Summary
우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.
Abstract
1 형 당뇨병은 췌장의 인슐린 생산 세포의 T 세포 매개 면역 파괴에 의해 발생합니다. 작은 섬 이식은 기증자의 가용성에 의해 및 장기 immunosuppression의 필요성에 의해 제한 되었기 때문에 지금까지 인슐린 대체 여전히 주요 치료입니다. Neuogenin3의 유전자 전송 (Ngn3), 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 특정 전사 인자와 Betacellulin (Btc)에 의해 유도 작은 섬 neogenesis는 작은 섬 성장 인자는 제 1 형 당뇨병을 치료 할 수있는 가능성이 있습니다.
Adenoviral 벡터 (광고) 고효율 유전자 전달 벡터이다;하지만, 초기 세대 광고 생체 사용하는 몇 가지 단점이 있습니다. 도우미에 의존 광고 (HDAds) 광고의 조기 세대의 안전 프로필을 향상시키고 transgene 표현 한을 연장하기 위해 개발 된 가장 진보 된 광고입니다. 그들은 바이러스 코딩 시퀀스에게 2-5 부족하며 광고 CIS 엘을 유지하기 때문에 만성 독성이 부족벡터 복제 및 포장에 필요한 ements. 이 36 이하 유전자까지의 복제를 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 생성하고 STZ 유발 당뇨병 마우스에이 벡터를 제공하는 방법을 설명합니다. 우리의 결과는 HDAd-Ngn3, 간에서 HDAd - Btc 유도 '네오 섬'의 공동 주입하고하면 당뇨병 생쥐에서 고혈당증을 반대로 것을 보여줍니다.
Protocol
1. HDAd 셔틀 벡터에 치료 유전자를 복제
- 유비쿼터스 신장 요인-1 프로모터 (BOS)과 폴리 신호를 포함하는 플라스미드 벡터에 pLPBL1 복제 마우스 Ngn3과 Btc이 cDNAs. 완료되면, 서열 분석에 의한 벡터를 확인하고 6 플라스미드 pΔ28 HDAd 셔틀로 이러한 표현 카세트를 subclone.
- 플라스미드 백본을 해제 할 수 PmeI의 다이제스트 HDAd 셔틀 벡터는 transfection 급 물과 에탄올 침전 및 reconstitute 다음 페놀 / 클로로포름 / 아이소 아밀 알코올 추출에 의해 DNAs를 정화.
2. 도우미에 의존 Adenoviral 벡터 제작
HDAd 벡터 생산은 신중하게 최적의 결과를 따라야 할 필요가 여러 단계를 포함한다.
2.1 Transfection
- transfection의 날에 70~80%의 합류에 도달하는 방법은 두 일 6 cm 요리에 transfection, 씨앗 116 세포 칠 전에.
- transfection 전에 3 시간, 중간을 제거하고 신선한 성장 매체의 5 ML을 추가 [가상 10 % FBS와 1 %의 PSG (페니실린, 스트렙토 마이신과 글루타민), Invitrogen과 보충].주세요
- 제조업체의 지시에 따라 Promega에서 ProFectionR 포유류의 Transfection 키트를 사용하여 단계 1.2)에서 10 μg의 DNA와 Transfect는 116 세포.
- 다음 날, 성장 매체 1 ML 2 번으로 세포를 씻어. PBS가 포함 된 칼슘, 마그네슘 0.1 ML에 500 벡터 입자 (부사장) / 휴대폰 헬퍼 바이러스 (HV)를 추가 (PBS + +) 세포와 오버레이. 부드럽게 골고루 HV마다 10 분을 배포 할 요리를 신난다.
- 60 분 후, 유지 보수 매체 (가상, 5 % FBS, 1 % PSG)의 1.5 ML를 추가합니다.
- 다음 날 중간 관리의 또 다른 한 ML을 추가합니다.
- CPE에 대한 세포 (- 세포가 반올림과 분리 될 Cytopathic 효과)를 관찰. 세포의보다 큰 80 %가 이일 감염 후 CPE를 표시합니다.
- 원유 세포 lysate (CVL, 세포와 매체)를 수집-80에서 40 % 자당과 저장소의 DD 10 % 볼륨 ° C. CVL은 통로 0으로 지정되었습니다 - (CVL-P0).
2.2 벡터 증폭
- 프리즈 (-80 ° C, 3-5 분) / 해동 (37 ° C, 1-2 분) 3 회.
- 오버레이 0.5 ML CVL은 6 cm 접시에 합류 116 셀 200 VP / 휴대폰 HV와 함께 보충하고, 부드럽게 매 5 분 요리 신난다. 30 분 후, 1 ML 유지 보수 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 유지 보수 매체 다음날 1 ML을 추가합니다. 2 일 후, 세포의 대부분은 CPE를 표시합니다.
- -80 ° C (CVL-P1) 단계 2.1.8에 설명 된대로)에서 CVL 및 매장를 수집합니다.
- CVL P2-P4를 얻을 3 회 절차를 반복합니다.
- P1-P4에서 CVL 수집의 0.2 ML에서 DNA를 (DNeasy 혈액 및 조직 키트, Qiagen) 추출하고, HV 및 HDAd 특정 프리 머 (표 1)를 사용하여 qPCR하여 벡터 증폭를 분석합니다. 기하 급수적으로 subsequen을 위해 (그림 2의 P3) HV에 상대적으로 증폭 HDAd있는 통로를 사용하여t 절차.
- 200 VP / 셀에서 0.5 ML CVL과 HV와 15cm 접시의 90 %가 합류 116 세포를 공동 감염. 요리 할 때마다 부드럽게 5 분 즐겨요. 30 분 후, 유지 보수 매체의 10 ML를 추가합니다.
- 24 시간 후 유지 보수 매체의 5 ML을 추가합니다.
- 5 분 감염 후 정확히 48 시간에 1,500 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
- PBS + -80에서 + 포함하는 4 %의 자당 (P5)과 동결 ° C.의 1 ML에 다시 중단 세포
2.3 대규모 HDAd 생산
- 정지 세포 배양에 감염 116 세포를 준비하려면, 3 L 스피너 플라스크에 8 X 15 cm의 접시에 합류 116 세포를 전송하고 (Joklik 수정 가상 5 % FBS, 0.1 MG / ML hygromycin 1 %로 보충 정지 성장 매체를 추가 PSG) 결승 1 L, 60 RPM 8시에 회전과 CO 2 인큐베이터에 품다합니다.
- 신선한 매체에 2 일간 매일 (총 2 L)의 0.5 L을 추가합니다.
- 세번째 날에 셀을 계산합니다. 셀 t에 도달하면 사용할 수 있습니다1x10 9 O 총 전화 번호.
- P5 3 회를 해동 / 정지 해.
- 5 분 1,000 XG에서 원심 분리하여 세 L 스피너 플라스크의 세포를 수집합니다. 다시 중단 셀 표면에 뜨는 100 ML를 저장합니다.
- 250 ML의 스피너 플라스크에 세포를 전송합니다. 37 번 1 시간 200 VP / 셀에 셀 배양 ° 60 rpm으로 C에서 P5와 HV를 추가합니다.
- 전송 셀 및 3 L 스피너 플라스크에 매체는 2 L 일시 중지 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. CPE에 대한 세포를 관찰 할 수있는 12 잘 플레이트에 잘에 1 ML 세포 현탁액을 전송합니다.
- 60 RPM에서 CO 2 인큐베이터에서 2 일 스피너 플라스크에 세포를 배양.
- 원심 분리하여 세포를 수집하고 정화 할 때까지 -80 ° C (P6) 15 ML 100 MM 트리스 - HCL (산도 8.0)와 상점과 다시 일시 중지합니다.
2.4 벡터 정화
- P6에 5 % 나트륨 deoxycholate의 1.0 ML를 추가합니다. 부드럽게 섞은 후 실온에서 30 분에 품다.
- 2 M MgCl 2, 300 μ 400 μl를 추가합니다RNase A (10 MG / ML), 300 DNase I (10 MG / ML)의 μl 1 시간에 ° C 37 품다의 리터.
- 표면에 뜨는 수집 실온에서 10 분에 6,000 XG에 원심 분리기.
- 조직 문화 후드에서 1 시간에 UV 빛 아래에서 NVT 65 ultracentrifuge 튜브 (Beckman)을 살균.
- 목에 관을 채우기 위해 저밀도 CsCl 솔루션 (1.25 g / ML), 고밀도 CsCl 밀도 솔루션의 밑받침 2.8 ML (1.41g/ml)하고 표면에 뜨는의 오버레이 5-6 ML의 2.8 ML를 추가합니다. 튜브 필요한 경우를 채우기 위해 100 MM 트리스 - HCL (pH8.0)를 사용합니다.
- 10시 원심 분리기 10시 50,000 rpm에서 30 분에 대한 ° C ° Beckman LE-80K는 NVT-65 로터를 이용한 C.
- 바늘 찔린 70 %의 에탄올과 지역을 닦아, 그리고 측면 구멍 (그림 3A)에 의해 22 G 바늘을 갖춘 3-ML 주사기와 낮은 젖빛을내는 밴드를 수집합니다. 때때로 아주 희미한 도우미 밴드가 더 눈에 잘 띄는 벡터 밴드 아래 볼 수 있습니다. 일의 많은를 구하려고도우미 밴드없이 가능한 전자 벡터 밴드. 이 다음 이후의 야간 원심 분리에서 분리 될 것 같은 도우미 대역의 일부가 흡입되어있는 경우에도 그것은이 단계에서 허용됩니다.
- 새로운 소독 ultracentrifuge 튜브에 수집 된 밴드를 놓습니다. 1.35 g / ML CsCl 밀도 솔루션을 오버레이하여 목에 튜브를 채 웁니다.
- 10 박 50,000 rpm으로 ° C에서 원심 분리기. 젖빛을내는 밴드 (그림 3B)를 수집합니다.
- 투석 카세트 (슬라이드 - Lyzer, 10,000 MWCO, 열 과학)로 밴드를 전송합니다.
- 4 ° C 하룻밤에 2 MM MgCl 2, 4 %의 자당을 포함 autoclaved 10 MM 살 - HCL, pH를 7.2 3 L에 대해 Dialyze.
- 투석 카세트에서 HDAd 벡터를 제거합니다. 물리적 titer와 DNA 특성화 50 μl에 나누어지는 20 μl. (참고 : Ngn3 벡터를 들어, HDAd-Ngn3의 수율이 HDAd - Btc 또는 HDAd 비어에 비해 가난 때문에 충분한 벡터를 얻기 위해 "P6"을 세 번 반복합니다.)
HDAd 벡터 2.5 특성화
- 광학 밀도를 사용하여 물리적 titer (상무 / ML) (OD)를 확인합니다. 20 분에 56에서 0.1 % SDS와 배양 ° C를 포함하는 380 μl TE 버퍼 20 μl 벡터 또는 20 μl 투석 버퍼를 추가합니다. 260 nm의에서 OD를 측정합니다. 물리적 titer = OD260 X 1.1 X 10 12 X 20 (부사장 / ML).
- qPCR에 의한 HV 오염을 분석합니다. DNeasy 조직 / 혈액 DNA 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 DNA를 추출 할 수 50μl 나누어지는을 사용합니다. DNA 1,000 배 희석하여 도우미와 벡터 특정 프리 머 (표 1)를 사용하여 qPCR 분석 5 μl를. 도우미 오염은 그림 4A에 도시 된 바와 같이, 1 % 미만이어야합니다.
- 벡터 구조를 분석하기 위해 남부 얼룩을 사용합니다. 역 터미널 반복 (ITR)에 대한 프로브를 사용하여 남부 블로 팅 분석 10 수행합니다. 대표 결과는 그림 4B에 표시됩니다.
- 체외 효능에 확인합니다. 알려진 감염1000 사통으로 작성된 부사장 / 셀에서 HDAd 벡터와 12 잘 플레이트에 116 세포의 수. 48 시간 후 세포를 수확하고 qRT-PCR (표 1)에 의해 Ngn3과 Btc mRNAs의 표현을 결정하는 RNA를 추출합니다. 대표 결과는 그림 5에 표시됩니다.
3. HDAd - Ngn3 및 Btc로 당뇨 마우스의 치료
3.1 마우스의 당뇨병의 유도와 HDAd 벡터의 주입
- STZ의 준비 : 0.1M 구연산 버퍼를 준비하고, 4.3-4.5로 PH를 조정합니다. 0.22 mm의 주사기 필터를 통해이 작업을 필터링 할 수 있습니다. 멸균 물을 사용하면 0.01 M 오세영가 산도를 4.2-4.5을 구연산이를 희석. 12.5 MG / ML의 최종 농도를 달성하는이 솔루션에 STZ (시그마)의 적절한 금액을 분해. 이 농도에서 더 강수량이 없습니다. ° C까지 사용 4에이 STZ 솔루션세요. 주입 직전에 실내 온도에 주입 솔루션의 온도를 가져와. STZ 솔루션 shoulD 매일 신선한 준비 용해되는 5-10 분 내에 주입한다.
- 5-7시 (불이 마우스 시설에서 해제하고 쥐가 적극적으로 먹이를 시작하기 전에) 사이 저녁이 STZ 솔루션 intraperitoneally을 (125 μg / g의 체중의 복용을 달성하는데 10 μl / GM), 주입, 2 개의 연속 일 9.
HDAd 벡터의 3.2 모니터링 마우스 포도당, 사출.
- 6 시간 및 마우스까지 매주 측정 체중과 혈당에 대한 빠른 마우스는 고혈당증을 (≥ 250mg/dl)가 있습니다. 꼬리 싹둑에서 수집 한 피를 하나의 터치 glucometer를 사용하십시오. 250-500 MG / DL : 혈당은 혈당 치료의 대상 범위 내에 영구 고혈당증과 피를 보장 빠른 속도로 6 시간 후 48 시간 안에 다시 ≥ 250 MG / DL, 다시 확인 혈당되면.
- 꼬리 정맥을 통해 HDAd 벡터의 단일 정맥 주사하여 영구적 인 고혈당증과 쥐를 취급합니다. 총 벡터 복용은 6x10 11 부사장입니다, Ngn3 그룹에 대한 5x10 11 부사장 Ngn3 + 1x10 11 부사장, 그리고 Btc 그룹에 대한 1x10 11 부사장 Btc + 5x10 11 부사장 빈 벡터 및 조합 그룹에 대한 5x10 11 부사장 Ngn3 한 X10 11 부사장 Btc : 모든 치료 그룹 (0.25 ML)를위한 컨트롤 그룹에 대한 6x10 11 부사장 빈 벡터.
- 꼬리 정맥 주입. Tailveiner restrainer (TV-150, Braintree 과학 주식회사)에 쥐를 넣고 꼬리 정맥을 치료하는데 따뜻한 물을 사용하여 70 % 알코올로 꼬리를 청소하십시오. 엄지와 집게 손가락 사이에 손 주사 사이트 아래에 꼬리를 잡아, 사출의 또 다른 손을 사용합니다. 주입 주사기에 거품이 (30 2분의 1 G 바늘과 1 ML의 주사기를 사용)가 없는지 확인하기 전에. 바늘을 삽입하고 벡터를 천천히 주입. 바늘이 정맥 경우, 혈액의 플래시는 바늘의 중심에서 볼 수 있으며 더 저항은 분사 동안도 없습니다 수 있습니다. 바늘을 제거한 후 마우스에게 t을 반환하기 전에 출혈을 멈추게하기 위해 거즈로 주사 사이트를 보유O 케이지.
바늘이 정맥이 아닌 경우 주입에 상당한 저항과 약간의 피하 wheal 발생이 있습니다. 이 때 바늘을 제거하고 다른 사이트에서 다시 시도하십시오.
HDAd - Ngn3 + HDAd - Btc 치료의 효과 3.3 분석.
- 모니터 6 시간의 금식 포도당 및 벡터 처리 후 매주 체중.
- 매 2 주마다 검정 인슐린 (마우스 인슐린 엘리사 키트, Mercodia)과 상업 키트를 사용하여 간 효소 (대서양 표준시와 ALT 무한 시약, 열 과학)에 다리에서 두렁 정맥이나 꼬리 정맥에서 혈액을 수집합니다.
- 닫힌 끝에서 만든 구멍 uncapped 50 ML 팔콘 튜브에 마우스를 놓습니다.
- 마우스의 머리는 관의 열린 측면에 튜브와 다리와 꼬리의 폐쇄 끄트머리에 위치해 있습니다. 왼쪽 다리에서 피를 수집하려면 튜브의 외부에 왼쪽 다리를 확장하고 부드럽게 엄지 손가락과 다리를 고정하는 집게 손가락 사이의 허벅지의 피부를 꼬집어.
- 사용낮은 다리의 외 측면에 존재 두렁 정맥을 노출, 정강이 / 낮은 다리 지역에서 머리를 제거하는 면도기. 70 % 알코올로 면도 피부를 청소하고 건조 보자.
- 찔린 25 게이지 바늘로 두렁 정맥은, Microvette CB300 관 (Sarstedt)으로 혈액을 수집하여 얼음에 튜브를 넣어.
- 새장에 마우스를 반환하기 전에 출혈을 멈추게하기 위해 거즈로 주사 사이트를 누릅니다.
- 5 분 3,000 XG에서 튜브를 원심 분리기, 추가 분석을 위해 -20 ° C에서 표면에 뜨는과 점을.
3.4 치료 후 육주에서 포도당 내성 검사 (당부 하)를 수행합니다.
- 15 % 포도당 (15g / 100 ML)과 살균 필터 포도당를 만들기 위해 증류수에 D-포도당 (시그마)를 해산.
- 6 시간에 빠른 마우스. 쥐를 따뜻하게하고 혈액 (0 분 시점)을 수집하는 따뜻한 패드를 사용합니다. 그런 다음 D-포도당 IP의 1.5 g / kg를 (15 % 포도당의 10 μl / g) 주입.
- 안부15, 30, 60, 120 분의 피를 lect.
- 모든 샘플에서 포도당과 인슐린을 측정합니다.
3.5 조직 분석 벡터의 표현을 평가하고 작은 섬 neogenesis의 유도를 평가합니다.
이러한 모든 단계에서 안정적으로 결과를 해석하는 데 필요한 컨트롤은 다음과 같습니다 : (1) 빈 벡터는 당뇨병 쥐를 치료 (2) 비 당뇨병 생쥐와 작은 섬의 표현에 대한 긍정적 인 제어 역할 (3) 비 당뇨병 췌장 특정 호르몬과 전사 인자.
- 치료 후 3 ~ 6 주짜리를 수확 간, 췌장. 2 개, immunohistochemistry 분석을 위해 밤새 10% 포르말린으로 고정 할 수 RNA와 단백질 추출을위한 C ° -80에서 액체 질소와 스토리지의 스냅 동결에 대한 첫 번째, 두 번째로 나눈다.
- confir에 표준 프로토콜에 의해 RNA를 추출하고 작은 섬 특정 호르몬과 전사 요소의 표현을 분석 Ngn3와 함께하고 Btc특정 프리 머 9, 10을 사용하여 qRT-PCR에 의한 간에서 m 벡터 표현.
- 산 에탄올 추출 방법에 의해 간에서 인슐린과 C-펩타이드를 추출하고 상업 엘리사 키트 (초 민감 인슐린 분석, Mercodia, C-펩타이드 엘리사 키트, 와코)에 의해 정량화.
- 섹션 9, 10 임베디드 파라핀의 작은 섬 특정 전사 인자와 함께 작은 섬 특정 호르몬 (인슐린, 글루카곤, PP, SST)에 immunostaining 수행합니다. Ngn3 및 Btc의 표현도 immunostaining으로 확인 할 수 있습니다.
4. 대표 결과
우리는 Ngn3와 유비쿼터스 발기인 eIF2a (BOS)에 의해 구동 및 HDAd - Ngn3 및 HDAd - Btc 생성 pΔ28 벡터로 cDNA Btc 복제. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 상대적으로 HV 오염 통과 3시 (자세한 벡터 증폭 및 적은 도우미 증폭 뜻) 크게 감소. 따라서, 우리는 후속 벡터 생산 P3를 사용했습니다. 첫 번째 후CsCl 불연속 기울기와 ultracentrifugation, 우리는 가장 낮은 벡터 밴드를 수집 한 후 두 번째 ultracentrifugation에 HDAd 벡터 (그림 3)에 해당하는 젖빛을내는 밴드를 모았습니다. 정화 HDAd 벡터는 qPCR에 의한 HV 오염 (그림 4A)의 1 % 미만을했고 남부 쥐에 벡터 주입에 대한 충분한 품질을 나타냅니다 (그림 4B) blotting에 표시 어떠한 헬퍼 오염 없었다. 또한 분석은 116 세포의 감염에 의해 transgene 표현이 포함되어 있습니다. Ngn3 및 Btc의 mRNA 표현 수준이 아닌 감염된 세포 (그림 5)에서 해당과 비교 만 배 이상으로 벡터 감염된 세포에 이상이었다.
HDAd - Ngn3 및 Btc 그런 다음 빈 벡터 주입과 부정적인 제어 역할을 HDAd - Btc 주입 당뇨병 마우스로 꼬리 정맥 주입을 통해 STZ 유발 당뇨병 쥐에 투여했다. 고혈당증은 되돌릴과 포도당 자극 인슐린 분비 된단일 유전자 벡터 또는 제어 빈 벡터 (그림 6)로 치료 쥐 HDAd - Ngn3 및 HDAd - Btc 있지만 모두 처리 생쥐에 복원되었습니다. HDAd-Ngn3 - Btc 치료를 유발 작은 섬 neogenesis이이 컨트롤로 제공 비 당뇨병 환자, 당뇨병 빈 벡터 처리 마우스로 총 인슐린과 C-펩티드 콘텐츠 (그림 6E)을 시금으로 quantitated되었습니다. 몰 비율의 C-펩타이드 및 인슐린의 존재는 간에서 발견되는 인슐린이 실제로 간에서 합성되는 것을 확인합니다. RT-qPCR는 HDAd-Ngn3 - Btc 처리 생쥐의 간은 모든 작은 섬 특정 호르몬과 전사 인자 9 표명 것으로 확인되었습니다. Immunohistochemistry는 HDAd - Ngn3 및 HDAd - Btc로 치료 생쥐의 간에서 인슐린 양의 세포를 보여 주었다 있지만, 인슐린 양의 세포는 제어 벡터 (그림 7)로 치료 생쥐에서 관찰되지 않았습니다. 우리는 또한 Ngn3-Btc treate의 췌장에 잔류 섬이 없었 확인D 마우스는 비 당뇨병 췌장의 수많은 섬에 비교했다. 작은 섬 특정 계보 (Lineage) 전사 인자 (Pdx-1과 Nkx6.1) 표현과 함께 벡터 (Ngn3 및 Btc)도 간 (그림 7)의 immunostaining에 의해 평가되었다.
도우미에 의존 바이러스 시스템을 사용하여 당뇨 쥐의 유전자 치료의 그림 1. 흐름 차트입니다. 첫째, Ngn3 및 Btc는 유비쿼터스 BOS 발기인에 의해 구동 카세트에 HDAd 셔틀 (pΔ28) 벡터로 복제됩니다. HDAd는 transfection, 증폭의 일련 구절, 그리고 벡터 정화에 이어 대규모 감염 등 여러 단계에서 생산된다. 품질을 특성화 한 후, HDAds는 꼬리 정맥을 통해 STZ 유발 당뇨병 쥐에 intravenously 주입됩니다. 치료의 효과는 측정 혈당, 체중, 당부 하 의해 유전자 발현의 분석에 의한 평가간 인치
그림 2. 결정 HDAd 벡터 증폭. DNA는 DNA 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 P4에 통과 P0에서 추출됩니다. DNA는 1000 접어 5μl DNA가 실시간 PCR (qPCR)에 사용되는 희석된다. 도우미와 벡터 별 프리 머를 사용합니다. 표준 곡선은 HDAd 셔틀 벡터 플라스미드와 HV 플라스미드 (위 패널)의 시리얼 dilutions (10 -5 1 NG / ML)에 의해 생성됩니다. 벡터 및 도우미 바이러스 사본 번호 표준 곡선과 CT 값을 사용하여이 계산되어 HDAd / HV의 비율은 전체 바이러스의 비율 (헬퍼 + HDAd)로 도시된다. 따라서, 상대적 벡터 증폭이 같이 계산됩니다 : [벡터 사본 번호 / (벡터 + 헬퍼 바이러스 사본 번호)]. 상대 HDAd / HV는 P3에서 증가하는 동안, P4에서 plateaued HDAd 벡터 증폭 (아래 패널)에 표시된 예에서. 따라서, P3 다음 단계 선택됩니다.
그림 3. 대표 HDAd 벡터 밴드 불연속 CsCl 밀도 ultracentrifugation 후. HDAd 벡터는 연속 CsCl 밀도 기울기를 통해 3L 스피너 문화에서 정화되어 있습니다. (A) 첫 밀도 기울기 ultracentrifugation 후, 하나의 젖빛을내는 벡터 밴드는 불투명 세포 파편 (CD) 아래 (화살표) 볼 수 있습니다. 젖빛을내는 밴드 (화살표)가 두 번째 밀도 기울기 원심 분리를 위해 수집됩니다. (B) 두 번째 밀도 기울기 ultracentrifugation 후, 젖빛을내는 밴드 (화살표)는 투석을 위해 수집됩니다.
그림 4. 헬퍼 바이러스 오염의 분석. DNA는 50μl 정화 바이러스에서 추출 및 도우미 오염입니다그림 2에서와 같이 ssessed. 그림은 HDAd - Ngn3 및 HDAd - Btc의 도우미 오염 1 % 미만입니다 보여줍니다.
그림 5. HDAd 벡터의 구조 분석. 남부 얼룩은 (언덕 K, 외.) 이전에 설명 된대로 수행됩니다. 레인 1 : 헬퍼 바이러스의 DNA, 차선 2 : P3의 DNA, 레인 3 : P4에서 DNA, 레인 4 : 정화 vectopr. 오픈 화살표 도우미 바이러스 파생 밴드를 나타냅니다과 가득 화살표는 HDAd 벡터에서 파생 된 ITR 밴드를 나타냅니다.
그림 6. HDAd - Ngn3 또는 HDAd - Btc 벡터에 감염 116 셀에 Ngn3 또는 Btc의 표현 수준. 12 잘 접시에 116 셀은 1000 2 일간 부사장 / 셀에서 HDAd - Ngn3 또는 HDAd - Btc 또는 빈 벡터에 감염되어 있습니다. CE재편이 수확되어 총 RNA는 Trizol 시약을 사용하여 추출됩니다. qRT-PCR은 Ngn3 또는 Btc 별 프리 머를 사용하여 수행됩니다. 상대 Ngn3 또는 Btc mRNA 표현이 HDAd - Ngn3 또는 HDAd - Btc에 감염된 세포에 10,000 배 이상 증가했습니다. 수치는 Dev.Cell 2009 월에서 재되어, 16 일 (3) : 358-73, Yechoor 동부 표준시. 알., Elsevier의 허가.
그림 7. STZ 유발 당뇨병 마우스에 HDAd - Ngn3 및 HDAd - Btc의 유전자 전송 간은 당뇨병과 췌장 neogenesis의 유도의 반전이 생깁니다. (A) 플라즈마 포도당과 HDAd - Ngn3 및 HDAd - Btc로 치료 STZ 유발 당뇨병 마우스의 (B) 체중. 치료 후 육주에서 IP-당부 하 중 (C) 플라즈마 포도당과 인슐린. 12주 치료 후 간에서 (D) 대표 인슐린 착색. * P <0.05 (대 빈 벡터 그룹). 수치는 개발자의 재되어 있습니다. Cel리터 2,009 월, 16 일 (3) : 358-73, Yechoor 외, Elsevier의 허가..
| 이름 | 앞으로 입문서 | 프라이머을 취소 | |
| 돕는 사람 | GACCATCAATCTTGACGACC | ATGTCGCTTTCCAGAACCC | |
| 벡터 | TTGGGCGTAACCGAGTAAG | ACTTCCTACCCATAAGCTCC | |
| Ngn3 | AAGAGCGAGTTGGCACTCAG | TCTGAGTCAGTGCCCAGATG | |
| Btc | GCACAGGTACCACCCCTAGA | TGAACACCACCATGACCACT | |
표 1. 프라이머 시퀀스.
Discussion
HDAds는 초기 세대 광고의 약점을 극복하고 유전자 치료 응용 프로그램에 대한 활용하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 기술적 인 문제가 남아 있습니다. 예를 들어, HDAd는 HDAd의 포장 및 벡터 증폭을위한 HV는 초기 세대 광고만큼 효율적이지 않습니다 필요합니다. HV는 1 세대 광고 및 HV 타협 HDAd의 효과의 오염입니다. 따라서, 고효율 transfection 각 직렬 통과에 대한 최적의 조건 중요합니다. 벡터 생산을위한 또 다른 중요한 매개 변수는 직접 정지 전지 inoculum로 사용됩니다 이후의 통로 5 사용되어야하는 통로 (P1-P4)입니다. 우리의 경험으로, 가장 좋은 결과는 HDAd 벡터 비율은 크게 다음과 같은 통로 (그림 2의 P3)에 증가되는이 통로를 사용하여 얻을 수 있습니다. HDAd 벡터의 수율은 transgene 카세트에 따라 달라집니다. 두 유전자가 아래에 있기 때문에 벡터 생산하는 동안 두 transgenes이 표현됩니다유비쿼터스 발기인. Ngn3는 전사 인자이며, Btc는 표현 성장 호르몬은 벡터 복제 및 포장에 도움이 동안 세포 계보 (Lineage)는 벡터 증폭을 억제 영향을 미칠 수 있다는 HDAd 벡터 표현 전사 인자를 제안 성장 인자입니다.
당뇨병은 전염병 비율을 가정으로, B-세포 질량을 복원 할 수있는 새로운 접근 방법이 필요합니다. 이 보고서에서, 우리는 작은 섬 성장 인자와 함께 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 전사 인자, Ngn3의 유전자 전달에 영향을 미치도록 HDAd 벡터의 장점을 활용하는 방법을 설명, betacellulin은 간 periportal 지역에서 작은 섬의 neogenesis를 유도합니다. 이 효능을 평가하기 위해, 그것은 안정 고혈당증있는 마우스를 선택하고 적절한 컨트롤이 항상 포함되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자 전송 실험 빈 벡터는 당뇨병 마우스는 항상 활용해야 처리. 또한, HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 사용하여 개별적으로 당뇨병 MI에게 치료를CE는 작은 섬 neogenesis에서이 두 유전자의 개별 기여를 테스트하는 역할을한다. 우리의 데이터는 혼자 Ngn3이 작은 섬 neogenesis를 유도하기에 충분하지만, 성장 인자, Btc의 추가는 작은 섬 neogenesis의 강력한 유도로 이어지는 응답을 증가하는 역할을 증명 있습니다. 이 벡터 표현은 실제로 대상 조직, 간에서 달성하고 있으며, 치료를 생쥐의 플라즈마에서 assayed 인슐린은 췌장의 부재를 보여주는하여 췌장의 잔류 섬에서 오는되지 않습니다 있다는 것을 입증하는 것을 테스트하는 것도 중요합니다 당뇨병 쥐 섬.
요약하면, 유전자 전송에 대한 HDAd - 벡터 시스템의 장점은 호스트에 최소 만성 독성뿐만 아니라 벡터 게놈의 비 통합의 자연과 간에서 높은 복제 능력, 효율적인 전달과 긴 지속적인 유전자 발현에 있습니다 염색체. 기본 제한은 세대와 관련된 복잡한 단계의생체 응용 프로그램에서 주로 가장 인기있는 광고 혈청 형 5 간으로 제한됩니다. 작은 섬 neogenesis 완전히 작은 섬 성장 인자, betacellulin과 함께 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 전사 인자, Ngn3의 유전자 전달에 의해 간에서 췌장의 neogenesis을 유도하여 플라즈마 인슐린과 당뇨병 쥐에서 포도당 내성을 복원하도록 유도 할 수 있습니다. 이 보고서에서, 우리는 고품질 HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 생성하는 최적의 프로토콜을 표시하고, 고혈당증을 반대로 당뇨병 생쥐의 간에서 작은 섬 neogenesis를 유도하고 평가하는 기술을 보여줍니다.
각주 : 바이러스 성 벡터와 세포 라인이 여기서 설명은 벡터 생산 핵심 연구소, 당뇨병 연구 센터, 의학 베일러 대학 (에서 구입하실 수 있습니다 http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731 ). 일부 상용 키트 HDAd 바이러스 (예를 들면 Microbix biosyst 생성하기 위해 또한 이용 가능합니다EMS 주식회사).
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH에서 교부금에 의해 지원되었습니다 R03 DK089061-01 (VKY), NIH : K08 DK068391 (VKY), 당뇨병과 내분비학 연구 센터 - (DERC - P30DK079638) 의학 베일러 대학에서 파일럿 및 타당성 부여 DERC (VKY), 아동 당뇨병 연구 재단 : JDRF 상 # 5-2006-134 (VKY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProFectionR Mammalian Transfection kit | Promega | E1200 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | |
| PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROX | Quanta Biosciences | 95055-500 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| MEM powder | Invitrogen | 61100087 | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | 15140122 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hygromycin B | Sigma | H0654-1G | |
| MEM EAGLE JOKLIK | Sigma | M0518-10L | |
| Rnase | Roche | 10109169001 | |
| DNase I, grade II | Roche | 10104159001 | |
| Streptozocin | Sigma | s0130 | |
| Glass spinner flasks | Corning | 4500-3L | |
| Glass spinner flasks | Corning | 4500-250 | |
| Slide A-lyzer casset | PIERCE CH | PI66380 | |
| Tube optiseal poly allomer, 11.2 ml | Beckman Coulter | 362181 | |
| Cesium chloride 1 kg | JT4042-2 | VWR | |
| Beckman LE-80K | Beckman Coulter | Optimal LE-80K ultracentrifuge | |
| Filter | VWR | 28143-338 | |
| centrifuge tube 500 ml | Corning | 431123 | |
| tailveiner restrainer | Braintree scientific , INC | tv-150 | |
| Insulin, Mouse ELISA | Mercodia | 10-1247-01 | |
| microvette CB300 | Sarstedt | 16.443.100 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Mouse C-peptide ELISA Kit | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | #631-07231 | |
| guinea pig anti-insulin antibody | Abcam | ab7842 | |
| goat anti-Pdx1 antibody | gift from Dr. Christopher Wright | ||
| mouse anti Ngn3 antibody | Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania |
AB2013 | |
| mouse anti Nkx6.1 antibody | Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania |
F64A6B4 | |
| anti- betacellulin antibody | Cell Sciences | PAAQ1 | |
| ALT (SGPT) Color Reagent SET. | Teco Diagnostics | A526 - 120 | |
| AST/(SGOT), Color Endpoint Reagent Set | Teco Diagnostics | A561-120 | |
Table 2. Specific Reagents and Equipment. |
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References
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- Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).
- Belalcazar, L. M. Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Circulation. 107, 2726-2732 (2003).
- Oka, K. Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor. Circulation. 103, 1274-1281 (2001).
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