Summary
हम यकृत STZ में गठन नव आइलेट (streptozotocin) neurogenin3 जीन स्थानांतरण (Ngn3) और Betacellulin (बीटीसी) के सहायक निर्भर adenoviral (HDAd) वेक्टर और hyperglycemia के उत्क्रमण का उपयोग द्वारा प्रेरित मधुमेह चूहों का वर्णन हमारे विधि उनके अत्यधिक vivo पारगमन और लंबे समय तक चलने वाले जीन की अभिव्यक्ति में कुशल के साथ सहायक निर्भर adenoviral वैक्टर का लाभ लेता है.
Abstract
टाइप 1 मधुमेह टी सेल की मध्यस्थता अग्न्याशय में इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं के autoimmune विनाश के कारण होता है. अब तक इंसुलिन प्रतिस्थापन अभी भी प्रमुख चिकित्सा है, क्योंकि आइलेट प्रत्यारोपण दाता उपलब्धता और लंबी अवधि प्रतिरक्षादमन के लिए जरूरत से सीमित कर दिया गया है. जीन स्थानांतरण (Ngn3) Neuogenin3 की, आइलेट वंश परिभाषित विशिष्ट प्रतिलेखन कारक और Betacellulin (बीटीसी) द्वारा प्रेरित आइलेट neogenesis, एक आइलेट वृद्धि कारक टाइप 1 मधुमेह का इलाज करने की क्षमता है.
Adenoviral वैक्टर (विज्ञापन) अत्यधिक कुशल जीन स्थानांतरण वेक्टर कर रहे हैं, लेकिन, जल्दी पीढ़ी विज्ञापन vivo उपयोग में लिए कई नुकसान है. हेल्पर निर्भर विज्ञापन (HDAds) सबसे उन्नत विज्ञापन है कि विज्ञापन की जल्दी पीढ़ी की सुरक्षा प्रोफाइल में सुधार और transgene 1 अभिव्यक्ति लम्बा करने के लिए विकसित किए गए हैं. वे पुरानी विषाक्तता की कमी है क्योंकि वे वायरल कोडिंग दृश्यों की कमी 2-5 और केवल विज्ञापन सीआईएस एल बनाए रखने केवेक्टर प्रतिकृति और पैकेजिंग के लिए आवश्यक ements. यह 36 केबी जीन की क्लोनिंग की अनुमति देता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम करने के लिए HDAd Ngn3 और HDAd BTC पैदा करते हैं और STZ प्रेरित मधुमेह चूहों में ये वैक्टर देने की विधि का वर्णन है. हमारे परिणाम बताते हैं कि HDAd Ngn3 और HDAd BTC लाती जिगर में 'नव islets' की सह - इंजेक्शन और मधुमेह चूहों में hyperglycemia पराजयों.
Protocol
1. HDAd शटल वेक्टर में चिकित्सीय जीन क्लोन
- जिसमें एक सर्वव्यापी बढ़ाव कारक -1 (Bos) प्रमोटर और एक पाली एक संकेत pLPBL1 प्लाज्मिड वेक्टर में क्लोन माउस Ngn3 और BTC cDNAs. पूरा होने पर, अनुक्रम विश्लेषण से वैक्टर सत्यापित करने के लिए और फिर pΔ28 HDAd 6 प्लाज्मिड शटल में इन अभिव्यक्ति कैसेट subclone.
- डाइजेस्ट HDAd शटल PmeI वैक्टर प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी जारी, phenol / / क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब इथेनॉल और अभिकर्मक ग्रेड पानी के साथ वर्षा reconstitute द्वारा पीछा निष्कर्षण द्वारा DNAs शुद्ध.
2. हेल्पर निर्भर adenoviral वेक्टर उत्पादन
HDAd वेक्टर उत्पादन के कई कदम है कि ध्यान से इष्टतम परिणामों के लिए पीछा किया जाना चाहिए शामिल है.
2.1 अभिकर्मक
- दो दिन अभिकर्मक, बीज, 6 सेमी डिश में 116 7 कोशिकाओं अभिकर्मक के दिन से पहले के 70-80% सहधारा तक पहुँचने के लिए.
- अभिकर्मक से पहले तीन घंटे, मध्यम हटाने और ताजा विकास के माध्यम से 5 मिलीग्राम जोड़ने [सदस्य 10% FBS और 1% PSG (पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन और Glutamine), Invitrogen साथ पूरक].
- Transfect 1.2 चरण) से 10 ग्राम डीएनए के साथ 116 कोशिकाओं, PROMEGA से निर्माता के निर्देशों के अनुसार ProFectionR स्तनधारी अभिकर्मक किट का उपयोग कर.
- अगले दिन, 1 मिलीग्राम मध्यम विकास के 2 बार के साथ कोशिकाओं धो लो. 500 वेक्टर (उपाध्यक्ष) कणों / सेल में पीबीएस युक्त कैल्शियम और मैग्नीशियम के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें सहायक वायरस (एचवी) (पीबीएस + +) और कोशिकाओं को उपरिशायी. धीरे व्यंजन रॉक करने के लिए समान रूप से वितरित HV हर 10 मिनट.
- 60 मिनट के बाद, रखरखाव मध्यम (सदस्य, 5% FBS, PSG 1%) के 1.5 मिलीलीटर जोड़ने.
- अगले दिन मध्यम रखरखाव के एक और 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- सीपीई के लिए कोशिकाओं (कोशिकाओं गोल और अलग हो कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव) का निरीक्षण. कोशिकाओं के 80% से अधिक संक्रमण के बाद 2 दिनों CPE दिखाना चाहिए.
- कच्चे तेल की सेल (CVL, कोशिकाओं और मध्यम) lysate, जोdd -80 में 40% sucrose और दुकान की मात्रा 10% डिग्री सेल्सियस CVL 0 बीतने के रूप में चिह्नित है (CVL P0).
2.2 वेक्टर प्रवर्धन
- रुक (-80 डिग्री सेल्सियस, 3-5 मिनट) / पिघलना (37 डिग्री सेल्सियस, 1-2 मिनट) 3 बार.
- ओवरले 0.5 मिलीलीटर CVL HV साथ 200 vp / सहधारा 116 कोशिकाओं को सेल में 6 सेमी डिश में पूरक और पकवान धीरे हर 5 मिनट रॉक. 30 मिनट के बाद, 1 मिलीग्राम रखरखाव मध्यम जोड़ने.
- रखरखाव मध्यम अगले दिन के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 2 दिन बाद, कोशिकाओं के सबसे CPE दिखाना चाहिए.
- -80 ° (CVL P1) सी के रूप में 2.1.8 कदम के लिए वर्णित) CVL और स्टोर ले लीजिए.
- P2-P4 CVL पाने के लिए 3 बार के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ.
- CVL एकत्र की 0.2 मिलीग्राम से P1-P4 डीएनए (DNeasy रक्त और ऊतक किट, Qiagen), निकालें और qPCR द्वारा वेक्टर प्रवर्धन HV और HDAd विशिष्ट प्राइमरों (1 टेबल) का उपयोग का विश्लेषण. मार्ग में जो तेजी से HV के सापेक्ष प्रवर्धित HDAd subsequen (2 चित्रा में पी 3) का प्रयोग करेंप्रक्रिया टी.
- 200 वी.पी. / सेल में 15cm पकवान में 90% सहधारा 116 कोशिकाओं 0.5 मिलीलीटर CVL और HV के साथ सह - संक्रमित. पकवान रॉक धीरे हर 5 मिनट. 30 मिनट के बाद, रखरखाव माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ने.
- 24 घंटे के बाद रखरखाव माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
- Centrifugation द्वारा कोशिकाओं 5 मिनट वास्तव में संक्रमण के बाद 48 घंटे के लिए 1500 XG में ले लीजिए.
- पीबीएस + + युक्त 4% (P5) sucrose और -80 पर फ्रीज ° सी. के 1 मिलीलीटर में पुनः को निलंबित कोशिकाओं
2.3 बड़े पैमाने HDAd उत्पादन
- निलंबन सेल संस्कृति में संक्रमण के लिए 116 कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, 3 एल स्पिनर फ्लास्क में 8 x 15-सेमी पकवान में सहधारा 116 कोशिकाओं को हस्तांतरण और निलंबन मध्यम विकास (Joklik संशोधित सदस्य 5% FBS, 0.1 मिलीग्राम / एमएल hygromycin और 1% के साथ पूरक पी एस जी) अंतिम 1 एल, और 60 आठ rpm कताई के साथ एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं.
- ताजा मध्यम 2 दिनों के लिए हर दिन (कुल 2 एल) के 0.5 एल जोड़ें.
- तीसरे दिन कोशिकाओं गिनो. कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए अगर टी तक पहुँचने के लिए तैयार हैंओ 9 1x10 की कुल सेल नंबर.
- फ्रीज / पिघलना करने के P5 3 बार.
- 5 मिनट के लिए 1000 XG पर centrifugation द्वारा 3 एल स्पिनर कुप्पी से कोशिकाओं ले लीजिए. कोशिकाओं को फिर से को निलंबित तैरनेवाला के 100 मिलीलीटर सहेजें.
- 250 मिलीलीटर की एक स्पिनर फ्लास्क कोशिकाओं स्थानांतरण. P5 और HV vp 200 / कोशिकाओं को सेल और 1 घंटे के लिए सेते 37 ° सी 60 rpm पर जोड़ें.
- स्थानांतरण कोशिकाओं और 3 एल स्पिनर कुप्पी के लिए मध्यम, एल 2 निलंबन मध्यम विकास जोड़ने. CPE के लिए कोशिकाओं को निरीक्षण करने के लिए एक 12-अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीग्राम सेल निलंबन स्थानांतरण.
- एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2 दिनों के लिए 60 rpm पर स्पिनर फ्लास्क में कोशिकाओं सेते हैं.
- Centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करने और फिर से 15 मिलीलीटर -80 डिग्री सेल्सियस तक (P6) शुद्धि में 100 मिमी (8.0 पीएच) Tris एचसीएल और दुकान के साथ को निलंबित.
2.4 वेक्टर शुद्धि
- P6 1.0 5% सोडियम deoxycholate के मिलीलीटर जोड़ें. धीरे मिश्रण और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- 2 एम 2 MgCl, 300 μ के 400 μl जोड़ेंके एल RNase (10 मिग्रा / मिली), और DNase मैं (10 मिग्रा / मिली) के 300 μl और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 6000 XG पर अपकेंद्रित्र तैरनेवाला इकट्ठा.
- टिशू कल्चर हुड में 1 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के तहत NVT 65 ultracentrifuge ट्यूब (Beckman) जीवाणुरहित.
- गर्दन को ट्यूब भरने के कम घनत्व (1.25 छ / एमएल) CsCl समाधान, बुनियाद उच्च घनत्व CsCl घनत्व समाधान के 2.8 मिलीलीटर (1.41g/ml) और फिर उपरिशायी तैरनेवाला के 5-6 मिलीग्राम 2.8 मिलीलीटर जोड़ें. 100 मिमी Tris एचसीएल (pH8.0) का उपयोग करने के लिए यदि आवश्यक हो तो ट्यूब को भरने के लिए.
- 10 पर अपकेंद्रित्र ° 50,000 rpm पर 30 मिनट के लिए 10 सी ° सी ले-80K Beckman NVT-65 रोटर का उपयोग करने के साथ.
- सुई पंचर के लिए 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र को साफ कर लें, और एक 3-22-G पक्ष पंचर (चित्रा 3a) सुई के साथ सुसज्जित मिलीलीटर सिरिंज के साथ कम आपल बैंड इकट्ठा. कभी कभी एक बहुत ही बेहोश सहायक बैंड अधिक प्रमुख वेक्टर बैंड के नीचे देखा जा सकता है. वें के रूप में ज्यादा प्राप्त करने की कोशिशई संभव के रूप में वेक्टर सहायक बैंड के बिना, बैंड. यह इस कदम पर स्वीकार्य है, भले ही कुछ सहायक बैंड aspirated है, क्योंकि यह बाद रातोंरात centrifugation है कि इस प्रकार अलग हो जाएगा.
- एक नया निष्फल ultracentrifuge ट्यूबों में एकत्र बैंड रखें. गर्दन 1.35 छ / मिलीलीटर CsCl घनत्व समाधान overlaying द्वारा ट्यूबों भरें.
- 10 ° 50,000 rpm पर रातोंरात सी में अपकेंद्रित्र. आपल बैंड (3b चित्रा) ले लीजिए.
- डायलिसिस कैसेट (स्लाइड - एक - Lyzer, 10.000 MWCO, थर्मो वैज्ञानिक) में बैंड स्थानांतरण.
- Autoclaved 10 मिमी तीस एचसीएल, पीएच 7.2 4 ° C विकेट पर 2 मिमी 2 MgCl और 4% sucrose युक्त 3 एल के खिलाफ Dialyze.
- डायलिसिस कैसेट से HDAd वेक्टर निकालें. अशेष भाजक शारीरिक अनुमापांक और डीएनए लक्षण वर्णन के लिए 50 μl के लिए 20 μl. (नोट: वेक्टर Ngn3 के लिए, "P6" तीन बार दोहराने के लिए पर्याप्त वेक्टर प्राप्त के बाद HDAd - Ngn3 की उपज HDAd BTC या HDAd खाली तुलना में गरीब है.)
HDAd वैक्टर 2.5 विशेषता
- शारीरिक (वी.पी. / एमएल) अनुमापांक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) का उपयोग कर का निर्धारण करते हैं. 380 μl ते बफर करने के लिए 20 मिनट के लिए 0.1% एसडीएस और सेते 56 में डिग्री सेल्सियस युक्त 20 μl वेक्टर या 20 μl डायलिसिस बफर जोड़ें. 260 एनएम पर आयुध डिपो उपाय. शारीरिक अनुमापांक OD260 = 1.1 x 10 12 x 20 x (वी.पी. / एमएल).
- QPCR द्वारा HV संदूषण का विश्लेषण. 50μl अशेष भाजक का उपयोग करने के लिए डीएनए निकालने DNeasy ऊतक / रक्त डीएनए निष्कर्षण किट (Qiagen) का उपयोग करने के लिए. डीएनए 1000-गुना पतला और qPCR विश्लेषण के लिए 5 μl सहायक और वेक्टर विशिष्ट प्राइमरों (1 टेबल) का उपयोग कर ले. सहायक संदूषण 1% से कम हो सकता है, के रूप में 4A चित्रा में दिखाया जाना चाहिए.
- दक्षिणी धब्बा का उपयोग करने के लिए वेक्टर संरचना का विश्लेषण करने के लिए. दक्षिणी धब्बा 10 विश्लेषण औंधा टर्मिनल दोहराने (आईटीआर) के लिए एक जांच का उपयोग कर प्रदर्शन. प्रतिनिधि परिणाम 4B चित्रा में दिखाया गया है.
- प्रभावकारिता में इन विट्रो का निर्धारण करते हैं. में जाना जाता संक्रमितvp 1000 चार प्रतियों में सेल / 116 कोशिकाओं के एक 12 HDAd वेक्टर के साथ अच्छी तरह से थाली में संख्या. 48 घंटा के बाद कोशिकाओं को फसल और शाही सेना को निकालने के लिए qRT पीसीआर (1 टेबल) द्वारा Ngn3 और BTC mRNAs की अभिव्यक्ति का निर्धारण. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 5 में दिखाया जाता है.
3. मधुमेह चूहों के HDAd Ngn3 और BTC द्वारा उपचार
चूहों में मधुमेह के 3.1 प्रेरण और HDAd वैक्टर का इंजेक्शन
- STZ की तैयारी: 0.1M साइट्रेट बफर तैयार है, और 4.3-4.5 पीएच को समायोजित. 0.22 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से इस फ़िल्टर. बाँझ पानी का उपयोग 0.01 एम ना 4.2-4.5 पीएच साइट्रेट इस पतला. (सिग्मा) STZ की उचित मात्रा में भंग करने के लिए इस समाधान में 12.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता हासिल. इस एकाग्रता में कोई वर्षा. 4 में इस्तेमाल किया ° तक सी इस STZ समाधान रखें. कमरे के तापमान को इंजेक्शन लगाने के समाधान के तापमान तुरंत इंजेक्शन के लिए पहले लाओ. STZ समाधान shoulप्रत्येक दिन ताज़ा तैयार है और भंग किया जा रहा 5-10 मिनट के भीतर इंजेक्शन हो.
- शाम को 5-7 बजे से पहले लाइट बंद माउस सुविधा में बदल रहे हैं और चूहों सक्रिय खिला शुरू के बीच में इस STZ समाधान intraperitoneally (10 μl / ग्राम 125 / छ छ शरीर वजन की एक खुराक प्राप्त), सुई, पर दो लगातार 9 दिन.
3.2 निगरानी चूहों और HDAd वैक्टर के ग्लूकोज इंजेक्शन.
- 6 घंटा और उपाय शरीर के वजन और रक्त शर्करा चूहों जब तक साप्ताहिक के लिए फास्ट चूहों hyperglycemia (250mg/dl ≥) है. पूंछ कटाव द्वारा एकत्र रक्त के लिए एक एक टच glucometer का प्रयोग करें. 250-500 मिलीग्राम / डेसीलीटर: एक बार रक्त ग्लूकोज ≥ 250 mg / dl, पुनः जाँच 48 घंटा रक्त फिर से एक 6 घंटा के बाद तेजी लगातार hyperglycemia और रक्त ग्लूकोज इलाज के लिए तय सीमा के अंदर सुनिश्चित ग्लूकोज है.
- पूंछ नस के माध्यम HDAd वैक्टर की एक एकल अंतःशिरा इंजेक्शन के द्वारा लगातार hyperglycemia के साथ चूहों समझो. कुल वेक्टर खुराक 6x10 11 vp है5x10 11 vp Ngn3 + 1x10 Ngn3 समूह के लिए 11 vp; 1x10 11 vp BTC + 5x10 बीटीसी समूह के लिए 11 vp खाली सदिश और 5x10 11 vp Ngn3 एक x10 संयोजन समूह के लिए 11 vp बीटीसी: सभी उपचार समूहों (0.25 मिलीलीटर में) के लिए 6x10 नियंत्रण समूह के लिए 11 वी.पी. खाली सदिश.
- पूंछ नस इंजेक्शन. चूहों Tailveiner restrainer (टी वी-150, Braintree साइंटिफिक इंक) में रखो, और नसों पूंछ को फैलाने के लिए गर्म पानी का उपयोग करने के लिए, 70% शराब के साथ पूंछ साफ. अंगूठे और हाथ की तर्जनी के बीच इंजेक्शन साइट के नीचे पूंछ पकड़ो, इंजेक्शन के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें. इससे पहले इंजेक्शन यकीन है कि वहाँ सिरिंज (30/1 2 जी सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग) में कोई बुलबुले हैं. सुई डालें और वेक्टर धीरे इंजेक्षन. यदि सुई नस में है, खून की एक फ्लैश सुई के केंद्र में देखा जा सकता है और वहाँ भी इंजेक्शन के दौरान कोई प्रतिरोध नहीं है. सुई को हटाने के बाद, धुंध के साथ चूहों टी लौटने से पहले रक्तस्राव को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट पकड़ओ पिंजरे.
यदि सुई नस में नहीं है वहाँ इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण प्रतिरोध और एक छोटे से चमड़े के नीचे खान उठता है. इस समय सुई को हटाने और एक अलग साइट पर फिर से कोशिश करते हैं.
3.3 उपचार के HDAd Ngn3 + HDAd - BTC प्रभाव का विश्लेषण.
- मॉनिटर 6 घंटा उपवास ग्लूकोज और शरीर वेक्टर उपचार के बाद साप्ताहिक वजन.
- परख इंसुलिन (माउस इंसुलिन एलिसा किट, Mercodia) और जिगर (AST और ALT इन्फिनिटी अभिकर्मकों, थर्मो वैज्ञानिक) एंजाइमों वाणिज्यिक किट का उपयोग करने के लिए हर 2 सप्ताह saphenous या पैर में पूंछ नस नस से खून ले लीजिए.
- एक uncapped 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में बंद अंत में किए गए छेद के साथ माउस रखें.
- माउस सिर ट्यूब और पैर और ट्यूब के खुले पक्ष में और पूंछ के अंत में बंद है. बाएं पैर से रक्त एकत्र, ट्यूब के बाहर के बाएं पैर का विस्तार और धीरे अंगूठे और पैर स्थिर तर्जनी के बीच जांघ की त्वचा चुटकी.
- उपयोगएक शेवर पिंडली / कम पैर क्षेत्र से बालों को हटाने के लिए, saphenous नस है, जो कम पैर के पार्श्व पक्ष पर मौजूद है बेनकाब. 70% शराब के साथ मुंडा त्वचा साफ और इसे सूखा.
- बीच में रोकना एक 25 गेज सुई के साथ saphenous नस, Microvette CB300 ट्यूब (Sarstedt) के साथ रक्त ले लीजिए और बर्फ पर ट्यूब डाल दिया.
- धुंध के साथ प्रेस पंचर साइट पिंजरों को चूहों लौटने से पहले रक्तस्राव को रोकने के लिए.
- 5 मिनट के लिए 3000 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला और आगे के विश्लेषण के लिए दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर ले.
3.4 इलाज के बाद 6 सप्ताह में ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (GTT) प्रदर्शन.
- आसुत जल में D-ग्लूकोज (सिग्मा) को भंग करने के लिए 15% (15/100 ग्राम मिलीलीटर) ग्लूकोज और बाँझ फिल्टर ग्लूकोज बनाने.
- 6 घंटे के लिए फास्ट चूहों. गर्म पैड का प्रयोग करने के लिए चूहों को गर्म करने के लिए और खून (0 मिनट समय बिंदु) इकट्ठा. तो 1.5 ग्राम / किलो डी ग्लुकोज आईपी के (10/15% ग्लूकोज की μl छ) इंजेक्षन.
- ज़ीन15, 30, 60, 120 मिनट में रक्त lect.
- और इन सभी नमूनों में ग्लूकोज और इंसुलिन उपाय.
3.5 ऊतक विश्लेषण वैक्टर की अभिव्यक्ति का आकलन और आइलेट neogenesis की प्रेरण का आकलन.
इन सभी चरणों में नियंत्रण है कि करने के लिए मज़बूती से परिणामों की व्याख्या करने के लिए आवश्यक हैं शामिल हैं: (1) खाली वेक्टर मधुमेह चूहों का इलाज (2) गैर मधुमेह चूहों और (3) गैर मधुमेह अग्न्याशय आइलेट की अभिव्यक्ति के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत विशिष्ट हार्मोन और प्रतिलेखन कारक हैं.
- हार्वेस्ट जिगर और उपचार के बाद 3 और 6 सप्ताह में अग्न्याशय. 2 टुकड़े, -80 में तरल नाइट्रोजन और भंडारण में तस्वीर ठंड 1 ° आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सी, और दूसरा 10% formalin के साथ immunohistochemistry विश्लेषण के लिए रात को ठीक में विभाजित करते हैं.
- एक मानक प्रोटोकॉल द्वारा शाही सेना निकालें और आइलेट विशिष्ट हार्मोन और transcriptional कारकों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण, Ngn3 के साथ और confir BTCविशिष्ट प्राइमरों 9, 10 का उपयोग qRT-पीसीआर द्वारा जिगर में वेक्टर अभिव्यक्ति,.
- जिगर से एसिड इथेनॉल निकासी विधि द्वारा इंसुलिन और सी - पेप्टाइड निकालें और एक व्यावसायिक एलिसा किट (अति संवेदनशील इंसुलिन परख, Mercodia, सी - पेप्टाइड एलिसा किट, मदद) द्वारा मात्रा ठहराना.
- आइलेट पैराफिन में विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों एम्बेडेड वर्गों 9, 10 के साथ आइलेट विशिष्ट हार्मोन (इंसुलिन, ग्लूकागन, पीपी, SST) के लिए immunostaining प्रदर्शन. Ngn3 और बीटीसी की अभिव्यक्ति भी immunostaining द्वारा पुष्टि की जा सकती है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
हम है और Ngn3 सीडीएनए BTC सर्वव्यापक प्रमोटर eIF2a (Bos) द्वारा संचालित है और HDAd - Ngn3 और HDAd BTC उत्पन्न pΔ28 वैक्टर में क्लोन. चित्रा 2 में दिखाया गया है, रिश्तेदार HV संदूषण काफी 3 पारित में (अधिक वेक्टर प्रवर्धन और कम सहायक प्रवर्धन जिसका अर्थ) की कमी हुई. इसलिए, हम बाद में वेक्टर के उत्पादन के लिए P3 इस्तेमाल किया. 1 के बादCsCl असंतत ढाल और ultracentrifugation, हम सबसे कम वेक्टर बैंड एकत्र और फिर आपल (3 चित्रा) 2 ultracentrifugation में HDAd वेक्टर इसी बैंड एकत्र. शुद्ध HDAd वेक्टर द्वारा HV संदूषण qPCR (4A चित्रा) की 1% से कम था और कोई सहायक दक्षिणी (4B चित्रा) सोख्ता, चूहों में वेक्टर जलसेक लिए पर्याप्त गुणवत्ता का संकेत दिखाई संदूषण था. आगे के विश्लेषण से 116 कोशिकाओं के संक्रमण से transgene अभिव्यक्ति भी शामिल हैं. की Ngn3 और BTC mRNA अभिव्यक्ति के स्तर वेक्टर द्वारा संक्रमित कोशिकाओं में अधिक थे गैर संक्रमित कोशिकाओं (5 चित्रा) में उन लोगों के साथ तुलना में 10,000 गुना अधिक है.
HDAd - Ngn3 और BTC तो खाली वेक्टर इंजेक्शन और HDAd - BTC इंजेक्शन मधुमेह नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत चूहों के साथ पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से STZ प्रेरित मधुमेह चूहों को दिलाई गई. Hyperglycemia उलट गया था और ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्रावदोनों HDAd Ngn3 और HDAd बीटीसी लेकिन एक जीन वेक्टर या नियंत्रण खाली सदिश (6 चित्रा) के साथ इलाज चूहों में नहीं के साथ इलाज चूहों में बहाल किया गया था. और HDAd - Ngn3 बीटीसी उपचार प्रेरित आइलेट neogenesis और यह गैर मधुमेह, मधुमेह खाली वेक्टर इलाज नियंत्रणों के रूप में सेवारत चूहों के साथ कुल इंसुलिन और सी - पेप्टाइड सामग्री (6E चित्रा) परख करने की क्रिया द्वारा quantitated किया गया था. ग पेप्टाइड और equimolar अनुपात में इंसुलिन की उपस्थिति की पुष्टि करता है कि इंसुलिन जिगर में पाया जा रहा है वास्तव में जिगर में संश्लेषित किया जा रहा है. RT-qPCR की पुष्टि की है कि HDAd - Ngn3 BTC इलाज चूहों के में जिगर सभी आइलेट विशिष्ट हार्मोन और प्रतिलेखन कारकों 9 व्यक्त. Immunohistochemistry HDAd - Ngn3 और HDAd BTC साथ इलाज चूहों के जिगर में इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं से पता चला है, लेकिन कोई सकारात्मक इंसुलिन कोशिकाओं नियंत्रण वेक्टर (7 चित्रा) के साथ इलाज चूहों में मनाया गया. हम यह भी पुष्टि की है कि वहाँ treate Ngn3 बीटीसी के अग्न्याशय में कोई अवशिष्ट islets थेघ चूहों के रूप में गैर मधुमेह अग्न्याशय में कई islets की तुलना. वेक्टर (Ngn3 और बीटीसी) आइलेट विशिष्ट वंश प्रतिलेखन कारक (PDX-1 और Nkx6.1) अभिव्यक्ति के साथ भी जिगर (7 चित्रा) की immunostaining द्वारा मूल्यांकन किया गया था.
चित्रा 1 मधुमेह सहायक निर्भर वायरस प्रणाली का उपयोग कर चूहों के जीन थेरेपी का प्रवाह चार्ट. सबसे पहले, Ngn3 और BTC, एक एक सर्वव्यापक BOS प्रमोटर द्वारा संचालित कैसेट, HDAd (pΔ28) शटल वैक्टर में क्लोन कर रहे हैं. HDAd अभिकर्मक, प्रवर्धन के धारावाहिक मार्ग, और एक बड़े पैमाने पर वेक्टर शुद्धि के बाद संक्रमण सहित कई कदम द्वारा निर्मित है. गुणवत्ता निस्र्पक के बाद, HDAds नसों के पूंछ नस के माध्यम से STZ प्रेरित मधुमेह चूहों में इंजेक्ट कर रहे हैं. उपचार के प्रभाव को मापने ग्लूकोज, शरीर के वजन, GTT और जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैंजिगर में.
चित्रा 2 निर्धारण HDAd वेक्टर प्रवर्धन. डीएनए P4 P0 बीतने के डीएनए निष्कर्षण किट (Qiagen) का उपयोग करने से निकाला जाता है. डीएनए का पतला 1,000 गुना और 5μl डीएनए वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) के लिए प्रयोग किया जाता है. हेल्पर और वेक्टर विशिष्ट प्राइमरों उपयोग किया जाता है. मानक घटता शटल HDAd वेक्टर प्लाज्मिड और HV प्लाज्मिड (शीर्ष पैनल) के धारावाहिक dilutions (10 -5 के लिए 1 एनजी / एमएल) द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. मानक घटता है और सीटी मूल्यों वेक्टर और सहायक वायरस नकल संख्या के लिए उपयोग कर की गणना है और / HDAd HV के अनुपात कुल वायरस के एक प्रतिशत (सहायक HDAd +) के रूप में साजिश रची है. इसलिए, रिश्तेदार वेक्टर प्रवर्धन के रूप में गणना की है: [वेक्टर कॉपी / संख्या (वेक्टर + सहायक वायरस नकल संख्या)]. उदाहरण में (नीचे के पैनल) HDAd वेक्टर P4 में plateaued प्रवर्धन दिखाया गया है, जबकि रिश्तेदार / HDAd HV P3 से बढ़ रही है. इसलिए, पी3 के बाद के चरण के लिए चयन किया जाता है.
चित्रा 3 प्रतिनिधि HDAd वेक्टर बैंड असंतत CsCl घनत्व ultracentrifugation के बाद. HDAd वेक्टर अनुक्रमिक CsCl घनत्व ढाल पर एक 3L स्पिनर संस्कृति से शुद्ध होता है. (ए) 1 घनत्व ढाल ultracentrifugation के बाद, एक एकल आपल वेक्टर बैंड दिखाई अपारदर्शी सेल मलबे (सीडी) के नीचे (तीर). आपल बैंड (तीर) 2 घनत्व ढाल centrifugation के लिए एकत्र किया जाता है. (बी) 2 घनत्व ढाल ultracentrifugation के बाद, आपल बैंड (तीर) डायलिसिस के लिए एकत्र किया जाता है.
चित्रा 4 सहायक वायरस संदूषण का विश्लेषण. डीएनए 50μl शुद्ध वायरस से निकाला जाता है और सहायक संदूषण हैचित्रा 2 में ssessed. आंकड़ा पता चलता है HDAd - Ngn3 और HDAd BTC सहायक संदूषण 1% से कम है.
चित्रा 5. HDAd वेक्टर की संरचना का विश्लेषण. दक्षिणी धब्बा पहले वर्णित (ओका कश्मीर, एट अल.) के रूप में किया जाता है. लेन 1: सहायक विषाणु से डीएनए, 2 लेन: P3 से डीएनए, 3 लेन: P4 से डीएनए, 4 लेन: शुद्ध vectopr. ओपन तीर बैंड व्युत्पन्न सहायक वायरस से संकेत मिलता है और भरा तीर आईटीआर HDAd वेक्टर से प्राप्त बैंड संकेत मिलता है.
चित्रा 6 या 116 के साथ संक्रमित कोशिकाओं HDAd - Ngn3 या HDAd BTC वेक्टर Ngn3 में बीटीसी की अभिव्यक्ति के स्तर. एक 12 अच्छी तरह प्लेटें में 116 कक्षों 1000 vp / 2 दिनों के लिए सेल HDAd Ngn3 या HDAd BTC या खाली सदिश से संक्रमित हैं. CeLLS काटा और कुल शाही सेना Trizol अभिकर्मक का उपयोग कर निकाला जाता है. qRT-पीसीआर Ngn3 या बीटीसी विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग किया जाता है. रिश्तेदार Ngn3 या BTC mRNA अभिव्यक्ति 10,000 गुना से अधिक HDAd - Ngn3 या HDAd BTC साथ संक्रमित कोशिकाओं में वृद्धि हुई है. आंकड़ा Dev.Cell Mar 2009 से reprinted है, 16 (3): 358-73, Yechoor एट. अल. Elsevier से अनुमति के साथ.
7 चित्रा HDAd - Ngn3 और HDAd BTC STZ प्रेरित मधुमेह चूहों में जीन स्थानांतरण और जिगर में आइलेट neogenesis की प्रेरण मधुमेह के उत्क्रमण के लिए होता है. (ए) प्लाज्मा ग्लूकोज और (बी) STZ प्रेरित मधुमेह के साथ HDAd - Ngn3 और HDAd BTC इलाज चूहों के शरीर के वजन. (सी) प्लाज्मा ग्लूकोज और इंसुलिन उपचार के बाद एक 6 सप्ताह में आईपी GTT दौरान. (डी) 12 सप्ताह के उपचार के बाद जिगर में प्रतिनिधि इंसुलिन धुंधला हो जाना. * <0.05 पी (बनाम खाली वेक्टर समूह). आंकड़ा देव से reprinted है. Celएल Mar 2009, 16 (3): 358-73, Yechoor एट अल Elsevier से अनुमति के साथ.
| नाम | आगे प्राइमर | प्राइमर रिवर्स | |
| सहायक | GACCATCAATCTTGACGACC | ATGTCGCTTTCCAGAACCC | |
| वेक्टर | TTGGGCGTAACCGAGTAAG | ACTTCCTACCCATAAGCTCC | |
| Ngn3 | AAGAGCGAGTTGGCACTCAG | TCTGAGTCAGTGCCCAGATG | |
| बैंकर प्रशिक्षण महाविद्यालय | GCACAGGTACCACCCCTAGA | TGAACACCACCATGACCACT | |
1 टेबल प्राइमर दृश्यों.
Discussion
HDAds विकसित किया गया है जल्दी पीढ़ी विज्ञापन की कमजोरी को दूर करने के लिए और जीन थेरेपी के आवेदन के लिए दोहन. हालांकि, तकनीकी चुनौतियां भी हैं. उदाहरण के लिए, HDAd है HDAd पैकेजिंग और वेक्टर प्रवर्धन के लिए HV की आवश्यकता के रूप में जल्दी पीढ़ी के विज्ञापन के रूप में कुशल नहीं है. एचवी एक पहली पीढ़ी के विज्ञापन और HV समझौता HDAd की प्रभावशीलता के किसी भी संक्रमण है. इसलिए, अत्यधिक कुशल अभिकर्मक और प्रत्येक धारावाहिक पारित होने के लिए इष्टतम स्थितियों महत्वपूर्ण हैं. वेक्टर उत्पादन के लिए एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर है (P1-P4) जो पारित होने के बाद 5 मार्ग है कि सीधे निलंबन कोशिकाओं के लिए inoculum के रूप में प्रयोग किया जाता है के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हमारे अनुभव करने के लिए, सबसे अच्छा परिणाम मार्ग है जिसके द्वारा HDAd वेक्टर अनुपात नाटकीय रूप से पारित होने के बाद (2 चित्रा में पी 3) में वृद्धि हुई है का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं. HDAd वैक्टर की उपज transgene कैसेट पर निर्भर करता है. वेक्टर उत्पादन के दौरान, दोनों transgenes व्यक्त कर रहे हैं क्योंकि दोनों जीनों के तहत कर रहे हैंसर्वव्यापक प्रमोटर. Ngn3 एक प्रतिलेखन कारक है और BTC एक वृद्धि कारक है, जो कि HDAd वेक्टर व्यक्त प्रतिलेखन कारक पता चलता है जो सेल वंश वेक्टर प्रवर्धन को रोकता है, जबकि कि व्यक्त वृद्धि हार्मोन वेक्टर प्रतिकृति और पैकेजिंग करने में मदद करता है को प्रभावित कर सकते हैं.
मधुमेह महामारी अनुपात संभालने के साथ, बी कोशिका द्रव्यमान को बहाल करने के लिए नई दृष्टिकोण की जरूरत है. इस रिपोर्ट में, हम लिए HDAd वैक्टर के लाभ का दोहन करने के लिए वंश परिभाषित प्रतिलेखन कारक, Ngn3 आइलेट आइलेट वृद्धि कारक के साथ जीन स्थानांतरण प्रभाव विधियों का वर्णन, betacellulin जिगर की periportal क्षेत्रों में आइलेट neogenesis उत्पन्न करने के लिए. इस की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, यह स्थिर hyperglycemia के साथ चूहों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह सुनिश्चित करें कि उचित नियंत्रण हमेशा शामिल हैं. इस जीन स्थानांतरण प्रयोगों के लिए खाली सदिश का इलाज मधुमेह चूहों हमेशा उपयोग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, का उपयोग HDAd - Ngn3 और HDAd BTC व्यक्तिगत इलाज मधुमेह मीलCE के आइलेट neogenesis में इन दो जीनों के व्यक्तिगत योगदान का परीक्षण करने के लिए कार्य करता है. जैसा कि हमारे डेटा दर्शाता है कि अकेले Ngn3 आइलेट neogenesis प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन वृद्धि कारक, बीटीसी, के अलावा आइलेट neogenesis मजबूत प्रेरण अग्रणी प्रतिक्रिया बढ़ाने का काम करता है. यह भी महत्वपूर्ण है परीक्षण करने के लिए है कि वेक्टर अभिव्यक्ति वास्तव में लक्ष्य ऊतक, जिगर में हासिल की है और यह भी प्रदर्शित करने के लिए है कि इलाज चूहों के प्लाज्मा में assayed इंसुलिन अग्न्याशय में अवशिष्ट islets से अग्नाशय के अभाव का प्रदर्शन नहीं आ रहा है, मधुमेह चूहों में islets.
सारांश में, जीन स्थानांतरण के लिए इस प्रणाली का लाभ HDAd वेक्टर न्यूनतम पुरानी विषाक्तता के साथ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वेक्टर जीनोम के गैर एकीकरण के अपने स्वभाव जिगर में अपने उच्च क्लोनिंग क्षमता, कुशल पारगमन और लंबे समय तक चलने वाले जीन की अभिव्यक्ति में मेजबान में निहित है गुणसूत्र. प्राथमिक सीमाओं परिसर में अपनी पीढ़ी और में शामिल कदम हैं अपनेvivo आवेदन में मुख्य रूप से सबसे लोकप्रिय विज्ञापन सीरोटाइप 5 के साथ जिगर तक ही सीमित है. इस्लेट neogenesis करने के लिए पूरी तरह से जिगर में आइलेट वंश परिभाषित प्रतिलेखन कारक, Ngn3 की आइलेट वृद्धि कारक, betacellulin साथ साथ जीन स्थानांतरण आइलेट neogenesis उत्प्रेरण द्वारा प्लाज्मा इंसुलिन और मधुमेह चूहों में ग्लूकोज सहनशीलता को बहाल करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है. इस रिपोर्ट में, हम इष्टतम प्रोटोकॉल को दिखाने के लिए उच्च गुणवत्ता HDAd Ngn3 और HDAd BTC उत्पन्न, और मधुमेह चूहों के यकृत में आइलेट neogenesis प्रेरित और आकलन करने के लिए hyperglycemia रिवर्स करने के लिए तकनीक का प्रदर्शन.
फुटनोट: वायरल वैक्टर और सेल लाइनों यहाँ वर्णित वेक्टर उत्पादन कोर प्रयोगशाला, मधुमेह अनुसंधान केंद्र, चिकित्सा के Baylor कॉलेज (से उपलब्ध हैं http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731 ). कुछ व्यावसायिक किट भी HDAd वायरस (जैसे Microbix biosyst पैदा करने के लिए उपलब्ध हैंईएमएस) इंक.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NIH से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया: R03 DK089061 01 (VKY), NIH: DK068391 K08 (VKY); मधुमेह और इन्डोकिरनोलाजी केंद्र (DERC - P30DK079638) रिसर्च Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन में एक पायलट और व्यवहार्यता से अनुदान (VKY DERC), किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन: JDRF पुरस्कार 5-2006-134 (VKY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProFectionR Mammalian Transfection kit | Promega | E1200 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | |
| PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROX | Quanta Biosciences | 95055-500 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| MEM powder | Invitrogen | 61100087 | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | 15140122 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hygromycin B | Sigma | H0654-1G | |
| MEM EAGLE JOKLIK | Sigma | M0518-10L | |
| Rnase | Roche | 10109169001 | |
| DNase I, grade II | Roche | 10104159001 | |
| Streptozocin | Sigma | s0130 | |
| Glass spinner flasks | Corning | 4500-3L | |
| Glass spinner flasks | Corning | 4500-250 | |
| Slide A-lyzer casset | PIERCE CH | PI66380 | |
| Tube optiseal poly allomer, 11.2 ml | Beckman Coulter | 362181 | |
| Cesium chloride 1 kg | JT4042-2 | VWR | |
| Beckman LE-80K | Beckman Coulter | Optimal LE-80K ultracentrifuge | |
| Filter | VWR | 28143-338 | |
| centrifuge tube 500 ml | Corning | 431123 | |
| tailveiner restrainer | Braintree scientific , INC | tv-150 | |
| Insulin, Mouse ELISA | Mercodia | 10-1247-01 | |
| microvette CB300 | Sarstedt | 16.443.100 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Mouse C-peptide ELISA Kit | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | #631-07231 | |
| guinea pig anti-insulin antibody | Abcam | ab7842 | |
| goat anti-Pdx1 antibody | gift from Dr. Christopher Wright | ||
| mouse anti Ngn3 antibody | Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania |
AB2013 | |
| mouse anti Nkx6.1 antibody | Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania |
F64A6B4 | |
| anti- betacellulin antibody | Cell Sciences | PAAQ1 | |
| ALT (SGPT) Color Reagent SET. | Teco Diagnostics | A526 - 120 | |
| AST/(SGOT), Color Endpoint Reagent Set | Teco Diagnostics | A561-120 | |
Table 2. Specific Reagents and Equipment. |
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References
- Parks, R. J. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).
- Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).
- Belalcazar, L. M. Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Circulation. 107, 2726-2732 (2003).
- Oka, K. Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor. Circulation. 103, 1274-1281 (2001).
- Nomura, S. Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).
- Ng, P. A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).
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- Yechoor, V. Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice. Endocrinology. , (2009).
