Summary
Nous décrivons l'isolement rapide des primaires murins cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) par flux cytométrique sélection négative. Ceux-ci montrent AECII viabilité et à la pureté et conviennent à un large éventail d'études fonctionnelles et moléculaires concernant leur rôle dans les affections respiratoires comme les maladies auto-immunes ou infectieuses.
Abstract
Au cours des dernières années, la contribution des cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) à divers aspects de la régulation du système immunitaire dans le poumon a été de plus en plus reconnue. AECII Il a été démontré à participer à la production de cytokines dans les voies respiratoires enflammées et même agir comme cellules présentatrices d'antigène à la fois l'infection et des lymphocytes T auto-immunité médiée par 1-8. Par conséquent, ils sont particulièrement intéressants dans les contextes cliniques tels que l'hyper-réactivité des voies aériennes à l'étranger et des auto-antigènes ainsi que les infections qui ciblent directement ou indirectement AECII. Cependant, notre compréhension des fonctions immunologiques détaillées desservis par les cellules alvéolaires de type II épithéliales des poumons en bonne santé ainsi que dans l'inflammation reste fragmentaire. De nombreuses études concernant la fonction AECII sont effectuées à l'aide de la souris ou l'homme lignées de cellules épithéliales alvéolaires 9-12. Travailler avec des lignées de cellules offre certes de nombreux avantages, tels que la disponibilité d'un grand nombre of cellules pour des analyses approfondies. Cependant, nous croyons que l'utilisation de AECII murin primaire permet une meilleure compréhension du rôle de ce type de cellules dans des processus complexes comme l'infection ou une inflammation auto-immune. Primaire AECII murin peut être isolé directement à partir d'animaux qui souffrent de ces affections respiratoires, ce qui signifie qu'ils ont été soumis à tous les autres facteurs extrinsèques jouent un rôle dans la mise en analysés. A titre d'exemple, AECII viable peut être isolé à partir des souris infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe A, qui touche principalement les cellules à la réplication 13. En outre, grâce infection ex vivo de AECII isolés de souris saines, l'étude des réponses cellulaires montés lors de l'infection peut être prolongée.
Notre protocole pour l'isolement de AECII murin primaire est basée sur la digestion enzymatique de la souris suivies par les poumons d'étiquetage de la suspension cellulaire obtenue avec des anticorps spécifiques de CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 et CD16/CD32. AECII granulaires sont ensuite identifiés comme non marqué et la dispersion latérale élevée (SSC haut) et population de cellules sont séparées par tri cellulaire activé par fluorescence 3.
En comparaison à d'autres méthodes d'isolement de cellules primaires épithéliales de poumons de souris, notre protocole d'isolement par cytométrie de flux AECII par sélection négative donne intacte, très viable et pur AECII dans un temps relativement court. En outre, et contrairement aux méthodes conventionnelles d'isolement par le panoramique et l'épuisement des lymphocytes par l'intermédiaire de la liaison de l'anticorps couplés billes magnétiques 14, 15, cytométrie en flux de tri cellulaire permet la discrimination par le biais de la taille des cellules et la granularité. Étant donné que l'instrumentation pour le tri cellulaire par cytométrie en flux est disponible, la procédure décrite peut être appliquée à des coûts relativement faibles. Suivant les anticorps et les enzymes standards pour la désintégration du poumon, pas de réactifs supplémentaires tels que magnétiqueperles sont nécessaires. Les cellules isolées sont adaptés à un large éventail d'études fonctionnelles et moléculaires, notamment la culture in vitro et des essais de stimulation des cellules T ainsi que transcriptome, du protéome ou des analyses sécrétome 3, 4.
Protocol
Les détails concernant les réactifs et les matériaux requis sont répertoriés dans le tableau à la fin du protocole ci-dessous. Avant de commencer à travailler, préparer des tubes de 15 ml (un par souris) contenant 4 ml de dispase et préchauffer les à 37 ° C dans un bain-marie. Dans un bloc de chauffage, chauffer rapidement de petites aliquotes de 1% d'agarose bas point de fusion (dans l'eau) à 95 ° C jusqu'à ce que liquéfié et ensuite refroidir à 45 ° C jusqu'à utilisation.
1. Préparation du poumon de souris
- Sacrifiez la souris par le CO 2 asphyxie. Remarque: Ne pas effectuer dislocation cervicale car cela blesser la trachée afin que les étapes suivantes du protocole, tels que l'installation du poumon avec le liquide, ne peut pas être réalisée avec succès. Veiller à une perte des réflexes nociceptifs.
- Pulvériser la souris avec de l'éthanol et de faire une longue incision le long de la ligne médiane ventrale du corps. Tirez le pelage ventral et la peau et par la suite aussi bien couper et enlever le péritoine.
- Exsangue l'souris en coupant la veine jugulaire droite et gauche (veine jugulaire), ainsi que l'artère rénale (renalis Arteria). Retirez le sang qui coule avec le tissu.
- Attentivement la perforation, puis retirer la membrane pour exposer le coeur et les poumons en coupant les côtes. Faites attention de ne pas blesser le poumon.
- Avec une canule 26G et une seringue de 10 ml remplie de phosphate froid (PBS), la perforation du ventricule droit du cœur et le poumon perfuser avec du PBS jusqu'à disparition de sang.
- Couper et enlever les glandes salivaires pour exposer la trachée. Aussi soigneusement coupé les muscles entourant la trachée.
- Insérez une canule à demeure 22G dans la trachée, retirez l'aiguille et pousser le cathéter en plastique vers le poumon. Fixer le cathéter en attachant un petit morceau de fil autour de la trachée et du cathéter.
2. La digestion enzymatique du tissu pulmonaire
Si vous le souhaitez, un échantillon de fluide de lavage bronchoalvéolaire peut êtrepréparé par rinçage les poumons par l'intermédiaire du cathéter inséré dans la trachée ou avec du PBS support avant l'étape suivante.
- En utilisant une seringue de 2 ml, soigneusement insuffler un volume maximal de 2 ml de dispase (à partir de l'aliquote de 4 ml) dans les poumons à travers le cathéter de sorte que tous les lobes sont pleinement développées. Échanger la seringue avec une seringue de 1 ml contenant 0,5 ml de la gélose liquéfiée et aussi instiller dans les poumons.
- Laissez la seringue sur le cathéter pour empêcher le reflux de l'agarose et couvrir immédiatement les poumons avec du papier absorbant de laboratoire et de la glace. Laissez le gel d'agarose pour un couple de minutes.
- Retirer le papier de soie, de la glace, la seringue et le cathéter, couper la trachée et de l'accise du poumon, le cœur et le thymus de la poitrine. Ensuite, rincez le poumon dans un plat avec du PBS et retirer le cœur, le thymus et la trachée reste.
- Mettez le poumon dans le reste de 2 ml de dispase et incuber à température ambiante pendant 45 minutes.
3. Préparation du poumonSuspension cellulaire
- Retirez le poumon de la dispase et le transférer dans un plat contenant 7 ml de anti-CD16/32 anticorps (1 pg / ml de concentration finale) dans du milieu DMEM et 100 ul de DNase.
- En utilisant des pinces, complètement désintégrer le tissu pulmonaire en le tirant à l'écart et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante tout en secouant délicatement sur une bascule réglé à 200 tours par minute. Si vous le souhaitez, la suspension de cellules peuvent ensuite être stockés à 4 ° C jusqu'à l'étape suivante.
- Filtrer la suspension de cellules à travers les mailles de nylon abord avec 100 um et par la suite avec 70 um, 48 um et 30 um pores. Prendre soin de laver chaque maille ainsi que les tubes plats et à fond avec du DMEM pour minimiser la perte de cellules et à maximiser le rendement. Si vous êtes mise en commun des échantillons, cela peut être réalisé ici par la suite, passant suspensions de cellules de souris d'un groupe à travers le même filtre. Remplacement du filtre en cas de colmatage.
- En fonction du volume, de transférer le filtrat à un ou plusieurs tubes de 50 ml etcentrifuger pendant 15 min à 160 xg et 4 ° C. Enlever le surnageant.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de tampon de lyse des érythrocytes (0,15 M NH 4 Cl, 0,01 M KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) et mettre fin rapidement lyse par addition de 13 ml de milieu DMEM. Transférer la solution dans un tube de 15 ml et centrifuger pendant 12 min à 160 xg et 4 ° C.
4. La coloration d'anticorps de flux cellulaire par cytométrie de tri
- Reprendre les cellules dans 3 ml de cocktail d'anticorps primaire, préparée dans du milieu DMEM à des dilutions appropriées pour la cytométrie en flux. (Anticorps ont été préalablement titrée pour les dilutions de travail optimales par coloration 1 x 10 6 splénocytes dans un volume de 100 pl. Utiliser 3 ml de cocktail d'anticorps primaire contenant des concentrations optimales pour chacun des anticorps utilisés pour les cellules mises en commun d'un maximum de cinq souris. Si plus de souris sont mises en commun pour un échantillon, régler le volume).
- Pour la coloration, incuber les cellules pendant 10 min dans l'obscuritéà 4 ° C.
- Laver les cellules en remplissant le tube de 15 ml avec du milieu DMEM et centrifugation pendant 12 min à 160 xg et 4 ° C.
- Dans le cas des anticorps biotinylé ou découplées ont été utilisés dans 4.1: Enlever le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 à 3 ml cocktail d'anticorps secondaire. Colorer pendant 10 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver les cellules à travers le remplissage du tube avec du DMEM et centrifugation pendant 12 min à 160 xg et 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de DMEM et de pré-filtre à travers un filtre 50 um dans un tube de tri cellulaire. En option: Compter les cellules pour obtenir le nombre total de cellules dans la suspension de cellules du poumon.
5. Tri cellulaire
- Mélanger les cellules au vortex avant triage. Utiliser une buse de 100 um de tri cellulaire de AECII. Pression de fluide de gaine ainsi que des longueurs d'onde d'émission du laser et de détection dépend de l'instrument utilisé pour l'écoulement de tri cellulaire par cytométrie de même que les fluorochromes utilisés dans le ANTIBody procédure de coloration.
- Porte sur les cellules CSE élevés qui sont négatifs pour les fluorochromes utilisés pour la coloration et le tri dans un tube contenant du DMEM. Utiliser avant la hauteur de dispersion (FSC-H) vs zone (FSC-A) et la hauteur de dispersion latérale (SSC-H) vs zone (SSC-A) fenêtres afin d'exclure tout doublets ou des agrégats de cellules (voir les détails de la stratégie de porte à Figure 1 a).
- Afin de recueillir la centrifugeuse triés cellules pendant 20 min à 280 xg et 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules dans la culture ou de support d'un tampon tel que requis pour une analyse ultérieure.
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Representative Results
Lors du tri des suspensions de cellules pulmonaires isolées à partir de souris saines, la porte sera AECII représentent généralement environ 42 ± 10% de tous les événements. Ce pourcentage peut être nettement plus faible lorsque les souris atteintes de maladies respiratoires telles que une infection virale sont utilisées, comme la suspension cellulaire initiale contient une proportion considérablement plus élevée de lymphocytes et d'autres cellules immunitaires recrutées pour les voies respiratoires. Pour AECII isolés de poumons infectés IAV sur 3 jours après l'infection, nous avons observé une réduction de la fréquence des cellules dans la grille AECII d'environ 50%.
Une sorte typique ainsi que ré-analyse des cellules triées est représenté sur les figures 1 b et 1 c. Comme indiqué, la pureté des cellules isolées représente environ 92 ± 5%. Dans la figure 2a, nous montrons que la séparation réussie des populations cellulaires pures peut être confirmée par coloration de protéines tensio-C, ce qui est exprimé exclusivement parAECII 16, 17.
Nous avons constaté que le nombre de AECII isolé par animal dépend fortement de la souche de souris utilisée. Alors que souris BALB / c donnent typiquement 1 x 10 6 AECII / souris, la souche C57Bl / 6 seulement des rendements de 1 à 3 x 10 5 AECII / souris. Le nombre de souris utilisées par expérience dépend donc de la souche de souris ainsi que le type d'analyses ultérieures doivent être effectuées.
En ce qui concerne la viabilité de l'AECII récupéré, nous constatons habituellement des taux de viabilité de 90% environ après écoulement de tri cellulaire par cytométrie. Cette forte proportion de cellules viables permet alors directes analyses fonctionnelles ainsi que la culture à court terme de la AECII isolé murin primaire.
Figure 1. O Vue d'ensemblever la stratégie de déclenchement utilisés pour l'isolation par cytométrie de flux AECII murin primaire par une sélection négative. Aperçu schématique (A) sur la stratégie de déclenchement. (B) des parcelles représentatives d'une sorte de suspension du poumon. (C) résultat Représentant d'une ré-analyse des cellules triées. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Caractérisation et analyse moléculaire de tri AECII murin primaire. (A) cytospins de AECII triés ont été colorées pour la protéine C du surfactant (CPS). Par rapport à la microscopie à contraste de phase, près de 100% des cellules ont été jugés positifs CPS. (B) représentant le profil de l'ARN triés AECII murin primaire après ARN isolement. Des pics spécifiques pour 18S et ARN ribosomal 28S ainsi que le facteur calculé RIN représentent i ARN ntegrity et de qualité pour intacts ARN isolés à partir AECII.
Figure 3. Analyse de la grippe A nucléoprotéine du virus (NP) expression dans AECII murin primaire isolée de souris infectées. C57Bl / 6 ont été administré par voie intranasale saline tamponnée au phosphate ou le virus grippal A PR8/A/34 les jours 1, 2 ou 3 avant l'isolement AECII . (A) des parcelles représentatives des suspensions de cellules pulmonaires de non infectée ainsi que de trois jours tachées infecté souris C57BL / 6 pour le tri. (B) La grippe A virus dans l'expression NP AECII triés a été analysée par coloration intracellulaire avec un anticorps spécifique NP et après analyse par cytométrie de flux. (C) Le tableau montre l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) de la coloration NP.
Figure 4. Analyse de la grippe A nucléoprotéine du virus (NP) dans l'expression ex vivo infectées primaire murin AECII. (A) représentant cytométrie de flux de l'analyse ex vivo virus influenza A PR8/A/34 AECII infectés par coloration intracellulaire pour le virus grippal A NP 6 h post-infection. (B) Résumé des résultats représentatifs de NP-coloration des ex vivo de la grippe A virus a infecté AECII 6 h après l'infection avec des dilutions de virus différents.
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Discussion
Notre protocole pour l'isolement des murin AECII par cytométrie en flux offre un moyen rapide d'accéder à des cellules primaires du poumon de souris pour toute une série d'études fonctionnelles et moléculaires. La procédure décrite donne populations très viables et pure de AECII qui sont en nombre suffisant pour les analyses ultérieures directes, telles que l'ARN isolés (voir figure 2b) et l'étude du transcriptome. Pour les applications fonctionnelles, il est également possible de cultiver des cellules isolées, ce qui permet par exemple la génération de AECII milieu conditionné ou des expériences de co-culture. Comme un avantage particulier pour ces études fonctionnelles, l'isolement de cellules primaires par une sélection négative telle que décrite ici donne des cellules intactes qui n'ont pas fait l'objet d'anticorps. Cependant, malgré les avantages des études en AECII primaire par rapport à ceux effectués dans des lignées cellulaires, il existe des limites pratiques à l'utilisation de ces piles. A côté de la simple limitation du nombre de, Qui pourraient ne pas satisfaire aux exigences des études nécessitant criblage extensif, primaire AECII survivre dans la culture que pour un temps limité que nous avons observé en moyenne autour de 48 heures. Dans ces expériences, la culture à court terme, nous avons fondé le choix du milieu de culture sur la nature des essais ultérieurs, l'AECII milieu conditionné a été utilisé à l'intérieur et ont obtenu des résultats satisfaisants avec IMDM (IMDM Glutamax, Gibco No. de cat. 31980) supplémenté avec 10% de FCS, antibiotiques standards et 0,25 mM β-mercaptoéthanol.
Le protocole décrit ici affiche un moyen relativement facile et rapide d'isoler viable et pur AECII primaire murin en grand nombre. La pureté des cellules a abouti après la séparation dépend essentiellement de la procédure de tri cellulaire. Une coloration claire et forte des populations de cellules qui doivent être exclus est aussi important que de déclenchement strictes sur les événements SSC élevés, de sorte que des contaminations avec des cellules lymphoïdes comme le type de bienI cellules épithéliales sont minimisés. En ce qui concerne le rendement des cellules séparées, nous avons constaté que cela est maximisée par rinçage complète de tubes, filets filtrants et plaques lors de la préparation de la suspension cellulaire brut ainsi que par la désintégration complète du tissu après digestion enzymatique. Un des principaux avantages de travailler avec AECII primaire, c'est qu'ils peuvent être isolées directement à partir d'hôtes souffrant de maladies des voies respiratoires. AECII sera réputé avoir été exposé à tous les facteurs présents dans leur micro-environnement naturel et donc bien tenir compte de la situation in vivo. Contrairement à la consommation humaine AECII 18, 19, ce qui peut être étendue à un large éventail de systèmes expérimentaux lorsque l'on travaille dans des modèles murins. Nous avons tiré profit de cela dans les études concernant l'inflammation auto-immune ainsi que l'infection virale du poumon. Ainsi nous avons constaté que AECII de souris souffrant de cellules T CD4 + médiée inflammation des voies respiratoires exprimer un large éventail de inflammatory gènes qui démontrent leur potentiel pour la régulation des réponses immunitaires du poumon 3. En outre, nous avons pu montrer que l'affichage AECII auto-antigènes à travers complexe majeur d'histocompatibilité de classe II-molécules qui se traduit par l'activation fonctionnelle de cellules CD4 + réactifs automobiles cellules T. Dans le même temps AECII maintenir la tolérance du poumon en sécrétant des facteurs favorisant l'induction de Foxp3 + cellules T régulatrices 4.
En ce qui concerne les infections virales du poumon, nous avons réussi à isoler AECII primaire de souris infectées par le virus grippal A. Comme mentionné ci-dessus, voici AECII compte une proportion plus faible de la suspension cellulaire poumon entier, comme un nombre considérable de cellules immunitaires sont recrutés dans les poumons en réponse à l'infection (voir figure 3a). Coloration intracellulaire de la grippe A nucléoprotéine du virus (NP) à l'intérieur des cellules isolées montre expression croissante de la protéine virale au cours du temps comme indiqué dans
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier M. Höxter d'assistance technique dans le tri primaire AECII murin de niveau de biosécurité 2 échantillons.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation allemande de recherche (DFG) à DB (SFB587, TP B12 et BR2221/1-1) et une bourse de l'École Hanovre recherche biomédicale (DFG CGC 108) à AA. DB est soutenu par l'Initiative du Président et du Fonds de réseautage de l'Association Helmholtz des centres de recherche allemands (HGF), sous le numéro de contrat W2/W3-029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
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