Summary
وصفنا كبدي الجدد جزيرة تشكيل في STZ (بالستربتوزوتوسين)-يسببها الفئران من السكري عن طريق نقل الجينات من Neurogenin3 (Ngn3) وBetacellulin (BTC) باستخدام المساعد التي تعتمد على ناقلات الغدانية (HDAd) وعكس ارتفاع السكر في الدم. لدينا أسلوب يأخذ مزايا المساعد التي تعتمد على ناقلات الغدانية مع كفاءة عالية في الجسم الحي تنبيغ والتعبير الجيني طويلة الأمد.
Abstract
ويتسبب مرض السكري نوع 1 من تدمير الخلايا T بوساطة المناعة الذاتية من الخلايا المنتجة للانسولين في البنكرياس. حتى الآن استبدال الأنسولين لا تزال هي العلاج الرئيسي، لأنه قد تم زرع جزيرة محدودة بمدى توفر الجهات المانحة والحاجة إلى كبت المناعة على المدى الطويل. الناجم عن جزيرة neogenesis من نقل الجينات من Neuogenin3 (Ngn3)، وجزيرة النسب، تعريف عامل النسخ محددة وBetacellulin (BTC)، وهو عامل نمو جزيرة لديه القدرة على علاج مرض السكري نوع 1.
ناقلات الغدانية (اعلانات) هي كفاءة عالية ناقلات نقل الجينات، ولكن في وقت مبكر إعلانات الجيل لها عيوب عديدة لاستخدام في الجسم الحي. التي تعتمد على الإعلانات المساعد (HDAds) هي الإعلانات الأكثر تقدما التي تم تطويرها لتحسين سلامة الملف الشخصي الجيل المبكر من الإعلانات والتحوير لإطالة التعبير 1. أنها تفتقر للسمية المزمنة الفيروسية لأنها تفتقر تسلسل الترميز 2-5 والاحتفاظ فقط الإعلان رابطة الدول المستقلة شاللازمة للنسخ المتماثل المتجه ements والتعبئة والتغليف. هذا يسمح الاستنساخ تصل إلى الجينات KB 36.
في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لتوليد HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى وعلى تقديم هذه النواقل في الفئران التي يسببها السكري STZ. نتائجنا تظهر أن شارك في حقن HDAd-Ngn3 و "الجزر الجدد 'HDAd-بى تى سى يحفز في الكبد وارتفاع السكر في الدم في الفئران عكس السكري.
Protocol
1. استنساخ الجينات العلاجية إلى ناقل المكوك HDAd
- استنساخ فأر Ngn3 وبى تى سى cDNAs في ناقلات البلازميد الذي يحتوي على pLPBL1 كل مكان استطالة عامل المروج-1 (BOS) وبولي إشارة A. عند الانتهاء، تحقق ناقلات عن طريق تحليل تسلسل ثم subclone هذه الأشرطة في التعبير المكوك HDAd pΔ28 البلازميد 6.
- خلاصة ناقلات المكوك HDAd من PmeI العمود الفقري للافراج عن البلازميد، تنقية السلطات الوطنية المعينة من قبل استخراج الكحول الفينول / كلوروفورم / الأميل تليها هطول الأمطار الإيثانول وإعادة ترنسفكأيشن مع الصف الماء.
2. المساعد التي تعتمد على إنتاج النواقل الغدانية
HDAd إنتاج النواقل ينطوي الخطوات المتعددة التي ينبغي اتباعها بعناية من أجل تحقيق النتائج المثلى.
2،1 ترنسفكأيشن
- قبل يومين من الخلايا ترنسفكأيشن 116، وبذور 7 في 6 سم لتصل إلى الطبق متموجة 70-80٪ في اليوم من ترنسفكأيشن.
- ثلاث ساعات قبل ترنسفكأيشن، وإزالة المتوسطة وإضافة 5 مل من المتوسط نمو جديدة [تستكمل مع FBS MEM 10٪ وباريس سان جيرمان 1٪ (البنسلين، الستربتوميسين والجلوتامين)، إينفيتروجن].
- 116 بالنقل الخلايا ذات الحمض النووي ميكروغرام 10 من الخطوة 1.2)، وذلك باستخدام مجموعة من الثدييات ProFectionR ترنسفكأيشن Promega وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع 1 مل من المتوسط النمو 2 مرات. إضافة المساعد فيروس (HV) في جزيئات ناقلات 500 (نائب الرئيس) / خلية إلى 0.1 مل من الكالسيوم والمغنيسيوم التي تحتوي على PBS (PBS + +) وتراكب إلى الخلايا. صخرة بلطف الأطباق لتوزيع بالتساوي HV كل 10 دقيقة.
- بعد 60 دقيقة، إضافة 1.5 مل من المتوسط الصيانة (MEM، 5٪ FBS، باريس سان جيرمان 1٪).
- إضافة 1 مل من آخر صيانة المتوسطة في اليوم التالي.
- مراقبة الخلايا لCPE (الأثر الاستسلامي - الخلايا تصبح تقريب وفصل). ينبغي أكبر من 80٪ من الخلايا تظهر CPE 2 أيام بعد الإصابة.
- جمع الخام lysate الخلية (CVL، وخلايا والمتوسطة)، علىي ي 10٪ من حجم السكروز 40٪ وتخزينها في -80 درجة مئوية. هو المسمى CVL ومرور 0 - (CVL-P0).
2،2 ناقل التضخيم
- تجميد (-80 ° C، 3-5 دقيقة) / ذوبان الجليد (37 ° C، 1-2 دقيقة) 3 مرات.
- تستكمل تراكب مع 0.5 مل CVL في 200 HV خلية / نائب الرئيس للخلايا متكدسة في 116 سم 6 الطبق، ويهز بلطف طبق كل 5 دقائق. بعد 30 دقيقة، إضافة 1 مل المتوسطة الصيانة.
- إضافة 1 مل من اليوم التالي الصيانة المتوسط. 2 أيام في وقت لاحق، وينبغي أن معظم الخلايا تظهر CPE.
- جمع CVL وتخزينها في -80 درجة مئوية (CVL-P1) كما هو موضح لخطوة 2.1.8).
- كرر الإجراء لمدة 3 مرات للحصول على CVL P2-P4.
- استخراج الحمض النووي (DNeasy الدم والأنسجة كيت، QIAGEN) من 0.2 مل من جمعها في CVL P1-P4، وتحليل التضخيم من قبل ناقلات qPCR باستخدام الاشعال وHV-HDAd محددة (الجدول 1). استخدام المقطع الذي HDAd تضخيم أضعافا مضاعفة نسبة إلى HV (P3 في الشكل 2) لsubsequenر الداخلي.
- شارك في تصيب 90٪ متموجة 116 الخلايا في طبق 15cm ومع CVL مل 0.5 و HV نائب الرئيس في 200 / خلية. صخرة الطبق بلطف كل 5 دقائق. بعد 30 دقيقة، إضافة 10 مل من المتوسط الصيانة.
- إضافة 5 مل من المتوسط الصيانة بعد 24 ساعة.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 1500 x ج لمدة 5 دقائق بالضبط 48 ساعة بعد الإصابة.
- اعادة تعليق الخلايا في 1 مل من PBS + C. تحتوي على السكروز 4٪ (P5) وتجميد -80 درجة في +
2،3 HDAd نطاق كبير الانتاج
- لإعداد الخلايا لعدوى 116 في خلية ثقافة التعليق، ونقل الخلايا متموجة 116 في 8 طبق 15-سم × في قارورة L 3 و الدوار إضافة تعليق المتوسطة النمو (Joklik تعديل MEM تستكمل مع 5٪ FBS، 0.1 هيغروميسين ملغ / مل و 1٪ PSG) لL 1 النهائي، واحتضان في حاضنة CO 2 مع الغزل في 60 دورة في الدقيقة 8.
- إضافة 0.5 لتر من متوسطة جديدة كل يوم لمدة 2 يوم (المجموع 2 L).
- عد الخلايا في اليوم الثالث. الخلايا جاهزة للاستخدام إذا ر الوصولس عدد الخلايا مجموعه 1x10 9.
- تجميد / الذوبان P5 3 مرات.
- جمع الخلايا من القارورة 3 L الدوار بواسطة الطرد المركزي عند 1000 x ج لمدة 5 دقائق. انقاذ 100 مل من طاف للخلايا اعادة تعليق.
- نقل الخلايا إلى قارورة الدوار 250-مل. إضافة P5 وHV في 200 خلية / نائب الرئيس للخلايا واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 ° C في 60 دورة في الدقيقة.
- نقل الخلايا والمتوسطة لقارورة 3 L الدوار، إضافة 2 L النمو التعليق المتوسطة. تحويل 1 مل تعليق الخلية إلى بئر في لوحة 12-جيدا لمراقبة الخلايا لCPE.
- احتضان الخلايا في قارورة الدوار لمدة 2 أيام في حاضنة CO 2 عند 60 دورة في الدقيقة.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي ومع 15 مخزن 100 مل تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) ملم على و-80 درجة مئوية (P6) حتى إعادة تنقية تعليق.
2،4 ناقل تنقية
- إضافة 1.0 مل من الصوديوم 5٪ deoxycholate إلى P6. المزيج بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 400 ميكرولتر من MgCl M 2 2، 300 μلتر من A ريبونوكلياز (10 ملغ / مل)، و 300 ميكرولتر من الدناز I (10 ملغ / مل) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- أجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لجمع طاف.
- تعقيم أنابيب NVT نابذة فائقة السرعة 65 (بيكمان) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
- إضافة 2.8 مل من محلول CSCL منخفض الكثافة (1.25 جم / مل)، الأساس الذي تقوم عليه 2.8 مل من محلول عالي الكثافة الكثافة CSCL (1.41g/ml) ثم تراكب 5-6 مل من طاف لملء الأنبوب في الرقبة. استخدام 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (pH8.0) لملء الأنبوب إذا لزم الأمر.
- أجهزة الطرد المركزي في 10 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 50،000 دورة في الدقيقة في 10 ° C مع بيكمان LE-80K-65 NVT باستخدام الدوار.
- مسح المنطقة مع الايثانول 70٪ للثقب الإبرة، وجمع الفرقة أقل براق مع حقنة مل 3-22-مجهزة G إبرة عن طريق البزل الجانب (الشكل 3A). يمكن في بعض الأحيان أن ينظر إلى الفرقة المساعد خافت جدا تحت الفرقة ناقلات أكثر وضوحا. محاولة الحصول على أكبر قدر من اله الفرقة ناقلات ممكن، دون الفرقة المساعد. من المقبول في هذه الخطوة حتى لو كان يستنشق بعض من الفرقة المساعد، حيث سيتم فصلها في الطرد المركزي ليلة وضحاها اللاحقة التي تلي.
- وضع العصابات التي تم جمعها في أنابيب جديدة نابذة فائقة السرعة تعقيمها. ملء أنابيب في الرقبة عن طريق تغطية 1،35 ز / مل حل الكثافة CSCL.
- أجهزة الطرد المركزي في 10 ° C في 50،000 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها. جمع الفرقة براق (الشكل 3B).
- نقل الفرقة إلى غسيل الكلى كاسيت (واحد في الشرائح Lyzer، 10،000 MWCO، الحرارية العلمية).
- Dialyze ضد 3 L من 10 مللى تعقيمها تيس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة المحتوية على 2 7،2 ملم MgCl 2 و السكروز 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إزالة ناقلات HDAd من الكاسيت غسيل الكلى. قسامة 20 ميكرولتر لعيار البدنية و 50 ميكرولتر لتوصيف DNA. (ملاحظة: للحصول على Ngn3 ناقلات، كرر "P6" ثلاث مرات للحصول على ما يكفي من ناقلات منذ محصول HDAd-Ngn3 رديئة مقارنة بى تى سى-HDAd أو HDAd فارغة.)
2،5 توصيف المتجهات HDAd
- تحديد عيار المادية (نائب الرئيس / مل) باستخدام الكثافة الضوئية (OD). إضافة 20 ميكرولتر ناقلات أو 20 ميكرولتر العازلة غسيل الكلى إلى 380 ميكرولتر العازلة TE تحتوي على 0،1٪ SDS واحتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قياس OD في 260 نانومتر. وعيار البدنية = 1.1 × OD260 X 10 12 X 20 (VP / مل).
- تحليل التلوث بواسطة HV qPCR. استخدام قسامة 50μl لاستخراج الحمض النووي باستخدام الأنسجة DNeasy / طقم الدم استخراج الحمض النووي (QIAGEN). تمييع 1000-DNA أضعاف ويأخذ 5 ميكرولتر للتحليل باستخدام qPCR المساعد وناقلات محددة الاشعال (الجدول 1). ينبغي أن يكون تلوث المساعد أقل من 1٪، كما هو موضح في الشكل 4A.
- استخدام لطخة جنوب لتحليل هيكل النواقل. أداء تحليل لطخة جنوب 10 باستخدام مسبار لتكرار مقلوب محطة (ITR). يظهر في الشكل نتيجة ممثل 4B.
- تحديد فعالية في المختبر. إصابة معروفةعدد الخلايا من 116 لوحة في 12 جيد مع ناقل HDAd في 1000 VP / خلية في quadruplicate. حصاد الخلايا بعد 48 ساعة واستخراج الحمض النووي الريبي لتحديد التعبير عن mRNAs وNgn3 وبى تى سى من QRT-PCR (الجدول 1). وتظهر نتائج ممثلة في الشكل 5.
3. علاج الفئران من السكري من HDAd-Ngn3 وBTC-
3،1 تحريض السكري في الفئران وحقن النواقل HDAd
- إعداد STZ: إعداد 0.1M العازلة سترات، وضبط PH ل4،3-4،5. تصفية هذه الحقنة من خلال مرشح 0.22 ملم. باستخدام الماء المعقم تمييع هذا نا إلى 0.01 M الرقم الهيدروجيني 4،2-4،5 سترات. حل كمية مناسبة من STZ (سيغما) في هذا الحل لتحقيق تركيز النهائي من 12.5 ملغ / مل. في هذا التركيز ليس هناك هطول الأمطار. إبقاء هذا الحل STZ في 4 درجات مئوية حتى استخدامها. جعل درجة الحرارة من الحل عن طريق الحقن إلى درجة حرارة الغرفة مباشرة قبل الحقن. وشول STZ الحلد يكون مستعدا الطازجة كل يوم، وحقن داخل 5-10 دقيقة من حلها.
- حقن هذا الحل STZ الغشاء البريتونى (10 ميكرولتر / جم لتحقيق جرعة من 125 ميكروغرام من وزن الجسم / ز)، في المساء بين الساعة 5-7 (قبل تشغيل الأنوار في مرفق الماوس والفئران بدء تغذية بنشاط)، في يومين متتاليين 9.
3،2 الجلوكوز وحقن الفئران مراقبة ناقلات HDAd.
- الفئران بسرعة لمدة 6 الموارد البشرية والتدبير وزن الجسم ومستوى السكر في الدم الأسبوعية حتى الفئران لديها ارتفاع السكر في الدم (≥ 250mg/dl). استخدام بلمسة واحدة لغلوكمتر الدم التي جمعتها قص الذيل. مرة واحدة السكر في الدم هو ≥ 250 ملغ / دل، وإعادة فحص السكر في الدم مرة أخرى في 48 ساعة بعد ساعة 6 سريع لضمان استمرار ارتفاع السكر في الدم ونسبة الجلوكوز في الدم ضمن النطاق المستهدف للعلاج: 250-500 ملغ / دل.
- علاج ارتفاع السكر في الدم مع الفئران عن طريق الحقن المستمر عن طريق الحقن في واحدة من ناقلات عبر الوريد HDAd الذيل. الجرعة ناقلات إجمالية تبلغ 11 6x10 نائب الرئيسالعلاج لجميع الفئات (0.25 مل في): 5x10 11 +1 Ngn3 نائب الرئيس نائب الرئيس 11 X10 بى تى سى للمجموعة الجمع؛ 5x10 11 + 1x10 Ngn3 نائب الرئيس نائب الرئيس للNgn3 11 مجموعة، ونائب الرئيس بى تى سى 1x10 11 + 5x10 ناقلات الفارغة 11 نائب الرئيس لمجموعة بى تى سى و 6x10 ناقلات نائب الرئيس 11 فارغة للمجموعة المراقبة.
- الذيل الوريد الحقن. وضع الفئران في restrainer Tailveiner (TV-150، برينتري العلمية وشركة)، واستخدام الماء الدافئ لتمدد الأوردة الذيل، الذيل تنظيف مع الكحول 70٪. عقد الذيل تحت موقع الحقن بين الإبهام والسبابة لليد، استخدم جهة أخرى للحقن. قبل الحقن تأكد من عدم وجود فقاعات في المحقنة (باستخدام 30 1/2 إبرة حقنة G و 1 مل). إدراج إبرة حقن وناقلات ببطء. إذا كانت الإبرة في الوريد، قد شهدت ومضة من الدم في محور الإبرة، وهناك أيضا وجود المقاومة خلال الحقن. بعد إزالة الإبرة، عقد موقع الحقن بشاش لوقف النزيف قبل أن تعود الفئران رس القفص.
إذا كانت الإبرة ليست في الوريد هناك مقاومة كبيرة لحقن تحت الجلد والانتفاخ قليلا لذلك. في هذا الوقت إزالة الإبرة وحاول مرة أخرى في موقع مختلف.
3،3 تحليل آثار HDAd-Ngn3 + HDAd-بى تى سى العلاج.
- رصد الصيام الجلوكوز 6 ساعة ووزن الجسم أسبوعيا بعد العلاج الموجه.
- جمع الدم من الوريد الصافن أو الوريد في الساق ذيل كل أسبوعين 2 إلى الأنسولين فحص (ELISA الأنسولين الماوس عدة، Mercodia) وإنزيمات الكبد (AST و ALT إنفينيتي الكواشف، الحرارية العلمية) باستخدام مجموعات تجارية.
- ضع الماوس في أنبوب فالكون 50 لم يسبق لهم اللعب مع مل فتحات في نهاية مغلقة.
- رئيس الماوس، هو في نهاية مغلقة من الأنابيب والساقين والذيل على الجانب المفتوح من الأنبوب. لجمع الدم من الساق اليسرى، تمديد الساق اليسرى خارج من الأنبوب وقرصة بلطف الجلد من الفخذ بين الإبهام والسبابة لمنع حركة الساق.
- استخدمماكينة حلاقة لإزالة الشعر من شين / المنطقة السفلى من الساق، لفضح الوريد الصافن، وهو موجود على الجانب الوحشي من الجزء الأسفل من الساق. تنظيف الجلد حلق مع الكحول 70٪ واتركها لتجف.
- ثقب الوريد الصافن مع إبرة قياس 25، وجمع الدم أنبوب مع CB300 Microvette (Sarstedt) ووضع أنابيب على الجليد.
- اضغط على موقع ثقب بشاش لوقف النزيف قبل أن تعود الفئران إلى الأقفاص.
- أجهزة الطرد المركزي أنابيب عند 3،000 x ج لمدة 5 دقائق، واتخاذ طاف وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
3،4 تنفيذ اختبار تحمل الجلوكوز (GTT) في 6 أسابيع بعد العلاج.
- حل D-الجلوكوز (سيغما) في الماء المقطر لجعل الجلوكوز 15٪ (15 جم / 100 مل) والجلوكوز وتصفية العقيمة.
- سريع الفئران لمدة 6 ساعة. استخدام وسادة دافئة لتدفئة الفئران وجمع الدم (0 نقطة زمنية دقيقة). ثم حقن 1.5 غرام / كغ من السكر D-IP (10 ميكرولتر / غرام من الجلوكوز 15٪).
- مضيق بين قمتينlect الأول في الدم 15، 30، 60 دقيقة 120،.
- قياس الجلوكوز والأنسولين في كل هذه العينات.
3،5 تحليل الأنسجة لتقييم التعبير عن النواقل وتقييم تحريض neogenesis جزيرة.
في كل هذه الخطوات والضوابط المطلوبة لتفسير موثوق النتائج ما يلي: (1) ناقلات الفارغة تعامل الفئران من السكري (2) غير المصابين بالبول السكري الفئران و (3) غير المصابين بالبول السكري البنكرياس بمثابة مراقبة إيجابية للتعبير عن جزيرة محددة الهرمونات وعوامل النسخ.
- الحصاد الكبد والبنكرياس في 3 و 6 أسابيع بعد العلاج. تقسيمها إلى 2 قطعة، وهو أول لتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية لمدة RNA والبروتين استخراج، والثاني لإصلاح مع 10٪ بين عشية وضحاها الفورمالين لتحليل المناعية.
- استخراج الحمض النووي الريبي من بروتوكول قياسي وتحليل الهرمونات التعبير عن جزيرة محددة وعوامل النسخي، جنبا إلى جنب مع Ngn3 وبى تى سى للconfirم ناقلات التعبير، في الكبد عن طريق QRT-PCR باستخدام بادئات محددة 9 و 10.
- استخراج الأنسولين والببتيد C-من الكبد عن طريق أسلوب استخلاص الحمض الإيثانول وتقدير من قبل مجموعة ELISA التجارية (الترا فحص الانسولين الحساسة، Mercodia، الببتيد C-ELISA عدة، واكو).
- أداء المناعية للهرمونات محددة جزيرة (الأنسولين، الجلوكاجون، PP، SST) جنبا إلى جنب مع جزيرة عوامل النسخ المحددة في البارافين جزءا لا يتجزأ من البابين 9 و 10. ويمكن أيضا التعبير عن Ngn3 وبى تى سى تأكيد من المناعية.
4. ممثل النتائج
نحن المستنسخة Ngn3 وبى تى سى [كدنا] في pΔ28 ناقلات يقودها eIF2a المروج في كل مكان (BOS) ولدت HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى. كما هو مبين في الشكل 2، وانخفاض التلوث HV النسبية بشكل ملحوظ (يعني أكثر وأقل التضخيم ناقلات التضخيم المساعد) في مرور 3. ولذلك، كنا P3 لإنتاج النواقل اللاحقة. بعد أولالتدرج متقطع CSCL وتنبيذ فائق، جمعنا الفرقة أقل النواقل وجمعها ثم الفرقة براق الموافق ناقلات HDAd في تنبيذ فائق الثانية (الشكل 3). كان الموجه HDAd تنقية أقل من 1٪ من التلوث HV (الشكل 4A) من قبل qPCR وليس لديه تلوث المساعد مرئية على جنوب النشاف (الشكل 4B)، مشيرا إلى نوعية كافية للتسريب ناقلات في الفئران. وشملت مزيد من التحليل التعبير التحوير عن طريق العدوى من 116 الخلايا. كانت مستويات التعبير مرنا من Ngn3 وبى تى سى أعلى في الخلايا المصابة ناقلات أكثر من 10000 أضعاف مقارنة مع تلك الموجودة في الخلايا المصابة غير (الشكل 5).
ثم كانت تدار HDAd-Ngn3 وبى تى سى لSTZ التي يسببها الفئران من السكري عن طريق حقن الوريد الذيل مع ناقلات الفارغة وحقن HDAd-بى تى سى حقن الفئران من السكري العامل بوصفه المراقبة السلبية. انعكس ارتفاع السكر في الدم والجلوكوز في حفز إفراز الأنسوليناعيدت في الفئران التي عولجت مع كل من Ngn3-HDAd وHDAd بى تى سى، ولكن ليس في الفئران التي عولجت مع جين واحد أو ناقلات مكافحة ناقلات الفارغة (الشكل 6). كان quantitated في HDAd-Ngn3-بى تى سى العلاج الناجم عن جزيرة neogenesis وذلك من خلال معايرة مجموع الأنسولين والببتيد C المحتوى (الشكل 6E) مع غير المصابين بالبول السكري، السكري الفئران ناقلات الفارغة تعامل العامل بوصفه الضوابط. ج وجود الأنسولين والببتيد في نسب متساوي المولية يؤكد أن الأنسولين هو في الواقع أن يتم اكتشافها في الكبد يجري تصنيعه في الكبد. أكد RT-qPCR أن الكبد من HDAd-Ngn3-بى تى سى الفئران التي عولجت أعرب جميع الهرمونات جزيرة محددة وعوامل النسخ 9. وأظهرت الخلايا المناعية إيجابية الأنسولين في الكبد من الفئران التي عولجت مع HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى، ولكن لم يلاحظ أي خلايا الانسولين في الفئران التي عولجت إيجابية مع مكافحة ناقلات (الشكل 7). ونحن كما أكد أنه لا توجد الجزر المتبقية في البنكرياس من treate Ngn3-بى تى سىد الفئران مقارنة مع الجزر العديدة في غير المصابين بالبول السكري البنكرياس. كما تم تقييم ناقلات (Ngn3 وBTC) جنبا إلى جنب مع جزيرة محددة النسب عامل النسخ (PDX-1 وNkx6.1) التعبير المناعية في الكبد (الشكل 7).
مخطط تدفق الرقم 1. العلاج الجيني من الفئران من السكري باستخدام المساعد التي تعتمد على نظام الفيروس. أولا، Ngn3 وبى تى سى، في شريط يقودها المروج BOS في كل مكان، والمستنسخة في المكوك HDAd (pΔ28) ناقلات. ويتم إنتاج HDAd من عدة خطوات بما في ذلك ترنسفكأيشن، وممرات المسلسل من التضخيم، وعدوى على نطاق واسع تليها تنقية النواقل. بعد تميز الجودة، يتم حقن عن طريق الوريد في HDAds STZ الناجم عن السكري عن طريق الوريد الفئران الذيل. يتم تقييم آثار العلاج الجلوكوز قياس ووزن الجسم، GTT والتحليلات في التعبير الجينيفي الكبد.
الشكل 2. تحديد التضخيم ناقلات HDAd. يتم استخراج الحمض النووي من مرور P0 إلى P4 باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي (QIAGEN). يتم تخفيف الحمض النووي DNA يستخدم 1،000 أضعاف و5μl لPCR الوقت الحقيقي (qPCR). وتستخدم ناقلات مساعد ومحددة الاشعال. يتم إنشاء منحنيات القياسية من التخفيفات التسلسلي (10 -5 إلى 1 نانوغرام / مل) من HDAd المكوك ناقلات البلازميد وHV (لوحات الأعلى) البلازميد. ويحسب باستخدام المنحنيات القياسية والقيم ط م للنسخة النواقل والمساعد عدد الفيروسات ويتم رسم نسبة HDAd / HV كنسبة مئوية من إجمالي الفيروس (مساعد + HDAd). وبالتالي، يتم حساب نسبة التضخيم ناقلات على النحو التالي: [في عدد النسخ ناقلات / (ناقلات + نسخة الفيروس المساعد العدد)]. في المثال المعروض (اللوحة السفلية) HDAd التضخيم ناقلات استقر في P4، في حين أن النسبية HDAd / HV يتزايد في P3. ولذلك، Pتم تحديد 3 لخطوة لاحقة.
الشكل 3. نطاقات ناقلات الممثل HDAd بعد متقطع تنبيذ فائق الكثافة CSCL. يتم تنقيته HDAd ناقلات من ثقافة الدوار 3L على التدرج الكثافة CSCL متتابعة. (A) بعد أول الكثافة تنبيذ فائق التدرج، واحدة الفرقة ناقلات براق مرئيا (السهم) أدناه حطام خلية مبهمة (CD). يتم جمع الفرقة براق (السهم) لكثافة الطرد المركزي التدرج الثاني. (B) بعد تنبيذ فائق التدرج الكثافة الثانية، يتم جمع الفرقة براق (السهم) لغسيل الكلى.
الشكل 4. تحليل تلوث فيروس المساعد. يتم استخراج الحمض النووي من الفيروس 50μl تنقية والتلوث المساعد لssessed كما في الشكل 2. ويوضح الشكل التلوث المساعد للHDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى، هي أقل من 1٪.
الشكل 5. يتم تنفيذ تحليل هيكل ناقلات HDAd. صمة عار جنوب كما هو موضح سابقا (أوكا K، وآخرون). حارة 1: DNA من الفيروس المساعد؛ لين 2: DNA من P3؛ لين 3: DNA من P4، لين 4: تنقية vectopr. الأسهم تشير إلى نطاقات مفتوحة الفيروس المساعد المستمدة والسهام تشير إلى شغل العصابات ITR المستمدة من ناقلات HDAd.
الشكل 6. مستوى التعبير أو من Ngn3 في 116 بى تى سى الخلايا المصابة مع ناقلات HDAd-Ngn3 أو HDAd بى تى سى. واصابة 116 في لوحات خلايا بشكل جيد مع ناقل 12-HDAd Ngn3 أو HDAd بى تى سى أو فارغة نائب الرئيس في 1000 / خلية ل 2 أيام. مويتم حصاد LLS ويتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام كاشف TRIzol. يتم تنفيذ QRT-PCR باستخدام Ngn3 أو الاشعال بى تى سى محددة. وNgn3 قريب أو بى تى سى التعبير مرنا بنسبة أكثر من 10،000 في أضعاف الخلايا المصابة مع HDAd-Ngn3 أو HDAd بى تى سى. وطبع الرقم من Dev.Cell 2009 مارس؛ 16 (3): 358-73؛ Yechoor وآخرون. آل.، بإذن من السيفير.
الشكل 7. نقل الجينات من HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى، في الفئران التي يسببها السكري STZ يؤدي إلى عكس مرض السكري وتحريض neogenesis جزيرة في الكبد. (A) البلازما الجلوكوز و(B) وزن الجسم من الفئران التي يسببها السكري STZ تعامل مع HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى. (C) الجلوكوز والانسولين البلازما خلال GTT-IP في 6 أسابيع بعد العلاج. (D) تلطيخ الأنسولين في الكبد الممثل 12 أسبوعا بعد العلاج. * P <0.05 (مقابل مجموعة ناقلات الفارغة). وطبع الرقم من ديف. سلL 2009 مارس؛ 16 (3): 358-73؛ Yechoor وآخرون، بإذن من السيفير.
| اسم | إلى الأمام التمهيدي | عكس التمهيدي | |
| المساعد | GACCATCAATCTTGACGACC | ATGTCGCTTTCCAGAACCC | |
| ناقلات | TTGGGCGTAACCGAGTAAG | ACTTCCTACCCATAAGCTCC | |
| Ngn3 | AAGAGCGAGTTGGCACTCAG | TCTGAGTCAGTGCCCAGATG | |
| BTC | GCACAGGTACCACCCCTAGA | TGAACACCACCATGACCACT | |
الجدول 1. تسلسل التمهيدي.
Discussion
وقد وضعت HDAds للتغلب على ضعف الطلب في وقت مبكر جيل وتسخير لتطبيق العلاج الجيني. ومع ذلك، تظل التحديات التقنية. على سبيل المثال، يتطلب HDAd HV للتغليف HDAd والتضخيم ناقلات ليست فعالة مثل الإعلانات الجيل المبكر. HV هو الجيل الأول والإعلان أي تلوث التسوية HV فعالية HDAd. ولذلك، ترنسفكأيشن كفاءة عالية والظروف المثلى لمرور كل مسلسل حاسمة. مقياس آخر للإنتاج متجه الحرجة هو الذي مرور (P1-P4) يجب أن تستخدم لمرور اللاحقة (5) التي يتم استخدامها بشكل مباشر واللقاح لخلايا التعليق. لتجربتنا، ويتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام مرور التي يتم من خلالها زيادة كبيرة HDAd نسبة ناقلات في المقطع التالي (P3 في الشكل 2). العائد من ناقلات HDAd يعتمد على أشرطة التحوير. أثناء الإنتاج الموجه، يتم التعبير عن الجينات المحورة سواء لأن كلا الجينات هي تحتفي كل مكان المروج. Ngn3 هو عامل النسخ وبى تى سى هو عامل النمو، مما يوحي بأن HDAd عامل النسخ ناقلات التعبير عن النسب التي قد تؤثر على الخلايا ناقلات يمنع التضخيم في حين أن هرمون النمو يساعد في النسخ المتماثل معربا عن النواقل والتعبئة والتغليف.
مع افتراض مستويات وبائية مرض السكري، وهناك حاجة إلى نهج جديدة لاستعادة ب خلايا الشامل. في هذا التقرير، ونحن تصف طرق للاستفادة من مزايا ناقلات HDAd لإحداث نقل الجينات من جزيرة النسب، تعريف عامل النسخ، Ngn3 جنبا إلى جنب مع عامل النمو جزيرة، betacellulin للحث على جزيرة neogenesis في مناطق حول الأوعية البابية في الكبد. لتقييم فعالية هذا، من المهم أن تختار الفئران مع ارتفاع السكر في الدم مستقرة وضمان إدراج ضوابط ملائمة دائما. لهذا التجارب نقل الجينات، التعامل مع ناقلات الفارغة وينبغي دائما أن تستخدم الفئران من السكري. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى المعاملة بشكل فردي السكري ميلم يقدم لاختبار مساهمة فردية من هذه الجينات اثنين في جزيرة neogenesis. كما يدل على أن البيانات المتوفرة لدينا Ngn3 وحدها كافية لإحداث جزيرة neogenesis، ولكن إضافة عامل النمو، بى تى سى، ويعمل على زيادة استجابة مما يؤدي إلى تحريض قوية من neogenesis جزيرة. من المهم أيضا لاختبار أن يتحقق في الواقع تعبير ناقلات في النسيج المستهدف، والكبد وأيضا لإثبات أن يعاير الأنسولين في بلازما الفئران التي عولجت من لا يأتي من الجزر المتبقية في البنكرياس، من خلال إظهار عدم وجود البنكرياس الجزر في الفئران من السكري.
وباختصار، فإن الاستفادة من نظام HDAd النواقل لنقل الجينات يكمن في قدرتها الاستنساخ عالية، تنبيغ كفاءة والتعبير الجيني طويلة دائم في الكبد مع الحد الأدنى للسمية المزمنة وكذلك طبيعتها التكامل عدم الجينوم المتجه إلى المضيف كروموسوم. القيود الرئيسية هي الخطوات المعقدة التي تنطوي عليها الجيل ولهافي الجسم الحي يقتصر تطبيق في المقام الأول إلى الكبد المصلي مع الإعلان الأكثر شعبية 5. يمكن أن يتسبب جزيرة neogenesis لاستعادة كامل الانسولين البلازما وتحمل الجلوكوز في الفئران من السكري عن طريق حفز جزيرة neogenesis في الكبد عن طريق نقل الجينات من عامل النسخ جزيرة النسب-تحديد وNgn3 جنبا إلى جنب مع عامل النمو جزيرة، betacellulin. في هذا التقرير، وتبين لنا البروتوكول الأمثل لتوليد عالية الجودة HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى، وشرح تقنيات للحث وتقييم neogenesis جزيرة في كبد الفئران من السكري ارتفاع السكر في الدم لعكس.
الحاشية: والنواقل الفيروسية وخطوط الخلايا الموصوفة هنا متاحة من كور مختبر النواقل وإنتاج مركز أبحاث السكري، كلية بايلور للطب ( http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm؟pmid=7731 ). بعض مجموعات تجارية وتتوفر أيضا لتوليد فيروسات HDAd (مثل Microbix biosystEMS وشركة).
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة: R03 DK089061-01 (VKY)؛ NIH: K08 DK068391 (VKY)؛ السكري والغدد الصماء ومركز أبحاث-(DERC - P30DK079638) في كلية بايلور للطب، منحة التجريبية والجدوى من وDERC (VKY)؛ مؤسسة أبحاث السكري الأحداث: JDRF جائزة # 5-2006-134 (VKY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProFectionR Mammalian Transfection kit | Promega | E1200 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | |
| PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROX | Quanta Biosciences | 95055-500 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| MEM powder | Invitrogen | 61100087 | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | 15140122 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hygromycin B | Sigma | H0654-1G | |
| MEM EAGLE JOKLIK | Sigma | M0518-10L | |
| Rnase | Roche | 10109169001 | |
| DNase I, grade II | Roche | 10104159001 | |
| Streptozocin | Sigma | s0130 | |
| Glass spinner flasks | Corning | 4500-3L | |
| Glass spinner flasks | Corning | 4500-250 | |
| Slide A-lyzer casset | PIERCE CH | PI66380 | |
| Tube optiseal poly allomer, 11.2 ml | Beckman Coulter | 362181 | |
| Cesium chloride 1 kg | JT4042-2 | VWR | |
| Beckman LE-80K | Beckman Coulter | Optimal LE-80K ultracentrifuge | |
| Filter | VWR | 28143-338 | |
| centrifuge tube 500 ml | Corning | 431123 | |
| tailveiner restrainer | Braintree scientific , INC | tv-150 | |
| Insulin, Mouse ELISA | Mercodia | 10-1247-01 | |
| microvette CB300 | Sarstedt | 16.443.100 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Mouse C-peptide ELISA Kit | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | #631-07231 | |
| guinea pig anti-insulin antibody | Abcam | ab7842 | |
| goat anti-Pdx1 antibody | gift from Dr. Christopher Wright | ||
| mouse anti Ngn3 antibody | Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania |
AB2013 | |
| mouse anti Nkx6.1 antibody | Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania |
F64A6B4 | |
| anti- betacellulin antibody | Cell Sciences | PAAQ1 | |
| ALT (SGPT) Color Reagent SET. | Teco Diagnostics | A526 - 120 | |
| AST/(SGOT), Color Endpoint Reagent Set | Teco Diagnostics | A561-120 | |
Table 2. Specific Reagents and Equipment. |
|||
References
- Parks, R. J. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).
- Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).
- Belalcazar, L. M. Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Circulation. 107, 2726-2732 (2003).
- Oka, K. Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor. Circulation. 103, 1274-1281 (2001).
- Nomura, S. Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).
- Ng, P. A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).
- Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).
- Oka, K., Chan, L. Helper-Dependent Adenoviral Vectors. Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).
- Yechoor, V. Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes. Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).
- Yechoor, V. Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice. Endocrinology. , (2009).
