Neo-Islet formationen i leveren af ​​diabetiske mus med Hjælper-afhængig adenovirusvektor-medieret genoverførsel

Summary

Vi beskriver hepatisk neo-ø-dannelse i STZ (streptozotocin)-inducerede diabetiske mus ved genoverførsel af Neurogenin3 (Ngn3) og betacellulin (BTC) under anvendelse af hjælper-afhængige adenovirusvektor (HDAd) og tilbageførsel af hyperglykæmi. Vores metode tager fordele hjælper-afhængige adenovirusvektorer med deres meget effektiv in vivo transduktion og den langvarige genekspression.

Abstract

Type 1 diabetes er forårsaget af T-cellemedieret autoimmun ødelæggelse af insulinproducerende celler i bugspytkirtlen. Indtil nu insulinerstatning er stadig den vigtigste terapi, fordi ø-transplantation er blevet begrænset af donor tilgængelighed og af behovet for langvarig immunsuppression. Induceret islet Neogenesis ved genoverførsel af Neuogenin3 (Ngn3), ø-slægt-definerende specifik transkriptionsfaktor og betacellulin (BTC), en ø-vækstfaktor har potentialet til at kurere type 1 diabetes.

Adenovirusvektorer (Ads) er meget effektive genoverførselsvektor, men tidlig generation Ads har flere ulemper til anvendelse in vivo. Hjælper-afhængige annoncer (HDAds) er de mest avancerede annoncer, der blev udviklet for at forbedre sikkerheden profilen af tidlig generation af annoncer og forlænge transgenekspression ^1. De mangler kronisk toksicitet, fordi de mangler virale kodningssekvenser ^2-5 og bevarer kun Ad cis elements nødvendige for vektor replikation og pakning. Dette tillader kloning af op til 36 kb gener.

I denne protokol, beskriver vi den metode til at generere HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC og at levere disse vektorer i STZ-inducerede diabetiske mus. Vore resultater viser, at co-injektion af HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC inducerer 'neo øer "i leveren og vender hyperglykæmi i diabetiske mus.

Protocol

1. Klone terapeutiske gener i HDAd Shuttle Vector

1. Klon muse Ngn3 og BTC cDNA'er ind i pLPBL1 plasmidvektor, der indeholder en allestedsnærværende forlængelsesfaktor-1-promotoren (BOS) og et poly A signal. Efter endt kontrollere vektorer ved sekvensanalyse og derefter subklone disse ekspressionskassetter ind pΔ28 HDAd shuttle plasmid ^6.
2. Fordøje HDAd shuttlevektorer by Pmel at frigive plasmidskelettet, oprense DNA'er med phenol / chloroform / isoamylalkohol-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning og rekonstitueres med transfektion-kvalitetsvand.

2. Hjælper-afhængig adenovirusvektor Production

HDAd vektor produktion omfatter flere skridt, der skal følges nøje for at opnå optimale resultater.

2,1 Transfektion

1. To dage før transfektion, frø 116 celler ⁷ til 6 cm skål for at nå 70-80% konfluente på dagen for transfektion.
2. Tre timer før transfektion, fjern medium og tilsættes 5 ml frisk vækstmedium [MEM suppleret med 10% FBS og 1% PSG (penicillin, streptomycin og glutamin), Invitrogen].
3. Transficere 116-celler med 10 ug DNA fra trin 1,2) ved anvendelse af ProFectionR Mammalian Transfection kit fra Promega i overensstemmelse med producentens anvisninger.
4. Den næste dag vaskes cellerne med 1 ml vækstmedium 2 gange. Tilføj hjælpevirus (HV) ved 500 vektorpartikler (VP) / celle til 0,1 ml PBS indeholdende calcium og magnesium (PBS + +) og overlay til cellerne. Vip forsigtigt retterne at fordele HV hver 10 min.
5. Efter 60 min, tilsæt 1,5 ml vedligeholdelsesmedium (MEM, 5% FBS, 1% PSG).
6. Tilføje en anden 1 ml vedligeholdelsesmedium den næste dag.
7. Observere celler for CPE (cytopatisk virkning - celler bliver afrundet og løsnet). Mere end 80% af cellerne bør vise CPE 2 dage efter infektion.
8. Collect råt cellelysat (CVL, celler og medium), endd 10% volumen på 40% sucrose og opbevares ved -80 ° C. Den CVL er mærket som passage 0 - (CVL-P0).

2,2 vektoramplifikation

1. Freeze (-80 ° C, 3-5 min) / tø (37 ° C, 1-2 min) 3 gange.
2. Overlay 0,5 ml CVL suppleret med HV ved 200 VP / celle til konfluente 116 celler i 6-cm skål, og rock skålen forsigtigt hver 5 min. Efter 30 min tilsættes 1 ml vedligeholdelsesmedium.
3. Tilsættes 1 ml vedligeholdelsesmedium næste dag. 2 dage senere, skal de fleste af cellerne udviser CPE.
4. Opsaml CVL og opbevares ved -80 ° C (CVL-P1) som beskrevet for trin 2.1.8).
5. Gentag proceduren for 3 gange for at få den CVL P2-P4.
6. Ekstrahere DNA (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) fra 0,2 ml CVL indsamlet ved P1-P4, og analysere vektoren amplifikation ved qPCR hjælp af HV-og HDAd-specifikke primere (Tabel 1). Brug passage, hvor HDAd eksponentielt amplificeres i forhold til HV (P3 i figur 2) for subsequent procedure.
7. Co-inficere 90% konfluente 116 celler i 15 cm skål med 0,5 ml CVL og HV ved 200 vp / cell. Rock the skålen forsigtigt hver 5 min. Efter 30 minutter tilsættes 10 ml af vedligeholdelse medium.
8. Der tilsættes 5 ml vedligeholdelsesmedium efter 24 timer.
9. Opsaml cellerne ved centrifugering ved 1500 x g i 5 min præcis 48 timer efter infektion.
10. Resuspender cellerne i 1 ml PBS + + indeholdende 4% saccharose (P5) og fryses ved -80 ° C.

2,3 storstilet HDAd produktion

1. Til fremstilling 116 celler til infektion i suspension cellekultur, overfører konfluente 116 celler i 8 x 15 cm skål i 3 L spinner kolbe og tilsættes suspensionen vækstmedium (Joklik modificeret MEM suppleret med 5% FBS, 0,1 mg / ml hygromycin og 1% PSG) til endelig 1 L, og inkuber i _en CO2-inkubator med spinning ved 60 rpm ^8.
2. Tilsættes 0,5 liter frisk medium hver dag i 2 dage (total 2 L).
3. Tæl cellerne på den tredje dag. Celler er klar til at bruge, hvis nå to samlede celleantal på ^1x10-9.
4. Fryse / tø P5 3 gange.
5. Indsamle celler fra 3 L spinner kolbe ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min. Gem 100 ml supernatant for at resuspendere cellerne.
6. Overføre cellerne til en 250 ml spinner kolbe. Tilføj P5 og HV ved 200 VP / celle til celler og inkuberes i 1 time ved 37 ° C ved 60 opm.
7. Overfør celler og medium til 3 L spinner kolbe, der tilsættes 2 L suspension vækstmedium. Overføres 1 ml cellesuspension til en brønd i en plade med 12 brønde til at observere cellerne for CPE.
8. Inkubér cellerne i spinner kolbe i 2 dage i _en CO2-inkubator ved 60 rpm.
9. Opsaml cellerne ved centrifugering og genopslæmmes med 15 ml 100 mM Tris-HCI (pH 8,0) og opbevares ved -80 ° C (P6) til oprensning.

2,4 Vector oprensning

1. Tilsæt 1,0 ml 5% natriumdeoxycholat til P6. Bland forsigtigt og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
2. Tilsættes 400 pi 2 M _MgCl2, 300 μl af RNase A (10 mg / ml), og 300 ul DNase I (10 mg / ml) og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
3. Centrifuger ved 6000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur for at samle bundfald.
4. Steriliser NVT 65 ultracentrifuge rør (Beckman) under UV-lys i 1 time i vævskultur hætte.
5. Tilsættes 2,8 ml af lav densitet CsCI-opløsning (1,25 g / ml), underlag 2,8 ml højdensitet CsCI density opløsning (1.41g/ml) og derefter overlay 5-6 ml supernatant at fylde røret til halsen. Anvende 100 mM Tris-HCI (pH 8,0) for at fylde røret hvis det er nødvendigt.
6. Centrifuge ved 10 ° C i 30 minutter ved 50.000 rpm ved 10 ° C med Beckman LE-80K ved hjælp NVT-65 rotor.
7. Tør området med 70% ethanol for nålestik, og indsamle den nedre opaliserende bånd med en 3-ml sprøjte med 22-G kanyle om side punktur (figur 3a). Nogle gange kan en meget svag hjælper band kan ses under mere fremtrædende vektor band. Prøv at få så meget af the vektor band som muligt, uden at det hjælper bandet. Det er acceptabelt på dette trin, selvom nogle af hjælper-båndet aspireres, som det vil blive adskilt på den efterfølgende overnight centrifugering som følger.
8. Placer de indsamlede bånd ind i en ny steriliserede ultracentrifuge rør. Fyld rørene til halsen ved overlejring 1,35 g / ml CsCl densitet opløsning.
9. Centrifuge ved 10 ° C ved 50.000 rpm natten over. Opsaml opaliserende bånd (figur 3b).
10. Overfør bandet ind i en dialyse kassette (Slide-a-Lyzer, 10.000 MWCO, Thermo-videnskabelig).
11. Dialyseres mod 3 liter autoklaveret 10 mM Tis-HCl, pH 7,2 indeholdende 2 _mM MgCl2 og 4% sucrose ved 4 ° C natten over.
12. Fjern HDAd vektor fra dialyse kassette. Portion 20 ul for fysisk titer og 50 gl for DNA karakterisering. (Bemærk: For Ngn3 vektor, "P6" tre gange gentage at opnå tilstrækkelig vektor da udbyttet af HDAd-Ngn3 er fattige sammenlignet med HDAd-BTC eller HDAd-tom.)

2,5 Karakterisering af HDAd vektorer

1. Bestemme den fysiske titer (vp / ml) under anvendelse af optisk densitet (OD). Tilsættes 20 ul vektor eller 20 pi dialysepuffer til 380 pi TE-buffer indeholdende 0,1% SDS og inkuberes ved 56 ° C i 20 minutter. Måle OD ved 260 nm. Den fysiske titer = OD260 x 1.1 x 10 ¹² x 20 (VP / ml).
2. Analyser HV forurening med qPCR. Brug 50 pi alikvot at ekstrahere DNA under anvendelse DNeasy væv / blod-DNA ekstraktion kit (Qiagen). Fortynd DNA 1000 gange og tage 5 pi for qPCR analyse ved anvendelse af hjælper-og vektor-specifikke primere (Tabel 1). Hjælper-forurening skal være mindre end 1%, som vist i figur 4A.
3. Brug Southern blot at analysere vektor struktur. Udføre Southern blot-analyse ^{10 under} anvendelse af en probe for det omvendte terminale gentagelse (ITR). The repræsentativt resultat er vist i figur 4B.
4. Bestemme in vitro-effekten. Infect kendtAntallet af 116 celler i en 12 brønds plade med HDAd vektor ved 1000 VP / celle i fire eksemplarer. Cellerne høstes efter 48 timer og ekstrahere RNA for at bestemme ekspression af Ngn3 og BTC mRNA'er ved qRT-PCR (tabel 1). Repræsentative resultater er vist i figur 5.

3. Behandling af diabetiske mus med HDAd-Ngn3 og-BTC

3,1 Induktion af diabetes i mus og injektion af HDAd vektorer

1. Fremstilling af STZ: Forbered 0,1 M citratbuffer, og justere pH til 4,3-4,5. Der filtreres det gennem et 0,22 mm sprøjtefilter. Under anvendelse af sterilt vand, fortyndes dette i 0,01 M Na-citrat pH 4,2 til 4,5. Opløs passende mængde STZ (Sigma) i denne opløsning til opnåelse af en slutkoncentration på 12,5 mg / ml. Ved denne koncentration er der ingen udfældning. Holde denne STZ opløsning ved 4 ° C indtil brug. Bringe temperaturen af ​​den indsprøjte opløsningen til stuetemperatur umiddelbart før injektion. Den STZ løsning skuldred være forberedt frisk hver dag og injiceres inden 5-10 min for at blive opløst.
2. Indsprøjtes denne STZ opløsning intraperitonealt (10 ul / g for at opnå en dosis på 125 ug / g legemsvægt), om aftenen mellem 5-7 pm (før lyset slukkes i mus anlægget og musene begynder at fodre aktivt), på to konsekutive dage ^9.

3,2 Overvågning mus glucose og injektion af HDAd vektorer.

1. Hurtige mus i 6 timer og måle kropsvægt og blodglucose ugentligt indtil mus har hyperglykæmi (≥ 250mg/dl). Brug en One Touch glucometer for blod indsamlet af hale snip. Når blodglucose er ≥ 250 mg / dl, kontrolleres blodglucose igen i 48 timer efter en 6 timers hurtigt at sikre vedvarende hyperglykæmi og blodglucose er inden for målområdet for behandling: 250-500 mg / dl.
2. Behandling af mus med vedvarende hyperglykæmi ved en enkelt intravenøs injektion af HDAd vektorer via halevenen. Den totale vektor dosis er 6x10 ¹¹ vpfor alle behandlingsgrupper (i 0,25 ml): 5x10 ¹¹ VP Ngn3 en x10 ¹¹ VP BTC for kombination gruppe, 5x10 ¹¹ VP Ngn3 + 1x10 ¹¹ vp for Ngn3 gruppe, og 1x10 ¹¹ VP Btc + 5x10 ¹¹ VP tom vektor for BTC-gruppen og 6x10 ¹¹ vp tom vektor til kontrolgruppen.
3. Haleveneinjektion. Put mus i Tailveiner harpiksstopperen (TV-150, Braintree Scientific Inc.), og bruge varmt vand til at spile halevenerne, rengøre halen med 70% alkohol. Hold hale under injektionsstedet mellem tommel-og pegefinger af hånden, skal du bruge en anden hånd til injektion. Før injektion sørge for der er ingen bobler i sprøjten (ved hjælp af 30 ^1/2 G kanyle og 1 ml sprøjte). Sæt nålen og sprøjt vektoren langsomt. Hvis nålen er i venen, kan en flash af blod ses i navet af nålen og ligeledes er der ingen modstand under injektion. Efter kanylen er fjernet, skal du holde injektionsstedet med gaze til at stoppe blødninger før han vendte tilbage mus to bur.
   Hvis nålen ikke er i venen er betydelig modstand mod injektion og en lille subkutan vabler opstår. På dette tidspunkt fjernes kanylen, og prøv igen på et andet sted.

3,3 Analyse af effekter af HDAd-Ngn3 + HDAd-BTC behandling.

1. Monitor 6 timer fastende glukose og kropsvægt ugentligt efter vektor behandling.
2. Indsaml blod fra saphenavene eller hale vene i benet hver 2 uger til assay insulin (Mouse Insulin ELISA kit, Mercodia) og leverenzymer (AST og ALT Infinity Reagents, Thermo Scientific) ved hjælp af kommercielle kits.
   1. Den placeres i et ikke-reducerede 50 ml Falcon-rør med huller lavet i den lukkede ende.
   2. Musens hoved er ved den lukkede ende af røret og ben og hale ved den åbne side af røret. At opsamle blod fra det venstre ben, strækker det venstre ben ydersiden af ​​røret og forsigtigt tryk huden af ​​låret mellem tommel-og pegefinger til immobilisering af benet.
   3. Brugen barbermaskine til at fjerne hår fra skinnebenet / underbenet område, for at blotlægge vena saphena, som er til stede på den laterale side af underbenet. Rens barberet hud med 70% alkohol og lad det tørre.
   4. Punktere saphenavene med en 25 gauge nål, opsamles blodet med Microvette CB300 rør (Sarstedt) og sætte rørene på isen.
   5. Tryk indstiksstedet med gaze til at stoppe blødninger før han vendte tilbage musene til bur.
   6. Centrifuger rørene ved 3000 x g i 5 minutter, tager supernatanten og opbevares ved -20 ° C til yderligere analyse.

3,4 Udfør glucosetolerancetest (GTT) efter 6 uger efter behandlingen.

1. Opløst D-glucose (Sigma) i destilleret vand op til 15% glucose (15 g / 100 ml) og sterilt filter for glucose.
2. Hurtige mus i 6 timer. Bruge varmt pad at varme musene og opsamle blodet (0 min tidspunkt). Derefter injicere 1,5 g / kg D-glucose ip (10 ul / g på 15% glucose).
3. Collect blod ved 15, 30, 60, 120 min.
4. Måle glucose og insulin i alle disse prøver.

3,5 Tissue analyse for at vurdere ekspressionen af ​​vektorerne og vurdere induktion af ø-Neogenesis.

I alle disse trin den kontrol, der kræves for pålideligt fortolke resultaterne omfatter: (1) tom vektor behandlet diabetiske mus (2) ikke-diabetiske mus og (3) ikke-diabetisk pancreas tjener som en positiv kontrol for ekspression af holmen specifikke hormoner og transkriptionsfaktorer.

1. Høst lever og pancreas ved 3 og 6 uger efter behandlingen. Deler sig i to stykker, den første til lynfrysning i flydende nitrogen og opbevaring ved -80 ° C for RNA-og protein-ekstraktion, og det andet at løse med 10% formalin natten over til immunohistokemi analyse.
2. Uddrag RNA ved en standard-protokol og analysere udtryk for ø-specifikke hormoner og transkriptionelle faktorer, sammen med Ngn3 og BTC til bekræftelsem vektor ekspression i leveren ved qRT-PCR under anvendelse af specifikke primere ^{9, 10.}
3. Uddrag insulin og C-peptid fra leveren ved syre-ethanolekstraktion fremgangsmåde og kvantificere med et kommercielt ELISA-kit (ultra sensitive Insulin-assay, Mercodia, C-peptid-ELISA-kit, Wako).
4. Udføre immunfarvning for ø-specifikke hormoner (insulin, glucagon, PP, SST) sammen med ø-specifikke transkriptionsfaktorer i paraffin indlejrede sektioner ^{9, 10.} Ekspressionen af ​​Ngn3 og BTC kan også bekræftes ved immunfarvning.

4. Repræsentative resultater

Vi klonede Ngn3 og Btc cDNA i pΔ28 vektorer drevet af allestedsnærværende promoter eIF2a (BOS) og genererede HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC. Som vist i figur 2, relativ HV kontaminering faldet betydeligt (hvilket indebærer en mere vektoramplifikation og mindre hjælper-amplifikation) ved passage 3. Derfor brugte vi P3 til efterfølgende vektor produktion. Efter den førsteCsCI diskontinuerlig gradient og ultracentrifugering indsamlede vi det laveste vektor-båndet og derefter opsamlet den opaliserende bånd svarende til HDAd vektor i den anden ultracentrifugering (figur 3). Det oprensede HDAd vektoren havde mindre end 1% af HV kontaminering (figur 4A) ved qPCR og havde ingen hjælper kontaminering synlig på Southern blotting (figur 4B), hvilket indikerer tilstrækkelig kvalitet til vektor infusion i mus. Yderligere analyse omfattede transgenekspression ved infektion af 116 celler. MRNA-ekspressionsniveauer af Ngn3 og BTC var højere i vektor inficerede celler med over 10.000 gange sammenlignet med dem i ikke-inficerede celler (fig. 5).

HDAd-Ngn3 og-BTC blev derefter administreret til STZ-inducerede diabetiske mus via haleveneinjektion med tom vektor injiceret og HDAd-BTC injicerede diabetiske mus tjener som negativ kontrol. Hyperglykæmi blev vendt og glucose-stimuleret insulinsekretionblev gengivet i mus behandlet med både HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC, men ikke hos mus behandlet med enkelt gen vektor eller kontrol tom vektor (figur 6). Den HDAd-Ngn3-BTC behandling induceret islet Neogenesis og dette blev kvantificeret ved at analysere total insulin og C-peptid indhold (fig. 6E) med ikke-diabetiske, diabetiske tom vektor behandlede mus tjener som kontrol. Tilstedeværelsen af ​​C-peptid og insulin i ækvimolære forhold bekræfter, at insulin detekteres i leveren faktisk bliver syntetiseret i leveren. RT-qPCR bekræftede, at leveren i HDAd-Ngn3-BTC behandlede mus udtrykte alle de ø-specifikke hormoner og transkriptionsfaktorer ^9. Immunhistokemi viste insulin positive celler i leveren hos mus behandlet med HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC, men ingen insulin positive celler blev observeret hos mus behandlet med kontrol-vektor (fig. 7). Vi bekræftede også, at der ikke var nogen tilbageværende øer i pancreas af Ngn3-BTC treated mus i sammenligning med de mange øer i ikke-diabetisk pancreas. Vektor (Ngn3 og BTC) sammen med ø-specifik slægt transkriptionsfaktor (PDX-1 og Nkx6.1) ekspression blev også vurderet ved immunofarvning af leveren (figur 7).

Fig. 1. Rutediagram over genterapi af diabetiske mus med hjælper-afhængige virus system. Først Ngn3 og BTC, i en kassette drevet af en allestedsnærværende BOS promotor, klonet er i HDAd shuttlebus (pΔ28) vektorer. HDAd fremstilles af adskillige trin, herunder transfektion, seriepassager af amplifikation, og en omfattende infektion efterfulgt af vektor oprensning. Efter karakterisering af kvaliteten, er HDAds injiceret intravenøst ​​i STZ-inducerede diabetiske mus via halevenen. Virkningerne af behandlingen bedømmes ved måling glucose, legemsvægt, GTT, og ved analyse af genekspressioni leveren.

Figur 2. Bestemmelse HDAd vektoramplifikation. DNA ekstraheres fra passagen P0 til P4 anvendelse af DNA ekstraktion kit (Qiagen). DNA fortyndes 1000 gange, og 5 pi DNA anvendes til real time PCR (qPCR). Helper og vektor-specifikke primere anvendes. Standardkurver dannes ved seriefortyndinger (10 ^-5 til 1 ng / ml) af HDAd shuttlevektor plasmid-og HV plasmid (topfelter). Anvendelse af standardkurverne og Ct-værdierne for vektoren og hjælpeviruset kopital beregnes, og forholdet mellem HDAd / HV er plottet som en procentdel af det samlede virus (helper + HDAd). Derfor er relativ vektoramplifikation beregnes som: [vektor kopital / (vektor + hjælpevirus kopital)]. I det viste eksempel (bundpanel) HDAd vektoramplifikation plateaued ved P4, medens den relative HDAd / HV stiger med P3. Derfor P3 er valgt til det efterfølgende trin.

Figur 3. Repræsentative HDAd vektor bånd efter diskontinuerlig CsCl densitets-ultracentrifugering. HDAd vektoren er oprenset fra en 3L spinner kultur over sekventielle CsCI densitetsgradient. (A) Efter første densitetsgradientultracentrifugering, er en enkelt opaliserende vektor bånd synligt (pil) under uigennemsigtig cellerester (CD). Den opaliserende bånd (pil) opsamles for det andet densitetsgradientcentrifugering. (B) Efter den anden densitetsgradientultracentrifugering er opaliserende bånd (pil) opsamles til dialyse.

Fig. 4. Analyse af hjælpevirus-kontaminering. DNA ekstraheres fra 50 pi oprenset virus og hjælper-forurening er etssessed som i figur 2. Figuren viser hjælper forurening af HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC er mindre end 1%.

Figur 5. Analyse af strukturen af HDAd vektor. Southern blot udføres som beskrevet tidligere (Oka K, et al.). Bane 1: DNA fra hjælper virus, bane 2: DNA fra P3, bane 3: DNA fra P4, bane 4: oprenset vectopr. Åbne pile angiver hjælpevirus afledte bånd og de udfyldte pile angiver ITR bånd afledt fra HDAd vektor.

Figur 6. Ekspressionsniveauet af Ngn3 eller BTC i 116-celler inficeret med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC vektor. 116 celler i en 12 brønd plader inficeres med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC eller tom vektor ved 1000 VP / celle i 2 dage. CeLLS høstes, og totalt RNA ekstraheres ved hjælp af Trizol-reagens. qRT-PCR udføres under anvendelse af Ngn3-eller BTC-specifikke primere. Den relative Ngn3 eller BTC mRNA ekspression steg med over 10.000-fold i celler inficeret med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC. Figuren er genoptrykt fra Dev.Cell 2009 Mar; 16 (3): 358-73, Yechoor et. al., med tilladelse fra Elsevier.

Fig. 7. Genoverførsel af HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC til STZ-inducerede diabetiske mus fører til tilbageførsel af diabetes og induktion af ø Neogenesis i leveren. (A) Plasmaglucose og (B) legemsvægt STZ-inducerede diabetiske mus behandlet med HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC. (C) Plasma glucose og insulin i en IP-GTT ved 6 uger efter behandlingen. (D) repræsentant insulin farvning i leveren 12 uger efter behandlingen. * P <0,05 (versus tom vektor gruppe). Figuren er genoptrykt fra Dev. Cell 2009 Mar; 16 (3): 358-73, Yechoor et al, med tilladelse fra Elsevier..

navn	fremadrettet primer	reverse primer
helper	GACCATCAATCTTGACGACC	ATGTCGCTTTCCAGAACCC
vektor	TTGGGCGTAACCGAGTAAG	ACTTCCTACCCATAAGCTCC
Ngn3	AAGAGCGAGTTGGCACTCAG	TCTGAGTCAGTGCCCAGATG
BTC	GCACAGGTACCACCCCTAGA	TGAACACCACCATGACCACT

Tabel 1. Primersekvenser.

Discussion

HDAds er blevet udviklet for at overvinde svagheden ved tidlig generation annoncer og udnytte til genterapi applikation. De tekniske udfordringer. For eksempel kræver HDAd HV for HDAd emballage og vektor forstærkning er ikke så effektiv som tidlige generation annoncer. HV er en første generation Ad og enhver forurening af HV kompromis effektiviteten af ​​HDAd. Derfor meget effektiv transfektion og optimale betingelser for hver seriel passage er kritiske. En anden kritisk parameter for vektor produktionen hvilken passage (P1-P4) bør anvendes til efterfølgende passage 5, der anvendes direkte som inokulum til suspensionsceller. Til vores erfaring, opnås de bedste resultater opnås ved anvendelse af passagen, hvorved HDAd vektor andel forøges dramatisk i den følgende passage (P3 i figur 2). Udbyttet af HDAd vektorer afhænger af transgene kassetter. Under vektorproduktion er begge transgener udtrykt fordi begge gener er underallestedsnærværende promoter. Ngn3 er en transkriptionsfaktor og BTC er en vækstfaktor, hvilket antyder, at HDAd vektor der udtrykker transkriptionsfaktor som kan påvirke cellelinie inhiberer vektoramplifikation, mens der udtrykker væksthormon hjælper i vektor replikation og pakning.

Med diabetes antager epidemiske proportioner, er nye tilgange til at genoprette b-cellemasse nødvendig. I denne rapport, beskriver vi fremgangsmåder til at udnytte fordelene ved HDAd vektorer for at bevirke genoverføring af ø-slægt-definerende transskriptionsfaktor, Ngn3 sammen med ø-vækstfaktor, til betacellulin inducere ø Neogenesis i periportale områder af leveren. At vurdere effektiviteten af ​​dette, er det vigtigt at vælge mus med stabil hyperglykæmi og sikre, at passende kontrol altid er indbefattet. Til dette gentransferstoffer eksperimenter behandledes den tomme vektor diabetiske mus bør altid anvendes. Hertil kommer, individuelt med HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC behandlet diabetisk mice tjener til at teste individuelle bidrag af disse to gener i ø Neogenesis. Da vore data viser, at Ngn3 alene er tilstrækkeligt til at inducere ø Neogenesis, men tilsætning af vækstfaktoren, BTC, tjener til at forøge svar fører til robust induktion af ø-Neogenesis. Det er også vigtigt at teste, at vektoren ekspression rent faktisk opnås i målvævet, leveren og også at vise, at insulin analyseret i plasmaet hos behandlede mus ikke kommer fra resterende øer i bugspytkirtlen, ved at demonstrere fravær af pancreas øer i diabetiske mus.

Sammenfattende ligger fordelen ved HDAd-vektor-system til genoverførsel i sin høje kloning kapacitet, effektiv transduktion og langvarig genekspression i leveren med et minimum af kroniske toksicitet såvel som dens karakter ikke integration af vektor genomet i værten kromosom. De primære begrænsninger er de komplekse trin, der er involveret i dets dannelse ogin vivo applikation er primært begrænset til leveren med de mest populære Ad serotype 5. Islet Neogenesis kan induceres til at genskabe plasmainsulin og glucosetolerance hos diabetiske mus ved at inducere ø Neogenesis i leveren ved genoverførsel af ø-slægt-definerende transskriptionsfaktor, Ngn3 sammen med ø-vækstfaktor, betacellulin. I denne rapport, viser vi den optimale protokol til at generere høj kvalitet HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC, og demonstrere teknikker til at fremkalde og vurdere ø Neogenesis i lever fra diabetiske mus for at vende hyperglykæmi.

Fodnote: De virale vektorer og cellelinier beskrevet her er tilgængelige fra Vector Production Core Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731 ). Nogle kommercielle kits er også tilgængelige til at generere HDAd vira (f.eks Microbix biosystems Inc.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ProFectionR Mammalian Transfection kit	Promega	E1200
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Qiagen	69504
PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROX	Quanta Biosciences	95055-500
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
MEM powder	Invitrogen	61100087
Penicillin Streptomycin	Sigma	15140122
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
L-glutamine	Invitrogen	25030-081
Hygromycin B	Sigma	H0654-1G
MEM EAGLE JOKLIK	Sigma	M0518-10L
Rnase	Roche	10109169001
DNase I, grade II	Roche	10104159001
Streptozocin	Sigma	s0130
Glass spinner flasks	Corning	4500-3L
Glass spinner flasks	Corning	4500-250
Slide A-lyzer casset	PIERCE CH	PI66380
Tube optiseal poly allomer, 11.2 ml	Beckman Coulter	362181
Cesium chloride 1 kg	JT4042-2	VWR
Beckman LE-80K	Beckman Coulter	Optimal LE-80K ultracentrifuge
Filter	VWR	28143-338
centrifuge tube 500 ml	Corning	431123
tailveiner restrainer	Braintree scientific , INC	tv-150
Insulin, Mouse ELISA	Mercodia	10-1247-01
microvette CB300	Sarstedt	16.443.100
D-glucose	Sigma	G8270
Mouse C-peptide ELISA Kit	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	#631-07231
guinea pig anti-insulin antibody	Abcam	ab7842
goat anti-Pdx1 antibody	gift from Dr. Christopher Wright
mouse anti Ngn3 antibody	Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania	AB2013
mouse anti Nkx6.1 antibody	Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania	F64A6B4
anti- betacellulin antibody	Cell Sciences	PAAQ1
ALT (SGPT) Color Reagent SET.	Teco Diagnostics	A526 - 120
AST/(SGOT), Color Endpoint Reagent Set	Teco Diagnostics	A561-120
Table 2. Specific Reagents and Equipment.