para caracterizar el control neural de la multifuncionalidad en Aplysia.
Protocol
1. Preparación de las soluciones
- Para preparar la solución de cloruro de magnesio que es isotónica para el agua de mar en la que los animales son mantenidos (~ 1.000 millosmolar), marcar una jarra grande en el nivel de volumen deseado. Llene la jarra con agua destilada a aproximadamente el 80% de este nivel, y pesar la cantidad apropiada de cloruro de magnesio hexahidratado para crear una solución 333 mM en el volumen final. Agregue el cloruro de magnesio a la jarra, cierre la tapa y agitar vigorosamente hasta que el cloruro de magnesio se disuelve por completo, y luego añadir agua destilada hasta que el volumen final sea alcanzado.
- Para preparar salina Aplysia, de nuevo marcar una jarra grande en el nivel de volumen deseado, y llenar con agua destilada hasta aproximadamente 80% de este nivel. Coloque la jarra sobre una placa de agitación, coloque una barra de agitación en la jarra, y encienda la placa de agitación.
- Uno a uno, pesar y añadir a la jarra de las cantidades apropiadas de las siguientes sustancias para crear estos conconcentraciones en el volumen final: 460 mM de cloruro sódico, cloruro potásico 10 mM, 22 mM de magnesio hexahidratado, cloruro de magnesio 33 mM heptahidrato de sulfato, 10 mM de calcio dihidrato de cloruro, 10 mM de glucosa, 10 mM MOPS.
- Una vez que los solutos se disuelven completamente, usar un medidor de pH para medir el pH de la solución. Se añade lentamente hidróxido sódico 1 M para elevar el pH a un valor final de 7,5. Si accidentalmente añadir hidróxido de sodio en exceso, puede agregar 1 M de ácido clorhídrico para reducir el pH.
- Añadir agua destilada hasta que el volumen final se alcanza.
- Para retardar el crecimiento de bacterias, las soluciones de almacén en el refrigerador hasta que se necesite para un experimento. Tenga en cuenta que la temperatura puede afectar a los programas Aplysia motor. No cuidadosamente monitorear la temperatura, pero después de la instalación se haya completado, los preparativos están típicamente cerca de la temperatura ambiente.
2. Preparación del plato de grabación
- Durante el experimento, la masa bucal se suspendieron en solución enun redondo de 100 mm (diámetro) x 50 mm (altura) plato de Pyrex. Este plato debe tener una cámara delantera para la masa bucal, una estrecha plataforma, media elevada donde se fijan los ganglios bucal en Sylgard, y una cámara separada, de nuevo elevada donde se aísla el ganglio cerebral. Una muesca en el Sylgard debe conectar la plataforma ganglios vestibular a la cámara de ganglio cerebral. Vea la figura 1, en referencia a las dimensiones clave especificadas en la construcción del plato.
- Para crear este plato, comenzar con una ronda de 100 x 50 mm plato de Pyrex. Preparar Sylgard siguiendo las instrucciones proporcionadas con el producto. Construcción del plato se requieren varios vierte de Sylgard, entre los cuales el Sylgard se debe permitir establecer.
- El primer vertido es crear el mayor nivel de Sylgard en el plato, en la pared entre las cámaras bucales y cerebral (consulte la Figura 1). Bloquear esta porción de la cápsula de las otras secciones. Arcilla de modelar se puede utilizar para construirparedes para bloqueando secciones. Para una pared plana, una pieza de cartón se puede utilizar, con un soporte de arcilla de modelar. Para una pared curva (lo que reduce el tamaño de la cámara que contiene el ganglio cerebral), utilizar la arcilla de modelado como base única para la pared. Cubra todos los muros con una envoltura de plástico donde se pondrá en contacto con el Sylgard para facilitar su retiro.
- Una vez que el espacio para la pared entre las cavidades bucales y cerebral se ha bloqueado como se describe en 2,3, lo que garantiza un sellado hermético en los bordes para reducir las fugas, verter Sylgard en este espacio casi hasta la parte superior del plato. Deje que el conjunto Sylgard durante la noche, y asegúrese de que está completamente antes de continuar. Poner el recipiente en un lugar cálido provocará más rápido ajuste.
- A continuación, la plataforma de los ganglios de la bucal y la cámara de ganglio cerebral se debe verter (de nuevo, véase la Figura 1, que muestra las ubicaciones de estos ganglios en el plato terminado). Retire las paredes anteriores de bloqueo, y crear un nuevo muro una dipostura de 0,5 cm desde la pared plana Sylgard de la sección central para bloquear la plataforma de ganglios bucal. No hay paredes son necesarios para crear la cámara posterior que llevará a cabo el ganglio cerebral. Verter Sylgard en ambas secciones hasta una altura de aproximadamente 3 mm por debajo del nivel superior. La cámara cerebral debe ser sólo ligeramente más baja que la plataforma de ganglios bucal. Una vez más, vamos a la Sylgard establecido durante la noche.
- Por último, se vierte la cámara delantera (es decir, la cámara en la que se suspende la masa bucal). No hay paredes son necesarias. Verter a la altura apropiada como se especifica en la figura 1.
- El paso final consiste en cortar una muesca de conectar la plataforma de los ganglios de la bucal y la cámara cerebral. La profundidad de la muesca debe ser el mismo que el nivel de la plataforma de ganglios bucal. Una cuchilla de bisturí puede ser usado para cortar la muesca. Figura 1 ilustra el plato terminado.
3. Preparación del electrodo
- Tire extracelular electrodes de un solo cañón capilar de vidrio utilizando una micropipeta Brown Flaming-extractor. Diámetros de los electrodos interiores deben ser de alrededor de 40 micras y sus resistencias debe ser de aproximadamente 0,1 mW. Con el filamento FT345B en el extractor, nuestros ajustes típicos de programa son extractores de calor 480, Pull 50, Vel 13, y la hora 20, pero cuenta que la configuración será diferente para los diferentes filamentos. Este programa crea los electrodos en un solo tirón con ninguna de las etapas de pulido de fuego. Antes de iniciar un experimento, el relleno de los electrodos extracelulares con Aplysia salina.
- Crear electrodos de gancho nervio y músculo grabación 2 siguiendo un protocolo similar al descrito por Cullins y Chiel 4, excepto que los electrodos individuales no tienen que ser envuelto alrededor de la otra. Los pasos para crear estos electrodos seguir 3.3-3.13.
- Cortar una pieza de esmaltado, 0,001 pulgadas de diámetro de alambre de acero inoxidable de una longitud de aproximadamente 60 cm. Coloque una bola de plastilinaa cada extremo del cable, sujetar el alambre en el aire en su punto medio, y girar las dos bolas de arcilla alrededor de la otra de enrollar los cables alrededor de la otra (esto reduce los transitorios capacitivos).
- Mantenga los dos extremos del alambre juntos por unión de las dos bolas de arcilla en una bola, y la cinta el otro extremo del alambre para suspender el cable.
- Escudo toda la longitud del cable en los hogares pegamento de silicona mediante la colocación de un globo de goma en el pulgar, tocar los dedos pulgar e índice juntos en el alambre, y su ejecución a través del cable. Deje que el pegamento se seque durante la noche.
- Después se seca el pegamento, colocar el cable en una superficie plana bajo un microscopio binocular de disección. Cortar el extremo del alambre que antes era el medio, lo que resulta en dos cables separados enlazados entre sí. Este es un electrodo diferencial.
- Use cinta adhesiva para sujetar uno de los extremos del electrodo en su sitio. Usando una pinza para desprender pegamento y esmalte, preparar ambos cables en un extremo para tener aproximadamente 2 cm of alambre libre con alrededor de 1 cm del cable pelado de esmalte. Soldar un pin conector de oro a cada uno de los cables, y la cinta de laboratorio lugar alrededor de las clavijas, para mantenerlos separados.
- En el otro extremo del electrodo, preparar los cables para tener aproximadamente 3 mm de alambre libre. Eliminar el esmalte de los últimos de aproximadamente 1 mm de un alambre, y doblar este cable hacia atrás y fuera del camino. Este es el cable de referencia. Es crítico que los dos cables no tienen cable desnudo en contacto entre sí.
- Eliminar el esmalte del otro alambre todo el camino hasta el pegamento de silicona. Twist Esta alambre en forma de gancho y cortarlo a una longitud de aproximadamente 1 mm. Este gancho se conectará con el nervio o músculo. Usando un gancho corto proporciona mayor estabilidad cuando el nervio está unido al electrodo.
- Utilizar un multímetro para verificar que el electrodo está correctamente construido y intacto. Un conector de oro debe tener una lectura de resistencia de aproximadamente 200-500 ohmios con respecto a la punta de un alambre, y conectar el otro oroo debe tener una lectura similar en relación con el otro cable.
- Si no hay una conexión intacta en un alambre, puede que sea posible volver a pelar el extremo del cable y para volver a soldar uno o ambos conectores de oro para crear estas conexiones. Si los dos conectores de oro tienen conexiones con los dos cables, el electrodo puede tener dos cables desnudos de hacer contacto. Puede ser posible fijar el otro extremo de eliminar este problema, de lo contrario, el electrodo debe ser desechado.
- Repita este procedimiento para todos los electrodos de los que son necesarios para el experimento. Electrodos de gancho se puede volver a utilizarse de experimento a experimento cortando el extremo que conecta al nervio y la creación de nuevos ganchos, hasta que el alambre se vuelve demasiado corto después de muchos usos. Cada vez que se hace esto, utilizar el multímetro para verificar que el electrodo está intacto.
- Para realizar un seguimiento de los diferentes electrodos durante los experimentos, electrodos de etiquetas y sus cables. Utilizando diferentes colores de cinta de laboratorio es muy útil.
- Elegir un animal sano de alrededor de 200-300 g de peso. Cuando se presentan con las algas marinas, el animal debe producir picaduras con protractions fuertes a intervalos regulares de 3-5 seg.
- Colocar al animal en una bandeja de disección y se anestesian por inyección sobre el peso corporal 50% de solución isotónica de cloruro de magnesio. Hacer la primera inyección con la jeringa en ángulo de aproximadamente un 15 a 30, cerca de la mitad y apuntando hacia la cola del animal. Después de la inyección, masajear suavemente la superficie del animal para esparcir el cloruro de magnesio. Realizar inyecciones adicionales según sea necesario con la jeringa apuntando hacia la cabeza del animal.
- Después de que el animal deja de responder a los estímulos táctiles suaves, pin del animal a la bandeja, con el lado dorsal hacia arriba, con un pasador en la cola y un pasador en cada tentáculo anterior.
- Use pinzas para apretar y levantar la piel del animal en el medio de la cabeza, detrás de los rhinophores. Make una incisión coronal a través de la cabeza del animal, justo detrás del punto que se celebra. Luego haga una incisión sagital medio en el futuro entre las rhinophores hacia la boca, dejando al descubierto la masa bucal.
- Use unas pinzas para tirar de la aleta de la piel cerca de ti lejos de la masa bucal, y cortar a través de los nervios y el tejido conectivo que se adhieren a la pared del cuerpo de separar completamente este colgajo de piel de la masa bucal. Asegúrese de no cortar los nervios o el tejido intrínseco a la masa bucal.
- Use pinzas para agarrar y sostener el esófago. Corte a través de la parte posterior del esófago hasta el punto que se celebra. Tire hacia arriba del esófago para levantar la masa bucal como los siguientes cortes se hacen.
- Detrás de la masa bucal, la pleural cerebral, y forma un anillo de ganglios de pedal, con el ganglio cerebral unido a los ganglios bucal por las conectivas cerebral-vestibulares (CBC). Deja estos ganglios anillo unido a la masa bucal, y cortar todos los nervios que se proyectan desde estos ganglios a otras partes delel cuerpo.
- Cortar a través del tejido conectivo alrededor de la masa bucal, continuando para levantar la masa bucal hasta que se convierte en menos conectado al cuerpo. Una vez que la masa bucal sólo está unido en la boca, el esófago y la masa bucal debe mantenerse recto hacia arriba.
- Hacer un corte final justo anterior a las mordazas para liberar a la masa bucal del cuerpo. Coloque la masa bucal en una solución isotónica de solución de 50% de cloruro de magnesio y 50% de solución salina Aplysia a fin de mantener anestesia parcial, mientras que los electrodos se unen.
- Coloque la masa bucal, con una solución, en una placa de Petri con fondo Sylgard. Retire los ganglios pleural y pedal cortando sus conexiones con el ganglio cerebral. Deje el ganglio cerebral unida a los ganglios vestibular y bucal a través de la masa de las conectivas cerebral-vestibulares (CBC), cortar las conexiones entre el ganglio cerebral y masa bucal. Recorte el esófago y glándulas salivales para tramos cortos para que no se gy en el camino.
5. Gancho de fijación del electrodo
- Para la grabación y la estimulación, los electrodos de gancho se puede unir a un número de diferentes nervios y músculos, según sea apropiado para el experimento (Figura 2).
- Para caracterizar los patrones como se ha demostrado in vivo por Cullins y Chiel 4, colocará los electrodos en el nervio radular, el músculo I2, y nervios bucales 2 y 3. En conjunto, estas grabaciones muestran la actividad de las neuronas motoras de los músculos principales intrínsecas a la masa bucal 3,7,8, y permitir la identificación de la fase de prolongación de la grabación I2 3, la fase de retracción de los nervios vestibulares 2 y 3 grabaciones 2 , 5,8, y el momento de cierre de la pinza de la comida de los 2 nervios grabación radular. Conecte un electrodo de gancho adicional a la rama de un 2 nervio bucal para la estimulación del patrón. La unión de electrodos sigue un procedimiento similar al DEMOSTRACIed por Cullins y Chiel 4, y se describe en los pasos siguientes.
- Para cada fijación del electrodo, coloque el electrodo en un manipulador grueso. Para el manipulador, cinta de un palo de madera con una pinza en su extremo y utilizar el clip para sujetar el extremo del electrodo. El clip debe adjuntar a la sección revestida de silicona del electrodo, aproximadamente 1 cm antes del final del revestimiento de silicona. Utilice el manipulador para colocar el electrodo de gancho cerca de la masa bucal.
- Con la masa bucal en su lado y se coloca contra el lado del plato de la estabilidad, comenzar con el nervio radular, que presenta la fijación del electrodo más difícil. Hay dos opciones para acceder a este nervio.
- Los proyectos nerviosas rádula de debajo del ganglio vestibular y va debajo del músculo I2 en dos ramas. En primer lugar, ver si el nervio radular se puede acceder sin necesidad de cortar el músculo. Empuje suavemente a un lado la vaina blanca fijar el ganglio vestibular al músculo I2, do no cortar esta vaina. Si el nervio se puede acceder, usar pinzas con la punta doblada en forma de gancho para levantar una rama del nervio.
- Si el nervio radular no es accesible de esta manera, una segunda opción es la de localizar el nervio debajo de la delgada I2 músculo, y hacer una pequeña incisión en I2 para exponer el nervio. Esta incisión debe ir a través de dos capas de músculo. Utilice las pinzas de gancho para tirar de una rama del nervio radular de debajo del músculo.
- Utilice el manipulador a la posición del gancho del electrodo al lado del nervio. Para realizar el nervio en el gancho, es útil para mantener el nervio en forma de gancho, mientras que las pinzas simultáneamente utilizando otro par de fórceps para crear una separación entre las dos mitades del nervio se celebra.
- Después de que el nervio esté firme en el gancho, el uso del manipulador para levantar el nervio hacia fuera de la masa bucal hasta que se tensa, pero no se estire demasiado.
- Tome un Kimwipe y firmemente torcer una esquina para formar una mecha pequeña. Utilice esta mecha para secar elextremo del electrodo y la sección de nervio que va conectado.
- Utilice otro juego de pinzas de punta curvada para aplicar un pegote de gel pegamento rápido al nervio enganchado. Comience la aplicación en el punto de contacto entre el alambre y el nervio. Asegúrese de que el gancho está completamente cubierto con pegamento, y que la punta del cable de referencia no está cubierto con pegamento (Figura 3).
- Usar una jeringa con un accesorio de tubo de polietileno para aplicar la solución de la placa sobre el pegamento, que inducirá la superficie del pegamento para fijar. Asegúrese de bañar completamente el pegamento con una solución para garantizar que el pegamento se fija correctamente.
- Utilice el manipulador para liberar la tensión sobre el nervio, y luego suelte el electrodo del clip. Esto completa el procedimiento de fijación de un electrodo de gancho.
- El electrodo de músculo I2 debe atribuirse siguiente. Registramos la actividad EMG de los músculos I2 lugar de la actividad ENG de su nervio que inerva el nervio porque I2 es muy small y de difícil acceso en una masa bucal intacto. Cerca del nervio bucal 2, utilizar los fórceps de gancho para levantar una o dos bandas de músculo I2, y usar otro par de fórceps para ayudar a separar del resto del músculo. La porción de I2 separados deben ser similares en grosor del nervio bucal a 2 o 3. Tenga cuidado de no sobre-independiente (que puede desnervar el músculo). Adjuntar un electrodo de gancho con el mismo procedimiento usado para el nervio radular.
- El electrodo al lado de adjuntar es que para que una rama del nervio bucal 2. Esta rama puede ser estimulado eléctricamente para producir programas motores 9. Antes del nervio bucal 2 va debajo del músculo I1 en la ranura lateral, el nervio trifurcates; sucursal es la primera rama que se separó. Las ramas son bastante pequeñas, por lo que la fijación del electrodo se debe hacer con cuidado. Seguir el mismo procedimiento para conectar el electrodo.
- Nervios bucales 2 y 3 son de fácil acceso. Siga el mismo procedimiento, adjuntando la electrodos aproximadamente a medio camino entre el ganglio vestibular y ranura lateral.
- Para ayudar a distinguir las neuronas con proyecciones unilaterales vs bilateral, también es útil para unir electrodos a los nervios bucales 2 y 3 en el otro lado de la masa bucal, así como del nervio bucal 2 una rama, debido a que algunas neuronas responden de manera diferente a vs ipsilateral . contralateral BN2-una estimulación.
6. Colocación del ganglio y el adelgazamiento de la vaina
- La masa bucal se trasladará a la ronda plato 100 x 50 mm Pyrex se describe en la sección 2. Vea la figura 1.
- Aplique una capa fina de grasa de vacío a la muesca entre las cavidades cerebrales y bucal, utilizando una punta de pipeta para recoger un pegote de grasa de vacío y la extendió sobre la muesca. Hemos encontrado que la grasa de vacío reduce al mínimo las fugas mejor que la vaselina. Llenar la cámara frontal con solución salina Aplysia. Cuidadosamente mueva la masa bucal de la placa de Petri al frente chamber de este plato grande, asegurándose de que ninguno de los electrodos se tira con fuerza, lo que podría romper los nervios.
- Si el plato debe ser transferido a otro microscopio binocular de disección para el adelgazamiento de la vaina, tener mucho cuidado con los electrodos de gancho. Grupo de los electrodos sobre un lado de la masa bucal juntos, y también el grupo de los electrodos en el otro lado de la masa bucal juntos. Cuidadosamente sostener los electrodos agarrando la cinta de laboratorio que cubre los contactos del conector, de nuevo asegurándose de que ninguno de los electrodos se tira con fuerza.
- Cuando el plato se coloca bajo el microscopio, los electrodos deben ser envuelto suavemente en los lados del plato y el resto en la plataforma al lado del plato.
- Durante las pausas y entre las etapas del experimento, airear la solución salina en la cámara de masa bucal utilizando una piedra de aire acuario.
- Pin el ganglio cerebral en la espalda con las conectivas cerebral-vestibulares (CBC) que se ejecutan a través de la muesca. Aplique más g vacíoREase en los CBCs, a continuación, añadir más solución salina Aplysia a ambas partes de la antena, por lo que los ganglios están completamente sumergidas. Asegúrese de que la cantidad de grasa de vacío añadido es mayor que el nivel de solución salina en cualquiera de las cámaras cerebrales o bucal por lo que no se produce una fuga entre las cámaras. En esta etapa, la masa bucal debe descansar en la parte inferior de la cámara frontal para que no se tire con demasiada fuerza sobre los nervios y los ganglios.
- Pin el ganglio vestibular en la plataforma central. Para evitar daños en los nervios que están todavía conectados a la masa bucal, sólo colocar pines en la vaina entre dos nervios. Añadir dos pins más en el lado de los CBCs para estirar y anclar ellos.
- Mantener el plano ganglios bucal o girar sobre la base de la ubicación de las neuronas de interés. Para girar el ganglio vestibular, utilizar unas pinzas finas para tomar algo de exceso de la vaina CBC y el pin hacia abajo entre los nervios bucales 2 y 3. A continuación, la mayor parte de los cuerpos de las células que están próximas a la cámara posterior y no puede ser easiLy accede desde la parte superior del ganglio vestibular puede ser visto. Por último, añadir dos patillas de la vaina del ganglio vestibular próxima al lado de masa bucal para reducir al mínimo el movimiento del ganglio vestibular. Véase la Figura 4.
- Use unas pinzas finas para agarrar la vaina del ganglio vestibular próxima a la cámara de contrapresión, y luego cortar la vaina exceso con unas tijeras finas sin exponer a los cuerpos de las células. Con el fin de minimizar el daño, sólo eliminar la cantidad de funda necesaria para ver los cuerpos celulares.
7. Estimulación y registro
- Después de adelgazamiento de la vaina se ha completado, conectar todas las clavijas de electrodo a sus tomas de corriente en los cables que conectan a los amplificadores. Una vez más, asegúrese de que los electrodos no se tira con fuerza mientras hace esto. Asegúrese de que los electrodos estén conectados correctamente a sus cables adecuados y que las polaridades son correctas.
- Para lavar cualquier cloruro de magnesio restante, sustituya el Aplysiuna solución salina en la cámara de masa bucal con solución salina Aplysia fresco.
- Enhebrar una sutura de seda a través del tejido blando en la parte frontal de la masa bucal, anterodorsal al cartílago mandíbula, y utilizar dos piezas de arcilla de modelar para unir la sutura al borde del plato, suspendiendo así la masa bucal desde su extremo anterior. Tenga en cuenta que el extremo posterior está suspendido por los nervios vestibulares unidos a los ganglios bucal.
- Coloque un manipulador sostiene un electrodo de vidrio extracelular de modo que la punta del electrodo se encuentra cerca del ganglio vestibular.
- Para localizar e identificar una neurona, usar el manipulador para presionar suavemente la punta del electrodo extracelular hacia abajo sobre la vaina sobre el soma neuronal (Figura 5). Aplicar una corriente de estimulación, y luego cambiar el canal que se utiliza para excitar el soma al modo de grabación con el fin de registrar la actividad en el electrodo extracelular y la actividad correspondiente en los nervios (Figura 6). Remitira los mapas publicados ganglionares y descripciones de neuronas, incluidas las proyecciones nerviosas e inervaciones musculares (por ejemplo, 7,8) para obtener ayuda en la identificación de las neuronas.
- Para la grabación de vídeo de programas de alimentación, la posición de un espejo en el lado del plato de manera que vistas frontal y lateral de la masa bucal se pueden ver simultáneamente (ubicación del espejo se muestra esquemáticamente en la Figura 1). Posicionar una cámara de video tanto con vistas frontal y lateral en su campo de visión.
- Las grabaciones de video y electrofisiológicos se pueden sincronizar mediante el envío de un pulso TTL tanto a un temporizador electrónico en vista de la cámara y para un canal en AxoGraph, el programa de ordenador utilizado para registrar y analizar los datos electrofisiológicos. Este pulso proporciona un punto de tiempo que es exactamente el mismo en las grabaciones AxoGraph y vídeo, basado en la que los archivos se pueden sincronizar.
- Después de una neurona se encuentra, su actividad se puede grabar en diferentes como la alimentación-los comportamientos, que can ser obtenido como se describe a continuación.
- Para inducir el rechazo-como los programas de motor, estimular BN2-a. Con una larga cola de 2 Hz, pulsos de 1 ms 9 (nuestra experiencia es que esta estimulación fiable genera patrones egestive en esta configuración) Patrones de mantenerse durante la duración de la estimulación y puede continuar hasta poco después de la estimulación termina.
- Para inducir la mordedura de los 12 como los programas de motor, colocar unos pocos cristales de carbacol sólido directamente en el ganglio cerebral. Alternativamente, si un nivel controlado de exposición carbacol es necesario, utilizar una solución de carbacol mM entre 1 y 10 en solución salina Aplysia. Concentraciones más altas son más propensos a producir respuestas. Patrones repetitivos generalmente comienzan dentro de los 5 min, y una duración de aproximadamente 10 a 15 minutos antes de empezar a correr hacia abajo.
- Para hacer ingerir-como 13 programas de motor, aplique carbacol, y espere hasta que la masa bucal genera mordeduras fuertes. Entonces, durante una mordedura, coloque una tirade algas (desecado laver) en la boca del animal de modo que la rádula agarra el alga marina (Figura 7). Las tiras son generalmente 0,5 cm de ancho por 5 cm de longitud.
- Después de la primera serie de carbacol inducidos por los patrones, a menudo es posible obtener respuestas adicionales carbacol. Es necesario lavar completamente la solución salina en la cámara de Aplysia ganglio cerebral, remover y reemplazar la solución salina por lo menos tres veces. Esperar al menos 20 minutos antes de aplicar de nuevo carbacol. Esperando hasta 40 min puede dar resultados más fiables.
En este momento en los Estados Unidos, los animales invertebrados no requieren aprobación formal por parte de una utilización Animales institucional y el cuidado. Sin embargo, nos hemos asegurado que todos los tratamientos de Aplysia minimizar el daño y sufrimiento de los animales, y que todas las disecciones se realizan mientras el animal esté totalmente anestesiado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El trabajo previo ha caracterizado Aplysia programas motores en el animal intacto y en preparaciones reducidas, tales como ganglios aislado. En el animal intacto, aunque las grabaciones de las neuronas individuales se han obtenido 5, estos experimentos son muy difíciles, y los electrodos no se puede mover desde una neurona a otra durante la alimentación. En los ganglios aislado, los movimientos de alimentación inducidos por la actividad neural no se puede observar. La preparación de la masa suspendida bucal de puente entre estos dos extremos.
Otras preparaciones semi-intactas se han utilizado en estudios previos, pero la preparación masa suspendida bucal tiene ventajas significativas. En una semi-intacto preparación, los labios y la masa bucal aún estuviera unido, pero la preparación se redujo también para los movimientos de la alimentación completa que se observó 14. Una preparación de la alimentación 15,16 observación permitió cabeza de alimentar los movimientos in vitro. Sin embargo, thestá alimentando preparación cabeza era más complicado de configurar que la masa suspendida bucal descrito aquí, y sólo se proporciona acceso a las neuronas individuales en el ganglio cerebral, no en el ganglio vestibular. Hay una ventaja para la preparación de la cabeza de alimentación, en que la presencia de los labios y tentáculos anterior permitió la generación de patrones de picadura a través de un estímulo natural, aplicación de algas. Aunque sería hacer el experimento más difícil, puede ser posible combinar las preparaciones, dejando los labios unidos a la masa bucal mientras que también fijando los ganglios bucal para el acceso a las neuronas individuales.
Patrones de alimentación en Aplysia puede ser clasificado como ingestivo o egestive basado en el tiempo de la actividad en el nervio radular, que cierra la pinza de agarre de alimentos, en relación con la protracción y retracción de los programas de las fases del motor. Si la actividad del nervio radular se produce al mismo tiempo como la fase de retracción, los patrones son ingestive, porque la pinza se cierre y retracción en su intento de tirar comida en la cavidad bucal. Si la actividad del nervio radular se produce durante la fase de prolongación, los patrones son egestive, debido a que la pinza se cierre y prolongando para empujar el material hacia fuera de la cavidad bucal 2.
Patrones de ingestión se puede dividir en al menos dos sub-tipos: picadores, los intentos para agarrar el alimento, y la deglución, el transporte de alimentos 1,2 comprendido ya. Sin embargo, la mayoría en trabajos in vitro (por ejemplo 14,17,18) se ha centrado sólo en la dicotomía ingestión / egestión, sin intentar distinguir mordaz de tragar. Dos estudios 16,19 han clasificado en los patrones de ingestión in vitro en grupos similares a morder y tragar-como. En el primero de estos estudios, los patrones se observaron en los ganglios aislado, y si los movimientos de alimentación asociados de la masa bucal se puede observar, este sería reforzar el argumento de que elsE patrones representan el morder y tragar visto en vivo. En el segundo estudio, los patrones se observaron en una preparación de la cabeza de alimentación, por lo que los patrones fueron clasificados sobre la base de los movimientos observados, pero no hay grabaciones de las neuronas del ganglio vestibular se obtuvieron.
La preparación de la masa suspendida bucal proporciona una manera de observar los tres tipos de comportamientos - morder, tragar y rechazo - y al mismo tiempo registrar la actividad de los principales nervios y los músculos bucales y estimulante y grabación de las neuronas individuales. La técnica neurona extracelular 6 es otro avance clave en esta preparación, debido a que las fuertes como la alimentación-los movimientos provocados casi seguro que desalojar un electrodo intracelular. Con las grabaciones extracelulares de neuronas individuales, el tiempo de la actividad de estas neuronas durante los programas de motor se puede determinar cuando esto sería difícil con grabaciones nerviosas solo, porque muchas unidades diferentes son fIring simultáneamente.
Hemos observado que los movimientos de alimentación en la masa suspendida bucal aparecen cualitativamente similares a los observados in vivo. Es importante destacar que los estímulos para generar patrones de picadura y rechazo (carbacol y nervio bucal 2 rama una estimulación, respectivamente) se han utilizado en las preparaciones más reducidas, y nuestra conclusión de que los estímulos generar movimientos fisiológicos presta credibilidad a su uso en otros entornos. Por el contrario, para generar patrones de deglución, se combinaron un estímulo artificial (carbacol) con un estímulo alimento natural (una tira de algas marinas), que no se podría aplicar a los ganglios aislado. También hemos observado que los patrones neurales en la masa suspendida bucal parece ser más similar a los patrones en vivo que son los patrones obtenidos en las preparaciones más reducidas, lo que sugiere una retroalimentación sensorial puede ser importante en la conformación de los patrones de la GPC. Por ejemplo, los programas de motor en banda aisladalia son típicamente varias veces de mayor duración que los programas de motor en animales intactos, mientras que los programas de motor en la masa suspendida bucal son típicamente mucho más cerca en duración a los programas de motor en animales intactos (datos no publicados). Otra ventaja de la masa suspendida bucal es el lado simultánea y vistas frontales del aparato de alimentación puede obtenerse. La vista frontal proporciona una vista similar de la boca a la que sería visto in vivo, al tiempo que permite una mejor observación de contracción muscular de la mandíbula. La vista lateral permite la observación de las contracciones musculares bucales y el movimiento hacia adelante y hacia atrás de la pinza de agarre por debajo de los músculos, por lo que es más fácil de entender cambios biomecánicos durante los diferentes comportamientos.
En esta preparación, hemos registrado de hasta cinco nervios (nervio radular y bilateral de los nervios vestibulares 2 y 3) y el músculo I2 simultáneamente, y se colocan hasta dos electrodos extracelulares más identificadoLas células nerviosas del ganglio. Sería posible grabar desde nervios adicionales y / o músculos, si el experimentador deseado. También sería posible para estimular y registrar de neuronas en el ganglio cerebral, que podrían dar una idea de si la estimulación de interneuronas cerebrales bucales, una técnica común 17,19, induce programas motores similares en el comportamiento in vivo. A pesar de ello aumenta la dificultad técnica de la preparación, la perfusión de la arteria bucal 15 podría permitir la preparación de generar comportamientos más fuertes y de mayor duración (observaciones no publicadas).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el NIH subvención NS047073 y NSF subvención DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
