Summary
我们描述了迅速隔离的主要鼠Ⅱ型肺泡上皮的细胞（AECII）流式细胞仪的负选择。这些AECII显示活力和纯度高，适用于范围广泛的功能和分子生物学研究，他们的作用，自身免疫性疾病或感染性疾病，如呼吸系统疾病。
Abstract
纵观过去几年，各方面的免疫调节肺的肺泡Ⅱ型上皮的细胞（AECII）的贡献已被越来越多的认可。 AECII已显示出参与在发炎的气道的细胞因子的产生，甚至作为抗原呈递细胞在感染和T-细胞介导的自身免疫1-8。因此，他们也特别有趣的气道高反应性的临床环境下，比如外资和自身抗原以及感染，直接或间接地针对AECII。然而，我们了解的详细服务的II型肺泡上皮细胞在肺的健康以及在炎症的免疫功能仍然是零碎的。许多的研究AECII功能是使用鼠标或9-12人肺泡上皮细胞株。工作与细胞系确实提供了一系列好处，如提供大量ØF细胞广泛的分析。然而，我们相信使用的主要鼠AECII允许更好地了解复杂的过程，如感染或自身免疫性炎症的作用，这种细胞类型中。初级的的小鼠AECII可以直接从动物等呼吸系统疾病的痛苦，这意味着他们已经给所有其他的外在因素发挥作用的分析设置隔离。作为一个例子，可行的AECII可以分离出小鼠滴鼻感染A型流感病毒，主要目标，这些细胞的复制13。更重要的是，通过从健康小鼠中分离的AECII 体外感染，安装在感染的细胞的反应的研究可以进一步延长。
是根据我们的协议进行的原发性小鼠AECII的隔离的小鼠肺然后通过标记所得到的细胞悬浮液与特异性抗体的CD11c，CD11b和F4/80，酶消化，CD19，CD45和CD16/CD32。颗粒AECII然后确定为未标记的和侧向散射（SSC 高 ）细胞种群，并通过荧光激活细胞分选3被分离。
隔离小鼠肺上皮细胞的替代方法相比，我们的协议流式细胞仪分离的AECII负选择在比较短的时间内产生不动，高度可行的和纯AECII的。此外，和在常规的隔离方法，通过平移和淋巴细胞耗竭相反通过结合抗体耦合磁珠14，15，流式细胞仪细胞分选允许通过细胞大小和粒度歧视。由于仪器流式细胞仪细胞分选是可用的，所描述的程序，可以应用于在相对低的成本。下一步标准的抗体和酶肺解体，不需要额外的试剂，如磁珠是必需的。分离的细胞是适用于范围广泛的功能和分子生物学研究，其中包括在体外培养细胞和T细胞刺激实验，以及转录组，蛋白质组或分泌的分析3，4。
Protocol
关于所需的试剂和材料的细节在表中列出的，在端部的下面的协议。在开始工作之前，准备15毫升管（每一个鼠标），其中包含4毫升分离酶和预暖至37℃的水浴中。不久，在一个加热块1％低熔点琼脂糖（在水中）的小等分试样加热至95℃，直至液化并随后冷却至45℃，直至使用。
1。制备小鼠肺
- 牺牲鼠标的CO 2窒息。注意：不要进行颈椎错位，因为这将损害气管，使协议的步骤，如，如安装的液体肺，不能成功进行。确保伤害反射的损失。
- 喷用乙醇和鼠标，使一个长期的切割，沿腹正中线的身体。拉腹部的皮毛和皮肤，随后还精心削减和删除腹膜的。
- 抽血的切割的左和右颈静脉（ 腔jugularis）以及肾动脉（ 动脉renalis）的小鼠。拆下流动的血液与组织。
- 小心穿刺，然后取出膜片，暴露心脏和肺切掉肋骨。要特别小心，不要伤到肺。
- 有了一个26G插管和10毫升注射器充满冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS），穿刺的心脏的右心室，直到无血用PBS灌注肺。
- 剪切和删除的唾液腺暴露气管。此外，小心切气管周围的肌肉。
- 将一个22G留置气管插管插入，拔出针头，并推动对肺部的塑料导管。修复的导管，通过把一小块纱线围绕气管和导管。
2。肺组织的酶消化
如果需要的话，支气管肺泡灌洗液样品可以是制备通过在气管导管插入下一步骤之前，用PBS或培养基冲洗肺。
- 使用一个2毫升的注射器，小心地注入2毫升分散酶（从4毫升）的最大体积的通过导管进入肺，使得所有裂片完全展开。交换含有0.5毫升液化琼脂糖用1ml注射器和注射器也进入肺灌输。
- 将注射器留在导管上，以防止倒流琼脂糖并立即与实验室薄纸和冰覆盖肺。让琼脂糖凝胶一两分钟。
- 取出纸巾，冰，注射器，导管，切断气管和消费的肺，心脏和胸部的胸腺。然后在培养皿中，用PBS冲洗肺，取出心脏，胸腺，其余气管。
- 将肺成剩余的2毫升分散酶，并在室温下孵育45分钟。
3。制备的龙细胞悬浮
- 取出肺从分散酶，并将其转移到一碟含7毫升的anti-CD16/32抗体的（1μg/ ml的最终浓度）在DMEM培养基和100μlDNA酶。
- 使用镊子，完全瓦解拉它除了肺组织，并在室温下孵育10分钟，同时轻轻摇晃摇杆设置为200转。如果需要的话，然后可以被存储在细胞悬浮液在4℃下，直到下一个步骤。
- 先用100微米，随后用70微米，48微米和30微米孔隙通过尼龙网过滤细胞悬浮液。照顾以及管和菜肴用DMEM彻底冲洗的各网格的单元格，以减少损失，并最大限度地提高产量。如果你正在汇集样品，这可以在这里实现，随后通过细胞悬浮液通过一组小鼠相同的过滤器。续约在堵塞的情况下的过滤器。
- 根据卷上，将滤液转移到一个或多个50 ml离心管，并在160×g离心15分钟，4℃，离心除去上清液。
- 在2ml红细胞裂解缓冲液（0.15 M NH 4 Cl的 ，0.01M KHCO 3，0.1mM的EDTA，pH值7.2）中重悬细胞沉淀，并迅速终止通过加入13毫升的DMEM培养基中的溶解。在160×g离心12分钟，4℃，将该溶液转移到一个15毫升的试管和离心
4。抗体染色流式细胞仪检测细胞分选
- 3毫升的主要抗体鸡尾酒，准备在DMEM培养基稀释适合流式细胞仪分析，重悬细胞。 （抗体先前为最佳工作稀释滴定进行染色1×10 6个脾细胞中的体积为100μl。使用为每个所用的抗体对细胞的最佳浓度的的初级抗体混合物含有的3毫升汇集来自五个小鼠的。如果有更多的老鼠被汇集到一个样本，调整音量）。
- 染色，室温孵育10分钟，在黑暗中在4℃下
- 洗涤细胞填充15毫升DMEM培养基并离心管，在160×g离心12分钟，和4℃。
- 如果耦合或生物素标记的抗体用于4.1：去上清，悬浮细胞在2 - 3毫升二次抗体鸡尾酒。在黑暗中染色10分钟，在4°C。
- 通过填充管在160×g离心12分钟，4℃，用DMEM和离心来洗涤细胞
- 细胞重悬于1毫升DMEM和预过滤器中通过一个50微米的过滤器用于细胞分拣成管。可选：细胞计数，以获得总的在肺细胞悬浮液中的细胞数。
5。细胞分选
- 振荡排序前的细胞混合。使用100μm的喷嘴用于细胞分拣AECII。护套的流体压力，以及激光发射和检测波长依赖于所用的仪器为流式细胞仪细胞分选的荧光染料，以及用于在antib全球最著名的染色过程。
- 门上的SSC的高细胞中，所使用的荧光染料染色和排序管DMEM是否定的。使用前向散射的高度（FSC-H） - 区域（FSC-A）和侧向散射的高度（SSC-H）与面积（SSC-A）窗口，以排除任何双峰或细胞聚集体（详见门控策略图1）。
- 为了收集细胞，离心20分钟，在280 XG和4°C。
- 重悬细胞培养介质或缓冲所需的后续分析。
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Representative Results
排序时从健康小鼠肺细胞悬浮液的分离，AECII门通常会占到约42±10％的所有事件。这个百分比可以是明显降低用于呼吸系统疾病，如病毒感染的小鼠时，作为初始的细胞悬浮液，将含有相当高的比例，淋巴细胞和其他免疫细胞的招募呼吸道。有关AECII分离从在第3天以下感染IAV感染肺部中，我们已经观察到细胞在AECII门的频率减少了大约50％。
一个典型的排序和重新排序的细胞分析是描绘在图1和1个C。正如所指出的，分离的细胞的纯度，占大约92±5％。在图2a中，我们显示，成功的分离纯的细胞群，可经染色，表面活性蛋白C，这是表达AECII 16，17。
我们已观察到，每单个动物的数目的AECII分离强烈地依赖于所使用的小鼠品系。而BALB / c小鼠产生1×10×10 5 AECII /鼠标6 AECII /鼠标，C57BL / 6品系仅得1 - 3。因此，每个实验中使用的小鼠的数目依赖于鼠标应变以及要执行的后续分析的类型。
关于生存能力的检索AECII中，我们通常会发现流式细胞仪细胞分选后的生存能力率在90％左右。这种高比例的活细胞，然后可以直接功能分析以及短期培养分离的主要鼠AECII。
图1。概述Ø版本用于流式细胞仪的主要鼠AECII的隔离门控策略，通过阴性选择。（A）门控策略原理的概述。 （B）代表地块的肺细胞悬液排序的。 （C）代表的细胞重新分析的结果。 点击此处查看大图 。
图2。表征及分子分析的排序主要鼠AECII。（A）排序AECII细胞离心涂片染色的表面活性蛋白C（SPC）。相衬显微镜相比，几乎100％的细胞被发现是SPC阳性。 （B）代表RNA排序的主要的小鼠AECII后RNA隔离的档案。 18S和28S核糖体RNA的与所计算出的RIN因子一起的特定峰代表RNA I从AECII的完整离体RNA的ntegrity和质量。
图3。 A型流感病毒核蛋白（NP）的主要鼠从感染小鼠AECII孤立的表达分析。C57BL / 6小鼠滴鼻管理的磷酸盐缓冲生理盐水或A型流感病毒PR8/A/34 1，2或3天之前AECII隔离。 （A）代表未感染的肺细胞悬浮液从图以及为期三天的感染C57BL / 6小鼠染色进行排序。 （B）A型流感病毒NP排序AECII表达通过NP-特异性抗体和随后的流式细胞分析细胞内染色分析。 （C）该表显示了平均荧光强度（MFI）的NP染色。
图4。 （A）代表流式细胞分析前体内 A型流感病毒细胞内染色PR8/A/34的感染AECII由A型流感病毒NP 6 的A型流感病毒核蛋白（NP）的表达在体外感染的主要鼠AECII分析。小时后的感染。 （B）摘要代表性的结果NP-染色前体内 A型流感病毒感染AECII 6 h后感染不同的病毒稀释。
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Discussion
用流式细胞术隔离的小鼠AECII我们的协议提供了一个快速的方式访问主要的小鼠肺细胞的功能和分子生物学研究的整个范围。所描述的程序产生非常可行的，纯粹的人口AECII足够的数量，为的直接后续分析，如RNA分离（ 见图2b）和转录组的研究。对于功能性的应用程序，它也可以培养分离的细胞，允许， 例如生成AECII条件培养基或共培养实验。作为一个好处，尤其是对这些功能的研究，分离的原代细胞阴性选择的描述在这里产生不变的细胞没有受到抗体结合。然而，尽管研究初级AECII对这些细胞系中进行的优点，有实际限制的使用这些初级细胞。下一步仅仅局限在数字，可能不符合要求的研究需要广泛的筛选，主要AECII文化生存只为有限的时间，我们已经观察到平均约48小时。在这些短期培养实验中，我们已经基于培养基的选择的AECII条件培养基用于随后检测的性质，并取得了令人满意的结果用的IMDM（IMDM Glutamax，Gibco目录号31980），添加10％FCS的，标准的抗生素和0.25mMβ-巯基乙醇。
这里描述的协议，会显示一个比较容易和快速地隔离可行的，纯的主要鼠AECII在良好的数字。关键的，得到的分离后的细胞的纯度取决于细胞分选的方法。一个清晰而强烈的染色的细胞群体是被排除在外的，是同样重要的，因为严格的的SSC 高事件门控上，使污染以及类型的淋巴样细胞老子上皮细胞被最小化。关于分离的细胞的产率，我们已经观察到的，这是由广泛的冲洗管，过滤器网格和板的粗制的细胞悬浮液的制备过程中，以及通过酶消化后的组织的完全崩解最大化。的使用的主要AECII的主要好处之一是，他们可以直接从主机患有呼吸道的疾病被隔离。这样的AECII将被暴露在他们的自然微环境的所有因素，因此很好地反映体内的情况。不同于人类AECII 18，19，这可以扩展到了广泛的实验系统中工作时，小鼠模型。我们已经利用了这一点，在自身免疫性炎症以及肺病毒感染的研究。由此我们发现AECII，小鼠患CD4 + T细胞介导的呼吸道炎症表达了广泛的inflammat存储器的基因，这表明他们的潜力，调节肺的免疫反应3。此外，我们可以显示，AECII的显示自身抗原通过主要组织相容性复合体-II类分子而导致的功能的自动反应的CD4 + T细胞的活化。同时AECII保持肺耐受性，促进诱导的Foxp3 +调节性T细胞所分泌的因素。
对于病毒感染的肺，我们已成功分离出A型流感病毒感染小鼠的主要AECII。正如上面提到的，在这里AECII占的比例较小，全肺细胞悬液，相当数量的免疫细胞被招募到肺部，对感染的反应（ 见图3a）。 A型流感病毒核蛋白（NP）的分离的细胞内的细胞内染色显示增加表达的病毒蛋白在所示的过程中的时间
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢M.Höxter的排序的主要鼠AECII从生物安全2级样品的技术援助。
这项工作是支持的补助金从德国研究基金会（DFG）DB（SFB587，TP B12和BR2221/1-1的的）和的津贴从汉诺威生物医学研究学院（DFG GSC 108）AA。 DB支持总统的倡议下合同编号W2/W3-029德国研究中心，亥姆霍兹联合会（HGF）和网络基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
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References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
