Summary
最近开发的成像技术，利用近红外荧光（NIRF）可能有助于阐明淋巴系统在肿瘤转移中发挥的作用，免疫反应，创面修复，以及其他相关的淋巴管疾病。
Abstract
淋巴血管系统的循环系统，保持体液平衡，提供了免疫监视，并介导对脂肪的吸收，在肠道中的重要组成部分。然而，尽管其关键的功能，有相对较少的了解淋巴系统如何适应为这些功能在健康和疾病的1。最近，我们表现出的能力，动态图像淋巴管架构和淋巴结在正常的人类受试者以及患有淋巴功能障碍的近红外荧光（NIRF）染料的使用跟踪管理和自定义的“抽水”行动，第三代强化成像系统2-4。 NIRF成像显示出了巨大的变化，在淋巴管的结构和功能与人类疾病。目前还不清楚这些变化是如何发生的和正在开发的新的动物模型，阐明它们的遗传和分子基础。在这个协议中，我们提出了NIRF淋巴管，S使用吲哚菁绿（ICG），已被用于在人类750年的染料，和一个NIRF染料标记的环状白蛋白结合结构域（CABD-IRDye800）肽，优先结合鼠标和人白蛋白8商场动物成像5,6 。约5.5倍的亮度比ICG，CABD IRDye800有一个类似的淋巴间隙轮廓比，ICG以实现足够的的NIRF信号为成像8，可以在较小的剂量注入。由于组织间隙8白蛋白的的CABD-IRDye800和ICG绑定，它们都可以描绘出活性蛋白运输和淋巴管内。皮内（ID）注射液（5-50微升）的ICG（645μM）或CABD-IRDye800（200μM），在盐水给药每个后爪和/或左，右侧的基极的背侧尾的异氟醚麻醉的小鼠。在动物所得的染料浓度是83-1,250微克/千克的ICG或113-1,700微克/千克CABD，IRDye800。紧随注射剂，功能性淋巴成像长达1小时，使用一个定制的，小动物NIRF成像系统进行。可以描绘整个动物的空间分辨率为100微米或更小的荧光淋巴管，和图像的结构至3厘米的深度可以获取9。图像采集采用V + +软件，并使用ImageJ或MATLAB软件进行分析。在分析过程中，连续绘制地区的利益（投资回报率），覆盖整个容器直径沿淋巴管。每个ROI测量定量评估通过血管淋巴移动的“数据包”，对于一个给定的容器和NIRF强度，每个ROI的尺寸保持不变。
Protocol
所有动物的研究进行了大学，得克萨斯大学健康科学中心（休斯顿，德克萨斯州），比较医学系，分子成像后，审查和批准该协议由各自的机构动物保健中心的标准和使用委员会（IACUC）或动物福利委员会（AWC）。
1。制备动物24小时之前，成像
必须完成下面的步骤中（如需要）的前一天，淋巴造影发生。
- 将动物的感应箱与异氟醚和稳重。
- 一旦动物是状态的深刻麻醉（用脚趾夹机动监测），在尿片/的绒毛垫和位置鼻的鼻锥连接到异氟醚气体的地方镇静动物。
- 所有头发夹/皮草（如有）周围的区域进行成像。
- 脱毛剂（NAIR）应用的裁剪区域，并把它Øn的皮肤3分钟。
- 与温暖，潮湿的纱布或纸巾轻轻擦去所有的脱毛剂。
- 皮肤用温水轻轻冲洗，并用纱布或纸巾轻轻地擦干地区。
- 让动物恢复加热垫或加热灯，并返回到他们的笼子。
2。一天的影像
- 复溶显像剂，然后用无菌水稀释使用无菌的，正常的（0.85％）生理盐水CABD-IRDye800 ICG或200μM（680μg/10微升）的达到645μM（5μg/10微升）， 保持在黑暗中的解决方案重建后的6小时内的条件和使用。
- 将动物的感应箱与异氟醚和稳重。
- 一旦动物是在深刻麻醉（用脚趾夹机动监测），在其一侧连接到气异氟醚在鼻锥上的尿片/的绒毛垫和位置的鼻子的地方镇静动物的状态。
- 关灯（所以房间暗）。如果需要的话，一张小桌子卤素光源，可用于光看注射少量的。
- 用31号针头用胰岛素注射器，注入ID为5微升50微升的ICG或CABD IRDye800在每个后爪和/或背侧基地的尾巴上的左侧和右侧，这取决于该地区的利益（见讨论）。每个注射剂量的范围可以从0.083到1.25毫克/公斤（ICG），或0.113至1.7毫克/公斤（CABD-IRDye800）。注射体积将随动物应变和注射部位。对于无胸腺小鼠中，注射的体积可以是5微升（后肢）或10μl（基尾）， 如果动物是没有的成像系统下的喷射（），将动物的成像系统下后立即注射（）。
- 如果没有染料的吸收是在淋巴管可见，需要重复步骤2.5将作为每只动物协议需要。
- 一旦被视为淋巴管，包括注射部位用黑色电工胶带或黑色PA元。
- 长达1小时使用获取淋巴图像V +软件和小动物，NIRF成像系统。 （动物镇静异氟醚和呼吸时监视图像获取）。虽然小动物，NIRF成像市售的，我们利用一个定制的，小动物NIRF成像系统组成的785纳米激光二极管（1005-9mm的78503的，强烈的，位于North Brunswick，NJ）配备（-B C24TME，Thorlabs公司，牛顿，新泽西州）的非球面透镜，扩散器（ED1-C20，Thorlabs公司），和过滤器（LD01-785/10-25的，Semrock，纽约州罗切斯特市），以产生均匀的照射动物的激励磁场的入射积分通量率小于1.4毫瓦每平方厘米10。电子倍增电荷耦合器件（EMCCD，PhotonMax512，普林斯顿仪器，特伦顿，NJ）系统有两个830纳米的的滤波器（AND11333，Andover的公司，在新罕布什尔州Salem）和28毫米的尼克尔镜头（1992年，尼康相机，纽约州Melville）是用来捕捉到淋巴的图像融合添ES 200毫秒的动态影像和800毫秒的静态影像5。请参阅图1系统配置，表中的每个组件的更多细节，并讨论了简短的讨论关键的成像性能。
- 让动物恢复加热垫或加热灯和返回到他们的笼子，或安乐死。
- 使用ImageJ或MATLAB软件分析图像。参见图6。
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Representative Results
NIRF在小鼠淋巴造影的例子
当ICG注入或CABD IRDye800 ID在基地正常小鼠的尾部，在尾巴根部之间的注射部位和腹股沟淋巴结（LN）的淋巴血管应立即可视化。注射后不久（几秒钟到几分钟），淋巴管之间的腹股沟LN和腋下淋巴结应可视化，如在图2中看出。由于小鼠的淋巴管的变化在动物，因为他们在人类，动物之间的体系结构的变化，如在图3中所示，可以看出。当ICG或NIRF-CABD注入正常小鼠的后爪上的背方面ID，两个淋巴管可以排水腘LN可视化的，如在图4中所示。在某些情况下，它是难以区分两艘船，因为它们靠近彼此。
有时，淋巴管的可视化被延迟，最常见的是由于所管理的皮下（SC）注射而不是ID。当SC注射，淋巴运输可能不会立即形象地看到在图5（a）因为需要额外的时间达到，并采取由毛细淋巴管在皮肤上的染料。这就是为什么它是重要的，而不是SC注入ID。有时，异常的淋巴管被观察到，如在图5（b）可见，在该地区的伤口，如咬了一口或剪下的头发/皮草快船队。动物的身体的温度应保持在正常范围内，改变体温可以导致不一致的淋巴功能。该技术的限制，包括荧光淋巴管遮拦的皮肤色素沉着，无法对图像的深胸淋巴管在组织中的光散射，和对淋巴功能未知的麻醉效果。
一般来说，它需要ICG或CABD IRDye800 2天的ID车厂以清除肝脏和膀胱，3天，以清除注射部位。当清除残留的荧光信号，成像协议，可重复，从而使纵向的淋巴造影，以评估干预后，一些建筑或淋巴功能的变化。
淋巴功能分析
ImageJ的或MATLAB数据分析采集到的图像可以被加载到。恒定区，圆形的ROI被选择或“拉伸”沿荧光淋巴管的整个长度上，如在图6（a）和图6（d）所示，如10和动物为人类5淋巴成像完成。的ROI被这样选择，使得它们的直径大约是直径的荧光的图像NT容器。每个ROI内的平均荧光强度绘制沿淋巴管推进作为成像时间来评估染料载货淋巴结中的“数据包”的推进速度和频率的函数，如在图6（b）和图6所示（五）。要评估的淋巴传播速度和频率淋巴推进，2投资回报率，与明确界定的极大值或极小的荧光强度的变化代表淋巴液的报文的传播，被选择和它们的荧光强度的档案被绘制在图6（三）所示和图6（f）。的传播速度来计算的分组淋巴液服用的距离的比率，两者之间的投资回报率和渡越时间，它们之间的传播。通过评估的荧光脉冲的数目或“数据包”，在一个单一的单位时间内的投资回报率到达，计算收缩频率。虽然这种技术提供了唯一的方法ASSESS的推进频率和速度的推进淋巴管“包”，其他人间接进行评估淋巴运输车厂检查的显像剂测量，从而计算出去除速率常数11。 10和早期感染在肿瘤转移中，我们发现亏损动物的淋巴推进中。其他收缩反应性关节炎12。在人类中，我们的报告后增加推进淋巴水肿的治疗，包括充气加压排水13日和手动淋巴引流（按摩）14。
图1。NIRF成像系统是定制的小动物淋巴造影。该装置由一个785-nm的激光二极管的非球面透镜，DIFFUS配备呃，和过滤器，以产生均匀的照亮动物和EMCCD相机的激励磁场，聚焦透镜，和光学过滤器捕捉到的荧光淋巴结10的图像。
图2，当被注射10微升的ICG或CABD IRDye800在使用31号针头，在尾巴根部之间的注射部位和腹股沟淋巴结LN淋巴脉管系统的基础上的正常小鼠尾巴ID应该是马上可视化。动态的荧光图像获取后立即注入和高达20分钟以下注射液。注射后不久（几秒钟到几分钟），注射部位和腹股沟LN和随后到腋下淋巴结区域之间的淋巴管上显示的横向视图。在图2中所示的图像被带到5分钟。注射后无线网络第10微升ICG在基地的尾巴ID。腹股沟和腋下部位之间的亮点是肝脏。
如图3所示。由于小鼠的淋巴管从动物到动物不同，因为他们在人类，架构与动物之间的变化可能会看到，随着时间的推移和稳定。鼠标＃124注射ICG在该基地的尾巴，第1天立即成像。顶部面板包含第1天，以及所获得的图像2天后（第3天）使用相同的鼠标和注射液/成像协议所得到的图像。底部面板包含从另一个鼠标（＃127）注射ICG立即成像的第1天，随后在第3天拍摄获得的图像。虽然淋巴管结构（淋巴管模式）之间莫使用＃124，＃127，获得的图像使用NIRF是一致的为每个鼠标在第1和第3天。
图4。当正常小鼠的后肢背侧5〜10μL注入ICG或NIRF CABD ID，两个淋巴管进行可视化流入腘LN。动态的荧光图像获取后立即注入和高达20分钟以下注射液。在某些情况下，它是难以区分这两个由虚线框表示的放大图像中示出，因为它们靠近船只。对于这里所示的代表鼠标，10微升的ICG注入在背侧的左，后爪（第一注射部位）和尾部基础（第二喷射网站）的左侧。这张照片是CAptured约2 - 第一次注射后的3分钟，约30秒 - 1分钟后，第二次注射。
图5（A）偶尔可视化的淋巴管被延迟或受损，最常见的原因，而不是ID管理SC的注射。当注入10微升的ICG或CABD IRDye800 SC在正常小鼠的尾部用31号针头的基础上，淋巴运输不会立即可视化，因为染料所需的额外时间到达，并采取由在皮肤毛细淋巴管。此外，由于相对深的SC注射，有可能是没有淋巴摄取和因此没有可视化的血管和淋巴结。在图5（a），鼠标被注射用10微升ICG购入尾SC和图像的基础上在注射后5分钟。在注射部位的染料可以被可视化，并没有淋巴管或淋巴结可以可视化。这是ID注射是非常重要的原因。（二）从动物造成的伤口异常淋巴管的腹侧的可视化遇到提前一天在与快船队的皮毛去除组织损伤部位（注意动物的右侧）。拍摄图像，约5分钟后，10微升的ICG给药ID在基地的尾巴，每个左侧和右侧上。在非损伤（动物左）侧，腹股沟淋巴结可以可视化，以及直传出淋巴管引流向腋窝淋巴结。然而，在鼠标的右侧，正常的淋巴血管被打断伤人，由于出现异常，由于组织修复（结痂）。
图6。淋巴收缩功能的定量分析由排水从（a）到腋下淋巴结腹股沟LN和（d）的注射部位腘LN的爪上的背侧沿淋巴管中选择的ROI。红色虚线矩形的放大图像（嵌入在（a））示出了选择的ROI沿荧光容器。作为时间的函数的所有感兴趣区（a）和（d）是表示在（b）和（e）分别示出由伪彩色的情节的平均荧光强度的汇编。整个像素的荧光强度的扰动代表“脉冲”传播通过ROI和AR的淋巴E并行的箭头。单一感兴趣区22和45从（b）的平均荧光强度，示于（c）和18和34为单一的ROI的平均荧光强度（e）的（f）中所示。作为时间的函数（如图所示的（c）和（f））方便传播淋巴液和提取两个ROI之间的渡越时间和距离的数据包识别的荧光强度分布。两个ROI的选择是基于在上它们的位置沿淋巴管和与其中的最大值和最小值代表淋巴结传播所示的清晰度的一部分。速度计算两个ROI之间的距离和运输时间，峰之间的荧光强度的比值。 点击这里查看大图
图7，为了可视化的淋巴管的排水从腹股沟区域的腋窝区域，注入的左侧或右侧的基地的尾巴。在一般情况下，可视化的左侧，注入在位置5，6，9，或10，并以可视化的右侧，注入在位置7，8，11，或12。可能是太自卑的尾巴上，以获得最佳的摄取可视化从腹股沟淋巴引流区域腋下位置1至4。
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Discussion
我们使用一个自定义的，小动物NIRF成像系统捕捉到的图像标记的小鼠淋巴管。为了构建电影淋巴结运动，300或更多个图像被收集。有关从电影淋巴管的功能分析，两个或两个以上的ROI手工画出的沿淋巴容器。的感兴趣区的尺寸中为每个容器中，并保持恒定的直径约为该船只。虽然整个动物的空间分辨率可以描绘荧光淋巴管的100微米或更小，可以采用更精细的分辨率的图像的macrolens 10。为解剖参考的白色光图像，也可以使用一个低功率的灯获得。应当指出，如果成像剂是由具有不同的激发/荧光光谱，则上面所描述的过滤器的其他荧光染料必须改变，以维持成像性能，并可能需要调整，以及剂用量。此外，如果在激发波长为文件SS超过750纳米，那么自体荧光，可能会导致背景信号将增加，而成像的灵敏度会降低。此外，在溶液中的代理不稳定可能排除使用一些的NIRF染料，如菁7（CY7）。
适当的注射部位的选择将取决于正在研究淋巴管。以可视化的淋巴管的排水从腹股沟区域的腋窝区域，您将需要注入的尾巴的基部的左侧或右侧，如在图7中示出。从富丽堂皇的区域淋巴引流的可视化，你将需要注入的后掌背侧。它是必不可少的，以保持在正常范围内的动物的体温，体温改变可以导致不一致的淋巴功能。此外，因为大部分的CCD的动态范围有限，注射部位应用黑纸覆盖阻止荧光灯therebŸ实现可视化的调光器，引流淋巴管。成像应在一个黑暗的房间里进行，由于从房间的灯的光在荧光带的发射，以减少不必要的背景信号。动物也必须躺在一个黑色的背景上，同时进行成像，以减少光的后向散射。
NIRF淋巴造影能更好地了解淋巴管疾病和淋巴管的结构和功能的变化与疾病或受伤。例如，研究小组已经使用NIRF成像在小动物，提供淋巴表型的动物6,15和变化来检测在的淋巴功能和体系结构与癌转移10。在人类中，该技术已被用于检测淋巴水肿的早期迹象，评估淋巴水肿的治疗13,14,16，和表型遗传性淋巴管疾病的家庭成员。然而，非侵入性的visualization是有限的深淋巴管（>3厘米）的在人类组织中的光的散射。已收购猪和人体成像图像淋巴组织至3厘米深度。在人类中，MRI和动态淋巴显像已被用来量化从注射部位的造影剂在疾病的淋巴结的渡越时间。然而，他们缺乏足够的时间和空间分辨率，可视化很容易与NIRF成像的的淋巴推进事件。此外，健康的淋巴管是不可视化与MRI由于缺乏对比。 NIRF成像是非侵入性的，不像聚焦，多光子显微镜，活体成像。典型的共聚焦和多光子显微镜技术，利用部分或全部切除组织。 Scintographic方法需要使用放射性核素和一些较小的容器插管。另一种方法来可视化的淋巴管涉及活体成像鼠标安乐死，真皮被拉回以下ID注射Evans蓝染料。然而，这种方法不提供的功能或纵向成像17,18。淋巴结转移，可以使用一个西门子Inveon PET / CT成像，然而，此技术不允许淋巴结构或功能19的可视化。
虽然作者不建议也不支持任何特定的商用成像设备，我们的经验表明，光源和光学过滤器的选择可能是唯一最重要的因素，它决定了设备的灵敏度。如上所述Zhu 等人 ，对于成功地成像的低浓度的染料，有必须是最小之间的重叠的发射光谱的光源和光学滤光器20的透射光谱。另一个重要的考虑是NIRF使用的染料的吸收和发射光谱。本文ICG和CABD IRDye800的也有类似的SPECTRA等所描述的激光二极管的波长和过滤器的组合，可以用于每一个，然而，如果另一个染料是使用不吸收和/或荧光在这些波长，波长的光源和光学滤波器应该是相应调整。ICG对于许多应用程序可以是足够的，而且已经是FDA批准的。 NIRF-CABD FDA批准用于人类，但可能是有用的动物成像。 ICG没有化学连接附加靶向部分残留的，所以其他的荧光剂，如NIRF-CABD，正在开发中。
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Disclosures
作者有没有透露，但有些作者列出的专利。
Acknowledgments
这项工作是支持的补助伊娃Sevick：NIH R01 CA128919和美国国立卫生研究院R01 HL092923。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
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