Summary
我々は、フローサイトメトリーのネガティブ選択による一次マウスII型肺胞上皮細胞（AECII）の迅速な単離を記述している。これらAECIIは高い生存率と純度を示し、そのような自己免疫疾患や感染症などの呼吸器疾患におけるそれらの役割に関する機能と分子生物学的研究の広い範囲のために適しています。
Abstract
最後に年間を通して、肺における免疫制御のさまざまな側面に肺胞II型上皮細胞（AECII）の寄与がますます認識されてきた。 AECIIは、炎症を起こした気道でのサイトカイン産生に参加しても感染やT細胞媒介性自己免疫1月8日の両方において抗原提示細胞として作用することが示されている。したがって、彼らはそのような外国人と自己抗原と同様に、直接または間接的にターゲットAECII感染に対する気道過敏性などの臨床の文脈でも、特に興味深いものです。しかし、健康な肺だけでなく、炎症で肺胞II型上皮細胞によって提供される詳細な免疫機能の我々の理解では、断片的なままである。 AECII機能に関する多くの研究が9月12日 、マウスやヒトの肺胞上皮細胞株を使用して実行されます。セルラインでの作業は確かにそのような大量の可用性oと、様々な利点を提供します詳細な分析のためのf細胞。しかし、我々は、プライマリマウスAECIIの使用は感染症や自己免疫炎症のような複雑なプロセスでこの細胞タイプの役割の理解を深めることができると信じています。プライマリマウスAECIIは、彼らが分析設定の役割を果たしているすべての追加の外的要因の影響を受けてきた意味、そのような呼吸器疾患を患っている動物から直接単離することができる。例として、実行可能なAECIIは鼻腔内に主に複製13のためにこれらの細胞を標的とするインフルエンザウイルスに感染したマウスから単離することができる。重要なのは、健康なマウスから単離しAECII の ex vivo での感染を介して、感染時にマウントされた細胞応答の研究は、さらに拡張することができます。
プライマリーネズミAECIIの単離のための私達のプロトコルは、CD11cのは、CD11b、F4/80に特異的な抗体で得られた細胞懸濁液を標識続いマウス肺の酵素消化に基づいているCD19、CD45およびCD16/CD32。粒状AECIIは次に高いラベルの付いていないと脇に散乱（SSC 高 ）細胞集団として同定されており、3を並べ、蛍光活性化細胞で区切られています。
マウス肺からプライマリ上皮細胞を単離する代替的な方法と比較して、負の選択によるAECIIのフローサイトメトリ分離のための我々のプロトコルは比較的短時間で手つかず、極めて現実的で純粋AECIIをもたらします。また、パンとリンパ球の減少による分離の従来の方法とは対照的に、抗体結合磁気ビーズ14,15の結合を介して、フローサイトメトリー細胞ソーティングは、細胞の大きさや細かさによって差別することができます。フローサイトメトリー細胞選別のための計装が使用可能であることを考えると、説明された手順は、比較的低コストで適用できます。このような磁気のような肺の崩壊のために標準的な抗体や酵素、追加の試薬の隣ビーズが必要です。単離された細胞は 、in vitro 培養およびT細胞刺激アッセイならびにトランスクリプトーム、プロテオーム、またはsecretome で分析3、4、機能および分子生物学的研究の広い範囲に適しています。
Protocol
必要な試薬および材料に関する詳細は、下記のプロトコール末尾の表にリストされています。水浴中で37℃に作業を開始する前に、ディスパーゼ4mlを含む15 mlチューブを使って（マウス1匹あたり1）を準備し、事前暖かいそれら。加熱ブロックでは、まもなく95から1パーセント低融点アガロース（水中）の小アリコートを加熱℃で液化するまで、使用するまで45℃に続いてクール。
1。マウス肺の調製
- CO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げる。注：正常に実行できませんが、そのような液体と肺のインストールとして、プロトコルの手順に従うように、これは気管を傷つけるように頸椎脱臼を実行しないでください。侵害受容性反射の消失を確認してください。
- エタノールでマウスをスプレーし、体の腹側正中線に沿って長いカットを行います。腹毛や皮膚を引き、その後も慎重にカットし、腹膜を削除します。
- Exsanguinate左と右の頚静脈（ 頸静脈 ）並びに腎動脈（ 腎動脈 ） を切断することによって、マウス。組織と流れる血液を除去する。
- 慎重に穿刺してからリブを切り欠いて、心臓や肺を露出するようにダイヤフラムを取り外します。肺を傷つけないよう十分注意してください。
- 緩衝生理食塩水（PBS）冷リン酸で満たさ26Gカニューレおよび10mlのシリンジを用いて、穿刺、心臓の右心室と血がなくなるまでPBSで肺を灌流。
- 気管を露出するために唾液腺を切り取り、削除します。また、慎重に気管を周囲の筋肉を切った。
- 気管に22Gの留置カニューレを挿入し、針を除去し、肺に向かってプラスチック製のカテーテルを押してください。気管およびカテーテルの周りに糸の小片を結合することにより、カテーテルを固定します。
2。肺組織の酵素消化
必要であれば、気管支肺胞洗浄液サンプルはできる次のステップに進む前に、PBSまたは培地で気管内に挿入されたカテーテルを介して肺を洗浄することによって調製した。
- 2ミリリットルのシリンジを用いて、慎重にすべてのローブが完全に展開されるように、カテーテルを介して肺にディスパーゼの2ミリリットル（4 mlのアリコートから）の最大音量を植え付ける。液化アガロース0.5 mlを含む1mlシリンジで注射器を交換し、また肺に植え付ける。
- アガロースの逆流を防止し、すぐに実験室のティッシュペーパーと氷で肺をカバーするためにカテーテルにシリンジのままにしておきます。分のカップルのためのアガロースゲルをみましょう。
- 胸から肺、心臓、胸腺、ティッシュペーパー、氷、注射器やカテーテルを取り外して気管を切断し、消費税。その後、PBSで皿に肺を洗浄し、心臓、胸腺、残りの気管を削除します。
- ディスパーゼの残りの2ミリリットルに肺を入れて、45分間室温でインキュベートする。
3。肺の調製細胞懸濁液
- ディスパーゼから肺を外し、DMEM培地、100μlのDNaseでanti-CD16/32抗体の7ミリリットル（1μg/ mlの最終濃度）を含む皿に移す。
- ピンセットを用いて、それを完全に引き離すことにより肺組織を崩壊させ、穏やかに200rpmに設定ロッカーに揺らしながら室温で10分間インキュベートする。必要に応じて、細胞懸濁液は、その後、次のステップまで4℃で保存することができます。
- 100μmであり、その後で、70ミクロン、48ミクロン、30ミクロンの細孔を有する第一ナイロンメッシュを介して細胞懸濁液をろ過する。細胞の損失を最小限に抑え、歩留まりを最大化するために、各メッシュだけでなく、DMEMで徹底的にチューブや食器を洗うために世話をする。あなたがサンプルをプールしている場合、これはその後に同じフィルタを介して1つの群のマウス由来の細胞懸濁液を通過させることによってここに達成することができます。目詰まりした場合にフィルタを新たにする。
- ボリュームに応じて、1つまたは複数の50mlチューブにろ液を転送し、160×gで15分間、4℃で遠心分離上清を取り除きます。
- 2ミリリットル赤血球溶解バッファー（0.15M NH 4 Clを 、0.01M KHCO3、0.1mMのEDTA、pH7.2）中で細胞ペレットを再懸濁し、迅速DMEM培地13ミ リリットルを添加して溶解を終了します。 15 mlのチューブと遠心分離機160×gで12分間、4℃に溶液を移す
4。フローサイトメトリー細胞選別のための抗体染色
- フローサイトメトリーに適した希釈でDMEM培地で調製した3ミリリットル一次抗体カクテル、中に細胞を再懸濁します。 （抗体は以前に100μlの体積で1×10 6脾臓細胞を染色することによって最適な作業希釈の滴定した。使用は5匹までからプールされた細胞のために使用される抗体のそれぞれについて、最適な濃度を含む一次抗体カクテルの3ミリリットル。より多くのマウスは1サンプルにプールされている場合は、ボリュームを調整してください）。
- 染色のために、暗所で10分間細胞をインキュベート4℃
- 160×gで12分および4のDMEM培地、遠心分離にて15mlチューブを充填することにより、細胞を洗浄℃、
- ケースでは非結合またはビオチン化抗体が4.1で使用された：2で上清を除去し、細胞を再懸濁し - 3ミリリットル二次抗体カクテル。暗闇の中で10分間4℃で染色。
- 160×gで12分間、4℃でDMEMおよび遠心チューブを充填を介して細胞を洗う
- セルソーティングのためのチューブにフィルターが50μmを通過DMEMおよびプレフィルター1mlに細胞を再懸濁する。オプション：肺の細胞懸濁液中の総細胞数を得るために、細胞をカウントする。
5。セルソーティング
- 並べ替えの前にボルテックスにより細胞を混ぜる。 AECIIのセルソーティングのために100μmのノズルを使用しています。シース液圧だけでなく、レーザー発光、検出波長は、フローサイトメトリー細胞選別ならびにantibで使用蛍光色素のために使用される機器に依存ODY染色法。
- DMEMを含むチューブに染色とソートに使用される蛍光色素に対して陰性であるSSCの高い細胞にゲート。 （SSC-）ウィンドウ（でゲーティング戦略の詳細を参照して任意のダブレットまたは細胞凝集体を除外するには、散布高さ（FSC-H）対面積（FSC-A）と側方散乱の高さ（SSC-H）対面積フォワードを使用図1）。
- 選別された細胞は、20×gで280分、4℃で遠心分離収集するために、
- その後の分析の必要に応じて、文化培地または緩衝液で細胞を再懸濁します。
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Representative Results
健康なマウスから単離された肺の細胞懸濁液をソートする場合、AECIIゲートは通常は約42を占めることになるすべてのイベントの±10％。この割合は、初期の細胞懸濁液は、気道に補充リンパ球および他の免疫細胞のかなり高い割合が含まれていますように、このようなウイルス感染などの呼吸器疾患を持つマウスを使用する場合に著しく低くすることができる。 AECIIのために、私たちは約50％AECIIゲート内の細胞の頻度の減少を観察してきた3日目、次の感染にIAV感染肺から単離された。
選別された細胞の典型的なものとしてだけでなく、再分析は、 図1bおよび 1cに描かれている。示されるように、単離された細胞の純度はおよそ92±5％を占めています。 図2aに 、私たちは純粋な細胞集団の分離が成功したことにより排他的に発現されている界面活性タンパク質Cのために染色することによって確認することができる表示AECII 16、17。
我々は、単一の動物ごとに分離されAECII数は強く使用マウス系統に依存していることを観察している。 BALB / cマウスは、典型的には、1×10が得られるのに対し、6 AECII /マウス、C57BL / 6系統のみ利回り1から3×10 5 AECII /マウス。したがって、実験ごとに使用したマウスの数は、マウス系統と同様に実行される後続の分析の種類によって異なります。
取得AECIIの生存に関しては、通常はフローサイトメトリー細胞選別後に約90％の生存率を見つける。生存細胞のこの高い割合は、ダイレクト機能解析ならびに単離された一次ネズミAECIIの短期培養を可能にします。
図1。概要O負の選択によって、プライマリマウスAECIIのフローサイトメトリーを分離するために使用されるバージョンのゲーティング戦略ゲー戦略上の（A）の概略図。 （B）は肺の細胞懸濁液のソートの代表的なプロット。 （C）は選別された細胞の再分析の代表的な結果が。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。キャラクタリゼーションとソートのプライマリネズミAECIIの分子解析（A）ソートAECIIのサイトスピンはサーファクタントプロテインC（SPC）を染色した。位相差顕微鏡と比較して、細胞のほぼ100％がSPC陽性であることが判明した。 RNAを単離した後、一次ソートネズミAECIIの（B）の代表RNAプロファイル。計算されたRINの要因と一緒に18Sと28SリボソームRNAに特異的なピークはiを表すRNA AECIIから無傷の単離されたRNAのためのntegrityと品質。
図3。インフルエンザに感染したマウスから単離された一次ネズミAECIIにおけるウイルス核タンパク質（NP）の発現解析。C57BL / 6マウスに鼻腔内にリン酸が1日目、2または3に生理食塩水またはインフルエンザウイルスPR8/A/34バッファリング投与したAECII分離に先立っ。 （A）は感染していないから肺細胞懸濁液の代表的なプロットだけでなく、ソートのための3日間の感染C57BL / 6マウスの染色した。 （B）はインフルエンザソートAECIIにおけるウイルスのNP発現はNP特異的抗体と後続のフローサイトメトリー解析による細胞内染色により分析された。 （c）表は、NP染色の平均蛍光強度（MFI）を示しています。
図4。インフルエンザウイルスの核タンパク質（NP）プライマリーネズミAECIIを感染のex vivoでの発現の解析。ex vivoでインフルエンザインフルエンザウイルスNP 6の細胞内染色によるウイルス感染PR8/A/34 AECIIの（A）の代表フローサイトメトリー分析時間後に感染。 ex vivoでインフルエンザウイルスの異なる希釈でAECII 6時間後に感染症に感染したウイルスのNP染色からの代表的な結果の（B）の概要。
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Discussion
フローサイトメトリーによるマウスAECIIの単離のための我々のプロトコルは、機能と分子生物学的研究の全体の範囲のためのマウス肺から初代培養細胞にアクセスするための迅速な方法を提供しています。説明する手順では、このようなRNAの単離（ 図2bを参照）、トランスクリプトーム研究などの直接その後の分析のための番号で十分ですAECIIの非常に現実的で純粋な集団が得られます。機能的なアプリケーションでは、AECII馴化培地または共培養実験の世代EGできるように、単離された細胞を培養することも可能です。特にこれらの機能研究のための利点として、ここで説明したように負の選択による初代培養細胞の単離は、抗体結合の対象とされていない手つかずの細胞が得られます。しかし、細胞株において行われるものを介してプライマリAECIIにおける研究の利点にもかかわらず、これらの一次細胞の使用に実用上の制限があります。数字の単なる制限の隣、大規模なスクリーニングを必要とする研究の要件を満たしていないことでしょうが、一次AECIIのみ我々は48時間の周りの平均に観察している限られた時間のための文化の中で生き残る。これらの短期培養実験では、AECII馴化培地で使用されていたその後のアッセイの性質に培地の選択に基づいており、IMDM（IMDMグルタマックス、Gibco社カタログ番号31980）を補充して満足のいく結果を達成している10％FCS、標準抗生物質と0.25mMのβ-メルカプトエタノール。
ここで説明されたプロトコルは良い数字で生存し、純粋な一次マウスAECIIを単離するのは比較的簡単かつ迅速な方法を表示します。分離後に得られた細胞の純度は非常に細胞選別の手順に依存します。除外される細胞集団の明確かつ強い染色は、SSCの高いイベントに対して厳しいゲーとしても同様に重要であるように、井戸型、リンパ細胞と汚染私は上皮細胞は最小限に抑えられます。分離した細胞の収率につきましては、これは粗細胞懸濁液の調製時と同様に酵素消化後の組織の完全な崩壊によってチューブ、フィルターメッシュ、プレートの広範囲のフラッシングによって最大化されていることを観察した。プライマリーAECIIでの作業の一つの主な利点は、彼らは、気道の病気に苦しんでホストから直接単離することができるということです。このようなAECIIは、その自然の微小環境に存在するすべての要因にさらされて、したがって、よく生体内の状況に反映されているでしょう。マウスモデルで作業するときに人間AECII 18、19の場合とは異なり、これは実験的なシステムの広い範囲に拡張することができます。我々は、自己免疫炎症ならびに肺のウイルス感染に関する研究でこのことの利点を取っている。そこで、本研究では、CD4を患ったマウスからAECII + T細胞媒介気道炎症がinflammatの広い範囲を表現することがわかった肺の免疫応答を調節するための3彼らの可能性を示してORY遺伝子。さらに、我々は自己抗原反応性CD4オートの機能の活性化+ T細胞は、その結果、主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子を介して、そのAECII表示を示すことができた。同時にAECIIは、Foxp3の誘導+制御性T細胞4を促進分泌因子による肺トレランスを維持する。
肺のウイルス感染に関しては、我々は正常にインフルエンザウイルスを感染させたマウスからの一次AECIIを単離した。免疫細胞のかなりの数が（ 図3aを参照）感染に反応して肺に動員されるように全体の肺の細胞懸濁液の小さい割合については、上記に述べたように、ここでAECIIアカウント。に示すように、単離された細胞内でインフルエンザウイルスの核タンパク質（NP）の細胞内染色には、時間の経過とともに、ウイルスタンパク質の増加する式を示しています
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、バイオセーフティーレベル2のサンプルから一次マウスAECIIをソートする際に技術的な支援のためにM.ヘクスターに感謝したいと思います。
この作品は、ドイツ研究協会（DFG）からDB（SFB587、TP B12とBR2221/1-1）、ハノーバー医学研究科（DFG GSC 108）からAAへの奨学金への補助金によって支えられている。 DBは契約番号W2/W3-029下ドイツ研究センターのヘルムホルツ協会（HGF）は大統領のイニシアティブ及びネットワーキング基金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
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