Summary
Vi beskriver snabb isolering av primära murina typ II alveolära epitelceller (AECII) genom flödescytometrisk negativ selektion. Dessa AECII visar hög lönsamhet och renhet och är lämpliga för ett brett spektrum av funktionella och molekylära studier om deras roll i respiratoriska sjukdomar såsom autoimmuna eller infektiösa sjukdomar.
Abstract
Under de senaste åren har bidrag alveolära typ II epitelceller (AECII) till olika aspekter av immunreglering i lungan alltmer klart. AECII har visats delta i cytokinproduktion i inflammerade luftvägarna och att även fungera som antigenpresenterande celler i både infektion och T-cellsmedierad autoimmunitet 1-8. Därför är de särskilt intressanta även i kliniska sammanhang, såsom luftvägarna hyperreaktivitet utrikes-och själv-antigener samt infektioner som direkt eller indirekt riktar AECII. Förblir dock vår förståelse av de detaljerade immunologiska funktioner betjänas av alveolära typ II epitelceller i friska lungan samt vid inflammation fragmentariskt. Många studier om AECII funktion utförs med mus eller människa alveolära epitelceller cellinjer 9-12. Arbeta med cellinjer verkligen erbjuder en rad fördelar, till exempel tillgången till ett stort antal of celler för omfattande analyser. Vi tror dock att använda primära murina AECII möjliggör en bättre förståelse för den roll som denna celltyp i komplexa processer som infektion eller autoimmun inflammation. Primär murina AECII kan isoleras direkt från djur som lider av sådana luftvägsbesvär, vilket innebär att de har varit föremål för alla ytterligare yttre faktorer spelar en roll i det analyserade inställningen. Som ett exempel, kan livskraftigt AECII isoleras från möss intranasalt infekterade med influensa A-virus, som riktar sig främst till dessa celler för replikering 13. Viktigare, genom ex vivo-infektion av AECII isolerats från friska möss, kan studier av cellulära svar monterade på infektion förlängas ytterligare.
Vår protokoll för isolering av primära murina AECII baseras på enzymatisk digerering av muslunga, följt av märkning av den resulterande cellsuspensionen med antikroppar specifika för CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 och CD16/CD32. Granulära AECII identifieras därefter som den omärkta och sidled spridning hög (SSC hög) cellpopulationen och är åtskilda av fluorescensaktiverad cellsortering 3.
I jämförelse med alternativa metoder för att isolera primära epitelceller från mus lungorna, ger vår protokoll för flödescytometrisk isolering av AECII genom negativ selektion orörd, mycket livskraftig och ren AECII på relativt kort tid. Dessutom, och i motsats till konventionella metoder för isolering genom panorering och utarmning av lymfocyter genom bindning av antikropp-kopplade magnetiska pärlor 14, 15, medger flödescytometrisk cell-sortering diskriminering genom cellstorlek och granularitet. Med tanke på att instrumentering för flödescytometrisk cellsortering är tillgänglig, kan det beskrivna förfarandet tillämpas på relativt låga kostnader. Bredvid standard antikroppar och enzymer för lung sönderfall, inga ytterligare reagens såsom magnetiskpärlor erfordras. De isolerade cellerna är lämpliga för ett brett spektrum av funktionella och molekylära studier, som omfattar odling in vitro och T-cell-analyser stimulering samt transkriptom, proteom eller secretome analyser 3, 4.
Protocol
Detaljer om erforderliga reagens och material visas i tabellen i slutet av protokollet nedan. Innan arbetet påbörjas, förbereda 15 ml rör (ett per mus) innehållande 4 ml dispas och pre-varmt dem till 37 ° C i ett vattenbad. I ett värmeblock, värma kort små alikvoter av 1% låg-smälta agaros (i vatten) till 95 ° C tills flytande och därefter svalna till 45 ° C fram till användning.
1. Beredning av muslunga
- Offra musen genom CO 2 kvävning. Obs: Utför inte halsdislokation eftersom detta kommer att skada luftstrupen så att följande steg i protokollet, såsom installation av lungan med vätska, kan inte utföras med framgång. Säkerställa förlust av nociceptiva reflexer.
- Spraya musen med etanol och göra en lång snitt längs den ventrala mittlinjen av kroppen. Dra ventrala päls och hud och därefter också noggrant skära och ta bort bukhinnan.
- Exsanguinate denmus genom att skära den vänstra och högra halsvenen (vena jugularis) såväl som njurartären (Arteria renalis). Avlägsna strömmande blod med vävnad.
- Försiktigt punktering och sedan ta bort membranet att exponera hjärtat och lungorna genom att skära bort revbenen. Var särskilt försiktig att inte skada lungan.
- Med en 26G kanyl och en 10 ml spruta fylld med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS), punktera den högra ventrikeln av hjärtat och perfundera lungan med PBS tills fritt från blod.
- Klipp och ta spottkörtlarna att exponera luftstrupen. Också noggrant skära muskeln som omger luftstrupen.
- Sätt in en 22G kvarliggande kanyl i luftstrupen, ta ut nålen och tryck plastkatetern mot lungan. Fäst katetern genom att knyta en liten bit garn runt luftstrupen och kateter.
2. Enzymatisk nedbrytning av lungvävnad
Om så önskas, kan en bronkoalveolär sköljvätska prov varaframställd genom spolning lungorna genom katetern införd i trakea med PBS eller medium innan nästa steg.
- Med användning av en 2 ml spruta, försiktigt ingjuta en maximal volym av 2 ml dispas (från 4 ml alikvot) in i lungan genom katetem så att alla lober fullt expanderade. Utbyta spruta med en 1 ml spruta innehållande 0,5 ml av den flytande agaros och även ingjuta in i lungan.
- Låt sprutan på katetern för att förhindra återflöde av agarosen och omedelbart täcker lungan med laboratoriet mjukpapper och is. Låt agarosgel för ett par minuter.
- Ta tissuepapperet, is, sprutan och katetern, skär luftstrupen och excidera lunga, hjärta och tymus från bröstet. Skölj lungan i en skål med PBS och ta bort hjärtat, tymus och återstående luftstrupen.
- Sätt lungan i de återstående 2 ml dispas och inkuberas vid rumstemperatur under 45 minuter.
3. Framställning av LungCellsuspension
- Avlägsna lungan från dispas och överföra det i en skål innehållande 7 ml anti-CD16/32 antikropp (1 pg / ml slutlig koncentration) i DMEM-medium och 100 | il DNas.
- Använd pincett, helt upplösas lungvävnaden genom att dra isär och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur under försiktig gungande på en vippa satt till 200 rpm. Om så önskas, kan cellsuspensionen sedan lagras vid 4 ° C tills nästa steg.
- Filtrera cellsuspensionen genom nylon maskor först med 100 nm och därefter med 70 nm, 48 nm och 30 nm porer. Var noga med att skölja varje maska samt rören och rätter noggrant med DMEM för att minimera förlust av celler och maximera avkastningen. Om du samla prover kan detta uppnås här genom senare passerar celler suspensioner från möss i en grupp genom samma filter. Förnya filtret i händelse av igensättning.
- Beroende på volymen, överföra filtratet till en eller flera 50 ml rör ochcentrifugera 15 min vid 160 x g och 4 ° C. Avlägsna supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 2 ml erytrocyt lysbuffert (0,15 M NH 4 Cl, 0,01 M KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) och snabbt avsluta lys genom tillsats av 13 ml DMEM-medium. Överför lösningen till en 15 ml rör och centrifugera under 12 min vid 160 x g och 4 ° C.
4. Antikroppsfärgning för flödescytometrisk cell-sortering
- Återsuspendera cellerna i 3 ml primär antikropp cocktail, framställd i DMEM-medium vid spädningar lämpliga för flödescytometri. (Antikroppar tidigare titrerades för optimala arbetsvillkor utspädningar genom färgning 1 x 10 6 splenocyter i en volym av 100 pl. 3 ml av den primära antikroppen cocktail innehållande de optimala koncentrationerna för vart och ett av de använda antikropparna för celler poolade från upp till fem möss Använd. Om fler möss samlas till ett prov, justera volymen).
- För färgning inkuberas cellerna under 10 minuter i mörkervid 4 ° C.
- Tvätta cellerna genom att fylla 15 ml tub med DMEM-medium och centrifugering under 12 min vid 160 x g och 4 ° C.
- I fall okopplade eller biotinylerade antikroppar användes i 4,1: Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 till 3 ml sekundär antikropp cocktail. Stain i 10 min vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna genom att fylla röret med DMEM och centrifugering under 12 min vid 160 x g och 4 ° C.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml DMEM och förfilter genom ett 50 um filter i ett rör för cell-sortering. Valfritt: Räkna cellerna för att erhålla den totala cellantalet i lungan cellsuspensionen.
5. Cell-sortering
- Blanda cellerna genom skakning före sortering. Använd en 100 nm munstycke för cell-sortering av AECII. Mantel vätsketrycket liksom laseremissionen och våglängder upptäckt beror på instrumentet som används för flödescytometrisk cell-sortering samt fluorokromer används i AntibODY färgningsproceduren.
- Gate på SSC höga celler som är negativa för de fluorokromer som används för färgning och sortera in i ett rör innehållande DMEM. Använd framåtspridning höjd (FSC-H) vs område (FSC-A) och i sidled scatter höjd (SSC-H) vs område (SSC-A) fönster för att utesluta eventuella dubbletter eller cellaggregat (se detaljer om gating strategin Figur 1 a).
- För att samla in de sorterade cellerna centrifugera 20 min vid 280 x g och 4 ° C.
- Återsuspendera cellerna i odlingsmedium eller buffert som krävs för efterföljande analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid sortering suspensioner lung cell som isolerats från friska möss kommer AECII porten står vanligtvis för cirka 42 ± 10% av alla händelser. Denna procentsats kan vara märkbart lägre när möss med respiratoriska sjukdomar såsom en virusinfektion används, eftersom den initiala cellsuspensionen innehåller en betydligt större andel av lymfocyter och andra immunceller som rekryteras till luftvägarna. För AECII isolerad från iav infekterade lungor på dag 3 efter infektion har vi observerat en minskning av frekvensen av celler i AECII porten med ca 50%.
En typisk typ liksom re-analys av de sorterade cellerna är avbildad i figurerna 1 b och 1 c.. Som angivits svarar renheten hos de isolerade cellerna ungefär 92 ± 5%. I figur 2a, visar vi att framgångsrik separation av rena cellpopulationer kan bekräftas genom färgning för ytaktiva-proteiner C, som uttrycks enbart genomAECII 16, 17.
Vi har observerat att antalet AECII isolerat per enskilt djur starkt beroende på vilken musstam. Medan BALB / c-möss ger typiskt 1 x 10 6 AECII / mus, den C57BL / 6 stammen endast ger 1 till 3 x 10 5 AECII / mus. Antalet möss som användes per experiment beror därför på musstammen liksom typen av efterföljande analyser som skall utföras.
När det gäller överlevnad hämtade AECII finner vi vanligtvis lönsamheten på ca 90% efter flödescytometrisk cell-sortering. Denna höga andel livsdugliga celler gör sedan direkt funktionella analyser samt kortfristiga kultur isolerade primära murina AECII.
Figur 1. Översikt Over gating strategi som används för flödescytometrisk isolering av primär murin AECII genom negativ selektion. (A) Schematisk översikt över gating strategin. (B) Representativa kurvor för en lunga cellsuspension sortera. (C) Representant resultatet av en ny analys av de sorterade cellerna. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Karakterisering och molekylär analys av utsorterat primär mus AECII. (A) cytospins av sorterade AECII färgades för tensiden protein C (SPC). Jämfört med faskontrastmikroskopi, var nästan 100% av cellerna befanns vara positiv SPC. (B) representant RNA profil sorterade primär mus AECII efter RNA-isolering. Specifika toppar för 18S och 28S ribosomala RNA tillsammans med den beräknade RIN faktorn representerar RNA i ntegrity och kvalitet för intakta isolerade RNA från AECII.
Figur 3. Analys av influensa A-virus nukleoprotein (NP) uttryck i primär mus AECII isolerad från infekterade möss. C57BL / 6 möss intranasalt administrerat fosfatbuffrad saltlösning eller influensa A-virus PR8/A/34 på dag 1, 2 eller 3 innan AECII isolering . (A) Representativa kurvor av suspensioner lung cell från en icke-infekterade samt en tredagars infekterade C57BL / 6 mus färgas för sortering. (B) Influensa A-virus NP uttryck i sorterade AECII analyserades genom intracellulär färgning med ett NP-specifik antikropp och efterföljande flödes-cytometrisk analys. (C) Tabellen visar den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) av NP färgning.
Figur 4. Analys av influensa A-virus nukleoprotein (NP) uttryck i ex vivo infekterade primära murina AECII. (A) representant flödes-cytometrisk analys av ex vivo influensa A-virus PR8/A/34 infekterade AECII genom intracellulär färgning för influensa A-virus NP 6 timmar efter infektion. (B) Sammanfattning av representativa resultat från NP-färgning av ex vivo influensa A-virus infekterade AECII 6 timmar efter infektion med olika virus utspädningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår protokoll för isolering av murina AECII genom flödescytometri erbjuder ett snabbt sätt att komma åt primära celler från mus lunga för en hel rad av funktionella och molekylära studier. Den beskrivna proceduren ger mycket livskraftiga och rena populationer av AECII som är tillräckliga i antal för direkt efterföljande analyser, såsom RNA isolering (se figur 2b) och transkriptom studier. För funktionella applikationer, är det också möjligt att odla de isolerade cellerna, vilket t.ex. generering av AECII konditionerat medium eller samodling experiment. Som en förmån särskilt för dessa funktionella studier ger isolering av primära celler genom negativ selektion som beskrivs här orörda celler som inte har varit föremål för antikroppsbindning. Trots fördelarna med studier i primär AECII över de som utförs i cellinjer, finns det praktiska begränsningar för användning av dessa primära celler. Bredvid enbart begränsningen i siffror, Som kanske inte uppfyller kraven i studierna kräver omfattande screening, primär AECII överleva i kultur endast under en begränsad tid som vi har observerat i genomsnitt omkring 48 timmar. I dessa korta kultur experiment, har vi baserat valet av odlingsmediet på naturen av de efterföljande analyserna i AECII konditionerade mediet som används i och har uppnått tillfredsställande resultat med IMDM (IMDM Glutamax, Gibco Cat. Nr 31.980) kompletterat med 10% FCS, antibiotika standard och 0,25 mM β-merkaptoetanol.
Protokollet som beskrivs här visar en relativt lätt och snabbt sätt att isolera livskraftig och ren primär mus AECII i goda siffror. Renheten hos de gav cellerna efter separationen beror kritiskt om förfarandet för cell-sortering. En tydlig och stark färgning av cellpopulationer som skall undantas är lika viktigt som stränga gating på SSC höga händelser, så att föroreningar med lymfoidceller samt typJag epitelceller minimeras. Beträffande utbytet av separerade celler, har vi observerat att detta maximeras genom omfattande spolning av rör, filter maskor och plattor under framställning av den råa cellsuspensionen samt genom fullständig sönderdelning av vävnad efter enzymatisk spjälkning. En huvudsaklig fördel med att arbeta med primär AECII är att de kan isoleras direkt från värdar som lider av sjukdomar i andningsvägarna. Sådan AECII att ha utsatts för alla faktorer som finns i deras naturliga mikro-miljö och därmed väl speglar in vivo situationen. Till skillnad från humant AECII 18, 19, kan detta utvidgas till ett brett spektrum av experimentella system när man arbetar i murina modeller. Vi har tagit nytta av detta i studier om autoimmun inflammation samt virusinfektion i lungan. Därigenom fann vi att AECII från möss som lider av CD4 +-T-cell medierad luftvägsinflammation uttrycker ett brett spektrum av inflammatORY gener som visar deras möjligheter att reglera lung immunsvar 3. Vidare kunde vi visa att AECII visning själv-antigener genom MHC klass-II-molekyler, vilket resulterar i den funktionella aktiveringen av auto reaktiva CD4 + T-celler. Samtidigt upprätthåller AECII lunga tolerans genom att utsöndra faktorer som främjar induktionen av Foxp3 + regulatoriska T-celler 4.
Beträffande virusinfektion i lungan, har vi isolerat framgångsrikt primär AECII från möss infekterade med influensa A-virus. Såsom nämnts ovan, här AECII svarar för en mindre del av hela lungan cellsuspensionen, som betydande antal immunceller rekryteras till lungorna som svar på infektion (se figur 3a). Intracellulär färgning av influensa A-virus nukleoprotein (NP) i de isolerade cellerna visar öka uttrycket av det virala proteinet under loppet av tiden, såsom visas i
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka M. Höxter för tekniskt stöd i sortering primär mus AECII från skyddsnivå 2 prover.
Detta arbete har finansierats med bidrag från den tyska Research Foundation (DFG) till DB (SFB587, TP B12 och BR2221/1-1) och ett stipendium från Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) till AA. DB stöds av presidentens initiativ och nätverk fonden Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) enligt avtal nummer W2/W3-029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
|||
References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
