Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Published: December 26, 2012 doi: 10.3791/4322
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 2, 1,2, 1
1Research Group Immune Regulation, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Research Group Infection Immunology, Institute of Medical Microbiology, Otto-von-Guericke University, 3Department of Experimental Immunology, Helmholtz Centre for Infection Research

Summary

Vi beskriver den raske isolasjon av primære murine type II alveolære epitelceller (AECII) etter flowcytometrisk negativ seleksjon. Disse AECII viser høy levedyktighet og renhet, og er egnet for et bredt spekter av funksjonelle og molekylære studier innen sin respiratoriske tilstander som autoimmune eller smittsomme sykdommer.

Abstract

Gjennom de siste årene har bidraget fra alveolære type II epitelceller (AECII) til ulike aspekter av immunsystemet regulering i lungene blitt stadig mer anerkjent. AECII har vist å delta i cytokin produksjon i betent luftveier og å selv fungere som antigen-presenterende celler i både infeksjon og T-celle mediert autoimmunitet 1-8. Derfor er de spesielt interessant også i kliniske sammenhenger som luftveiene hyper-reaktivitet til utenriks-og self-antigener og infeksjoner som direkte eller indirekte er rettet mot AECII. Forblir imidlertid vår forståelse av de detaljerte immunologiske funksjoner servert av alveolare type II epitelceller i sunn lunge samt i betennelse fragmentarisk. Mange studier om AECII funksjon utføres ved hjelp av musen eller menneskelige alveolære epitelceller cellelinjer 9-12. Arbeide med cellelinjer tilbyr sikkert en rekke fordeler, slik som tilgjengelighet av store tall of celler for omfattende analyser. Vi tror imidlertid at bruk av primær murine AECII gir en bedre forståelse av hvilken rolle denne celletypen i komplekse prosesser som infeksjon eller autoimmune betennelse. Primær murine AECII kan isoleres direkte fra dyr som lider av slike åndedrettsproblemer, som betyr at de har vært utsatt for alle andre ytre faktorer spiller en rolle i den analyserte innstillingen. Som et eksempel, kan levedyktig AECII isoleres fra mus intranasalt infisert med influensa A virus, som primært er rettet mot disse cellene for replikering 13. Viktigere, gjennom ex vivo infeksjon av AECII isolert fra friske mus, kan studier av cellulære responser montert på infeksjon bli ytterligere utvidet.

Vår protokoll for isolering av primær murine AECII bygger på enzymatisk fordøyelse av musen lunge etterfulgt av merking av den resulterende cellesuspensjonen med antistoffer som er spesifikke for CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 og CD16/CD32. Granulære AECII blir deretter identifisert som den umerkede og sideveis scatter høy (SSC høy) cellepopulasjon og atskilles med fluorescens aktivert celle sortering 3.

I forhold til alternative metoder for å isolere primære epitelceller fra mus lungene, gir vår protokoll for flowcytometrisk isolering av AECII etter negativ seleksjon urørt, høyst livskraftig og ren AECII i relativt kort tid. I tillegg, og i motsetning til konvensjonelle metoder for isolering ved å panorere og uttømming av lymfocytter via binding av antistoff-koplede magnetiske kuler 14, 15, tillater flowcytometrisk celle-sortering diskriminering ved hjelp av cellestørrelse og granularitet. Gitt at instrumentering for flowcytometrisk celle sortering er tilgjengelig, kan den beskrevne fremgangsmåte følges ved relativt lave kostnader. Ved siden av standard antistoffer og enzymer for lunge oppløsning, ingen ekstra reagenser som magnetiskperler kreves. De isolerte celler er egnet for et bredt spekter av funksjonelle og molekylære studier, som inkluderer in vitro kultur og T-celle stimulering analyser samt transkriptom, proteom eller secretome analyser 3, 4.

Protocol

Detaljer vedrørende nødvendige reagenser og materialer, er oppført i tabellen på slutten av protokollen nedenfor. Før arbeidet forberede 15 ml rør (en per mus) inneholdende 4 ml dispase og forvarme dem til 37 ° C i et vannbad. I en varmeblokk, kort tid varme små aliquoter av 1% lavt-smelte agarose (i vann) til 95 ° C inntil flytende og senere avkjøles til 45 ° C inntil bruk.

1. Klargjøring av Mouse Lung

  1. Ofre musen ved CO 2 kvelning. Merk: Ikke utfør cervical dislokasjon som dette vil skade luftrøret slik at de følgende trinnene i protokollen, slik som installasjon av lungene med væske, kan ikke utføres med hell. Sikre tap av nociceptive reflekser.
  2. Spray musen med etanol og foreta en lang skjæret langs ventrale midtlinje av kroppen. Trekk ventrale pels og hud og senere også nøye kutte og fjerne peritoneum.
  3. Exsanguinate denmus ved å kutte venstre og høyre vena jugularis (Vena jugularis) samt nyrearteriestenose (Arteria renalis). Fjern flyter blod med vev.
  4. Nøye punktering og deretter fjerne membranen for å avdekke hjerte og lunge ved å kutte bort ribbeina. Ta ekstra hensyn ikke å skade lungene.
  5. Med en 26G kanyle og en 10 ml sprøyte fylt med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS), punktere høyre ventrikkel av hjertet og perfuse lungen med PBS inntil fritt for blod.
  6. Kutte og fjerne spyttkjertler å avsløre luftrøret. Også nøye kuttet muskelen rundt luftrøret.
  7. Sett inn en 22G iboende kanyle inn i luftrøret, trekk ut nålen og skyv plastkateter mot lungene. Fest kateteret ved å binde et lite stykke garn rundt luftrøret og kateter.

2. Enzymatisk nedbrytning av lungevevet

Om ønsket, kan en bronchoalveolar lavage fluidprøve værefremstilt ved spyling lungene gjennom kateteret inn i luftrøret med PBS eller medium før det neste trinnet.

  1. Ved hjelp av en 2 ml sprøyte, nøye innpode en maksimal volum av 2 ml dispase (fra 4 ml alikvot) inn i lungene gjennom kateteret slik at alle lobes er fullt utvidet. Utveksle sprøyten med en 1 ml sprøyte inneholdende 0,5 ml av den flytende agarose og også bibringe lungen.
  2. La sprøyten på kateteret for å forhindre tilbake-strømning av agarosen og umiddelbart dekke lunge med laboratoriet silkepapir og is. La agarosegel for et par minutter.
  3. Ta ut silkepapir, is, sprøyte og kateter, kutte luftrøret og avgiftsdirektoratet lungene, hjertet og thymus fra brystet. Skyll lunge i en tallerken med PBS og fjern hjertet, thymus og gjenværende luftrøret.
  4. Sett lungene inn de resterende 2 ml dispase og inkuber ved romtemperatur i 45 min.

3. Klargjøring av LungCellesuspensjon

  1. Fjern lunge fra dispase og overføre den til en skål med 7 ml anti-CD16/32 antistoff (1 ug / ml endelig konsentrasjon) i DMEM medium og 100 ul DNase.
  2. Bruke tang, helt nedbryte lungevevet ved å trekke den fra hverandre og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur mens forsiktig rock på en rocker satt til 200 rpm. Om ønskelig kan cellesuspensjonen deretter lagres ved 4 ° C inntil neste trinn.
  3. Filtrer cellesuspensjonen gjennom nylon masker første med 100 mikrometer og deretter med 70 mikrometer, 48 mikrometer og 30 um porer. Ta vare å skylle hver maske samt rørene og retter grundig med DMEM å minimere tap av celler og maksimere utbytte. Hvis du pooling prøvene, kan dette oppnås her ved senere passerer celler suspensjoner fra mus av en gruppe gjennom samme filter. Forny filteret i tilfelle tilstopping.
  4. Avhengig volumet, overføre filtratet til en eller flere 50 ml rør ogsentrifuger i 15 minutter ved 160 xg og 4 ° C. Supernatanten fjernes.
  5. Resuspender cellepelleten i 2 ml erytrocytt lyseringsbuffer (0,15 M NH4Cl, 0,01 M KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) og raskt terminere lysering ved tilsetning av 13 ml av DMEM medium. Overfør løsningen til et 15 ml rør og sentrifuger i 12 minutter ved 160 xg og 4 ° C.

4. Antistoffarging for flowcytometrisk Cell-sortering

  1. Resuspender cellene i 3 ml primære antistoff cocktail, fremstilt i DMEM medium ved fortynninger egnet for strømningscytometri. (Antistoffer ble tidligere titreres for optimale arbeidsforhold fortynninger ved farging 1 x 10 6 splenocyttene i et volum på 100 ul. Bruk 3 ml av den primære antistoff cocktail som inneholder den optimale konsentrasjoner for hver av de brukte antistoffer for celler samlet fra opptil fem mus. Hvis flere mus er samlet til én prøve, justere volumet).
  2. Til farging, inkubere cellene i 10 min i mørketved 4 ° C.
  3. Vask cellene ved å fylle 15 ml rør med DMEM medium og sentrifugering i 12 min ved 160 xg og 4 ° C.
  4. I tilfelle ukoplet eller biotinylert antistoffer ble brukt i 4,1: Fjern supernatanten og resuspender cellene i 2-3 ml sekundært antistoff cocktail. Stain i 10 min ved 4 ° C i mørket.
  5. Vask cellene gjennom fylle røret med DMEM og sentrifugering i 12 min ved 160 xg og 4 ° C.
  6. Resuspender cellene i 1 ml DMEM og pre-filteret gjennom en 50 um filter i et rør for celle-sortering. Valgfritt: Tell cellene for å oppnå det totale cellenummer i lungen cellesuspensjonen.

5. Cell-sortering

  1. Bland cellene ved å virvle før sortering. Bruk en 100 mikrometer dyse for celle-sortering av AECII. Slire fluidtrykk samt laser utslipp og deteksjon bølgelengder avhengig instrumentet brukes for flowcytometrisk celle-sortering samt fluorokromer brukes i Antibody farging prosedyre.
  2. Gate på SSC høye celler som er negative for fluorokromer benyttes til farging og sortere i et rør inneholdende DMEM. Bruk forover spre høyde (FSC-H) vs området (FSC-A) og sideveis scatter høyde (SSC-H) vs området (SSC-A) vinduer for å utelukke eventuelle dubletter eller celleaggregatene (se detaljer om gating strategi i Figur 1 a).
  3. For å samle den sorterte celler sentrifuger i 20 minutter ved 280 xg og 4 ° C.
  4. Resuspender cellene i kultur-medium eller buffer som kreves for etterfølgende analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved sortering lunge cellesuspensjoner isolert fra friske mus, vil AECII gate typisk utgjøre ca 42 ± 10% av alle hendelser. Denne prosentandelen kan være merkbart lavere når mus med respiratoriske tilstander som en virusinfeksjon er anvendt, den innledende cellesuspensjon vil inneholde en betydelig høyere andel av lymfocytter og andre immune celler som rekrutteres til luftveiene. For AECII isolert fra IAV infiserte lunger på dag 3 etter infeksjon har vi observert en reduksjon av frekvensen av celler i AECII gate med rundt 50%.

En typisk sorter samt re-analyse av de sorterte celler er avbildet i figurene 1 b og 1 c. Som indikert, står renheten av de isolerte celler omtrent 92 ± 5%. I figur 2a, viser vi at vellykket separasjon av rene cellepopulasjoner kan bekreftes ved farging for overflateaktivt-proteiner C, som uttrykkes utelukkende av16 AECII, 17.

Vi har observert at antall AECII isolert per enkelt dyr sterkt avhenger musen stamme. Mens BALB / c mus gir vanligvis 1 x 10 6 AECII / mus, C57BL / 6 belastning bare en avkastning - 3 x 10 5 AECII / mus. Antallet av mus som brukes per eksperiment avhenger derfor på musen belastningen samt type etterfølgende analyser som skal utføres.

Angående levedyktighet av den hentede AECII, vi vanligvis finner levedyktighet på rundt 90% etter flowcytometrisk celle-sortering. Denne høye andelen av levedyktige celler kan deretter direkte funksjonelle analyser samt kortsiktig kultur av isolert primær murine AECII.

Figur 1
Figur 1. Oversikt over gating strategien brukes for flowcytometrisk isolering av primær murine AECII av negativ seleksjon. (A) Skjematisk oversikt over gating strategi. (B) Representative plott av en lunge cellesuspensjon slag. (C) Representative resultat av en re-analyse av de sorterte celler. Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Karakterisering og molekylær analyse av sortert primær murin AECII. (A) Cytospins av sortert AECII var farget for overflateaktive protein C (SPC). Sammenlignet med fasekontrast mikroskopi, ble nesten 100% av cellene funnet å være SPC positiv. (B) representant RNA profilen sortert primære murine AECII etter RNA-isolering. Spesifikke toppene for 18S og 28S ribosomale RNA sammen med den beregnede RIN faktoren representerer RNA jeg ntegrity og kvalitet for intakte isolerte RNA fra AECII.

Figur 3
Figur 3. Analyse av influensa A-viruset nucleoprotein (NP) ekspresjon i primære murin AECII isolert fra infiserte mus. C57BL / 6 mus ble intranasalt administrert fosfatbuffret saltvann eller influensa A virus PR8/A/34 på dagene 1, 2 eller 3 før AECII isolasjon . (A) Representative plott av lunge cellesuspensjoner fra en infisert samt en tre-dagers infiserte C57BL / 6 mus farget for sortering. (B) Influensa A virus NP uttrykk i sortert AECII ble analysert gjennom intracellulær farging med en NP-spesifikt antistoff og påfølgende flow-cytometrisk analyse. (C) Tabellen viser midlere fluorescensintensitet (MFI) av NP farging.

s "> Figur 4
Figur 4. Analyse av influensa A virus nucleoprotein (NP) uttrykk i ex vivo infisert primær murine AECII. (A) Representant flow-cytometrisk analyse av ex vivo influensa A virus PR8/A/34 smittet AECII ved intracellulær farging for influensa A virus NP 6 hr legge infeksjon. (B) Oppsummering av representative resultater fra NP-farging av ex vivo influensa A virus infisert AECII 6 timer etter infeksjon med ulike virus fortynninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vår protokoll for isolering av muse AECII ved strømningscytometri tilbyr en rask måte å få tilgang primærceller fra musen lungene for en hel rekke av funksjonelle og molekylære studier. Den beskrevne prosedyren gir svært levedyktige og rene populasjoner av AECII som er tilstrekkelig i antall for direkte påfølgende analyser, for eksempel RNA isolert (se figur 2b) og transkriptom studier. For funksjonelle anvendelser er det også mulig å dyrke de isolerte celler, slik f.eks generasjon AECII kondisjonerte medium eller co-kultur eksperimenter. Som en fordel spesielt for disse funksjonelle studiene gir isolasjon av primære celler ved negativ seleksjon som beskrevet her uberørte celler som ikke har vært gjenstand for antistoffbinding. Imidlertid, til tross for fordelene med studier i primær AECII over dem utført i celle-linjer, er det praktiske begrensninger til bruken av disse primære celler. Ved siden av den rene begrensning i antall, Som kanskje ikke oppfyller kravene i studiene krever omfattende screening, primær AECII overleve i kultur bare for en begrenset tid som vi har observert i gjennomsnitt rundt 48 hr. I disse kortsiktige kultur eksperimenter, har vi basert valg av dyrkingsmediet på arten av de etterfølgende analyser det AECII kondisjonerte medium ble brukt i og har oppnådd tilfredsstillende resultater med IMDM (IMDM Glutamax, Gibco Kat. No 31980) supplert med 10% FCS, antibiotika og standard 0,25 mm β-merkaptoetanol.

Protokollen er beskrevet her viser en relativt enkel og rask måte å isolere levedyktig og ren primære murine AECII i gode tall. Renheten av de gitt celler etter separasjon avhenger kritisk på prosedyren av celle-sortering. En klar og sterk farging av cellepopulasjoner som skal ekskluderes er like viktig som strenge gating på SSC høye hendelser, slik at forurensninger med lymfoide celler i tillegg skriverJeg epitelceller er minimert. Angående utbyttet av separerte celler, har vi observert at dette er maksimert ved omfattende spyling av rør, filtrere maskene og plater under fremstillingen av det rå cellesuspensjonen samt ved fullstendig oppløsning av vevet etter enzymatisk fordøyelse. Ett viktigste fordelen med å jobbe med primær AECII er at de kan bli isolert direkte fra vertene som lider av sykdommer i luftveiene. Slike AECII vil ha blitt utsatt for alle faktorer som er tilstede i deres naturlige mikro-miljø og derfor godt reflekterer in vivo situasjonen. Motsetning for menneskelig 18 AECII, 19, kan dette utvides til et bredt spekter av eksperimentelle systemer ved arbeid i murine modeller. Vi har blitt tatt nytte av dette i studier om autoimmune betennelse samt viral infeksjon i lungene. Dermed har vi funnet at AECII fra mus som lider fra CD4 + T-celle mediert respiratorisk betennelse uttrykke en rekke inflammatOry gener som demonstrerer sitt potensial for å regulere lunge immunreaksjoner 3. Videre kan vi vise at AECII skjerm selv-antigener gjennom store histocompatibility komplekse klasse II-molekyler som resulterer i den funksjonelle aktivering av auto reaktive CD4 + T celler. Samtidig AECII opprettholde lunge toleranse ved å utskille faktorer som fremmer induksjon av Foxp3 + regulatoriske T-celler 4.

Angående viral infeksjon i lungene, har vi lyktes i å isolere primære AECII fra mus infisert med influensa A virus. Som nevnt ovenfor, her AECII utgjør en mindre andel av det hele lunge cellesuspensjonen, som betydelig antall immunceller rekrutteres til lungene i respons til infeksjon (se figur 3a). Intracellulær farging av influensa A-viruset nucleoprotein (NP) innenfor de isolerte cellene viser økende ekspresjon av det virale protein i løpet av tiden som vist i g> tall 3b og 3c. Disse AECII, utløst av virus in vivo, viser et verdifullt verktøy for studier om molekylære og funksjonelle fenotype av luftveiene epitel under luftveiene viral infeksjon så vel som under utvinning. Imidlertid som AECII er det primære målet for influensa A virus, og det er betydelig ødeleggelse av epiteliale slimhinnen, frekvensen av celler ga fra infiserte mus avtar løpet og med alvorlighetsgraden av infeksjonen. Også, som viruset gjentatte replikater og infiserer nye celler, har den isolerte AECII ikke vært gjenstand for infeksjon på et enkelt definert tidspunkt. Dermed er disse studiene ideell supplert med eksperimenter med ex vivo infisert primær murin AECII fra friske mus hvor infeksjonen er bedre synkroniserte og som, som vurdert av intracellulær viral NP farging vist i figurene 4a og 4b, kan gi høyere forekomst av infeksjon avhengig viral dose brukes.

jove_content "> Til sammen beskrev flowcytometrisk negativ seleksjon som her viser en rask måte å isolere ren og levedyktig primære murine AECII. Disse cellene er egnet for et bredt spekter av analyser og er et verdifullt verktøy for å utvide vår kunnskap om den rollen AECII i immunsystemet regulering i luftveiene in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke M. Höxter for teknisk assistanse i sortering primære murine AECII fra biosikkerhetsnivå 2 prøver.

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den tyske Research Foundation (DFG) til DB (SFB587, TP B12 og BR2221/1-1) og et stipend fra Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) til AA. DB er støttet av presidentens initiativ og nettverk fond i Helmholtz Association of German Forskning Centers (HGF) under kontrakt nummer W2/W3-029.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
indwelling cannula Introcan 22G Braun REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) BD Biosciences 354235 aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C
Biozym Plaque Agarose Biozym 840101 1% w/v in H2O
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial Sigma-Aldrich D4263 freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM
DMEM Gibco 22320-022 used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES)
cell strainers (100 μm, 75 μm) BD Falcon 352360, 352350
nylon mesh(48 μm, 30 μm) Bückmann GmbH 03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm filter PARTEC 04-0042-2317
anti-mouse CD16/CD32 BioLegend 101302 clone 93; purified
anti-mouse F4/80 BioLegend 123116 clone BM8; APC coupled
anti-mouse CD11b BioLegend 101208 clone M1/70; PE coupled
anti-mouse CD11c BioLegend 117310 clone N418; APC coupled
anti-mouse CD45 BioLegend 103102 clone 30-F11; purified
anti-mouse CD19 eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3; PE coupled
polyclonal goat anti-rat IgG BD Pharmingen 550767 polyclonal, PE coupled

Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
  2. Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
  3. Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
  4. Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
  5. Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
  6. Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
  7. Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
  8. Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
  9. Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
  10. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
  11. Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
  12. Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
  13. Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
  14. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
  15. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
  16. Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
  17. Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
  18. Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
  19. Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).

Tags

Immunologi cellebiologi molekylær biologi Infeksjon smittsomme sykdommer mikrobiologi alveolar type II epitelceller mus luftveier lunger celle sortering flowcytometri influensa autoimmunitet
Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gereke, M., Autengruber, A.,… More

Gereke, M., Autengruber, A., Gröbe, L., Jeron, A., Bruder, D., Stegemann-Koniszewski, S. Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies. J. Vis. Exp. (70), e4322, doi:10.3791/4322 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter