Summary
近赤外蛍光(NIRF)を使用して、最近開発されたイメージング技術は、リンパ系の癌転移、免疫応答、創傷修復、および他のリンパ関連疾患に果たす役割の解明に役立つことがあります。
Abstract
リンパ脈管系は体液の恒常性を維持し、循環器系の重要な構成要素である、腸内の脂肪吸収免疫監視、および仲介を提供しています。しかし、その重要な機能にもかかわらず、リンパ系は、健康と病気の1にこれらの機能を果たすために適応する方法の比較的ほとんど理解があります。最近、我々は、近赤外蛍光(NIRF)染料とカスタムは、Gen III - のトレース管理を使用してリンパ管機能不全を患っている人の中でだけでなく、通常のヒト被験者の行動を "ポンピング"動的イメージリンパアーキテクチャやリンパへの能力を実証しているイメージングシステム2-4を強化した。 NIRFイメージングは、ヒトの疾患とリンパのアーキテクチャおよび機能の劇的な変化を示した。それは、これらの変更が発生すると新しい動物モデルは、それらの遺伝的および分子基盤を解明するために開発されているかは不明のままです。このプロトコルでは、NIRFリンパ、sを提示グリーン(ICG)、ヒトの7の50年間使われてきた染料と、優先的にマウスとヒトアルブミン8をバインドNIRF色素標識巡回アルブミン結合ドメイン(cABD-IRDye800)ペプチドを用いたインドシアニンモール動物イメージング5,6 。 ICGに比べて約5.5倍明るく、cABD-IRDye800は類似リンパクリアランスプロファイルを有し、イメージング8のための十分なNIRF信号を達成するためにICGより少ない用量で注射することができる。 cABD-IRDye800と間隙空間8にアルブミンに結合するICG両方あるので、彼らは両方に、リンパ管の中に活性なタンパク質の輸送を示すことができる。皮内(ID)ICGの注射(5-50μL)(645μM)または生理食塩水でcABD-IRDye800(200μM)を各後足および/またはベースの左側と右側の背側面に投与されるイソフルラン麻酔下のマウスの尾。動物で得られた染料濃度は、ICGのため83-1,250μg/ kgの用または113-1,700μg/ kgであるcABD-IRDye800。直ちに注射後、機能的なリンパイメージングは、カスタマイズされた、小動物NIRFイメージングシステムを用いて、最大1時間行われる。全体動物の空間分解能は、100ミクロン以下の蛍光リンパ管を描くことができ、深さが3cmに構造の画像アップが9を取得することができる。画像はV + +ソフトウェアを使用して取得すると、ImageJまたはMATLABソフトウェアを使用して分析される。分析時に、全体の血管の直径を包含関心の連続した領域(ROI)が与えられたリンパ管に沿って描かれています。各ROIの寸法が与えられた容器とNIRF強度を一定に保たれる定量的血管を通って移動するリンパの "パケット"を評価するために、各ROIを測定する。
Protocol
すべての動物実験は、それぞれの施設内動物のケアと使用委員会によってテキサス健康科学センター(テキサス州ヒューストン)の大学比較医学科、およびプロトコルの検討および承認後の分子イメージングのためのセンターの基準に準拠して行った(IACUC)または動物福祉委員会(AWC)。
1。イメージングに先立ち24時間動物の作製
リンパイメージングが行われる前に、以下の手順は、日(必要に応じて)実行する必要があります。
- インダクションボックスに動物を置き、イソフルランで落ち着いた。
- 動物は深い麻酔(つま先ピンチ操縦で監視)、イソフルランガスに接続されているノーズコーンのおむつ/綿毛パッドと位置鼻の上に場所鎮静動物の状態になると。
- 撮像する領域の周りのすべての髪/毛皮(もしあれば)をクリップします。
- クリップされた領域への脱毛剤(Nairさん)を適用して、それはO残すnの最大3分までのスキンです。
- 優しく暖かい、湿ったガーゼやペーパータオルですべての脱毛剤を拭き取ってください。
- 優しく暖かい水で皮膚を洗い流し、穏やかにガーゼやペーパータオルを使用して領域を乾燥させてください。
- 動物は加熱パッドの上に置くか、熱ランプの下で回復することができ、それらのケージに戻ります。
2。イメージングの日
- その後滅菌水で再構成するの造影剤、cABD-IRDye800ためICGまたは200μM(6.8μg/10μl)のための645μM(5μg/10μl)を達成するために、通常の滅菌(0.85%)、生理食塩水を用いて希釈してください。 暗闇の中で解決策をキープ条件と再構成の6時間内での使用。
- インダクションボックスに動物を置き、イソフルランで落ち着いた。
- 動物は深い麻酔(つま先ピンチ操縦で監視)、イソフルランガスに接続されているノーズコーンのおむつ/綿毛パッドと位置鼻の上に横向きに場所鎮静動物の状態になると。
- (その部屋はライトをオフにする暗い)。必要であれば、小さなデスクハロゲンライトは、注射を見るために、少量の光のために使用することができます。
- 31ゲージの針を有するインスリン注射器を使用して、に応じて、50 ICGのμlまたは各後足および/または尾の付け根の左側と右側の背側面でcABD-IRDye800にID5μlを注入する関心のある領域(説明を参照)。各注射量は0.083〜1.25 mg / kgの(ICG)または0.113から1.7 mg / kgの(cABD-IRDye800)まで及ぶかもしれません。注入量は、動物の系統と注射部位によって異なります。胸腺欠損マウスでは、注入量は5μl(後足)または10μL(尾の付け根)にすることができます。 動物が注射(s)のイメージングシステム下にない場合は、直後の撮像システムの下に動物を置く注射(秒)。
- 全く色素の取り込みがリンパ管に見られない場合は、ステップ2.5は動物プロトコルごとに、必要に応じて繰り返す必要があります。
- リンパ管が見られたら、黒色の電気テープや黒paで注射部位をカバー当たり。
- アップV + +ソフトウェアと小動物、NIRFイメージングシステムを用いて1時間にするために、リンパ管の画像を取得する。 (動物はイソフルランで鎮静され、画像が取得されている間呼吸が監視されます。)小動物ながら、NIRFイメージャーは市販されている、我々は、785 nmのレーザーダイオードで構成されるカスタマイズされた、小動物NIRFイメージングシステム(1005〜9ミリメートル-78503を活用、インテンス、ノースブランズウィック、ニュージャージー州)非球面レンズ(C24TME-B Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州)、ディフューザー(ED1-C20、Thorlabs)、フィルタ(LD01-785/10-25、Semrock、ニューヨーク州ロチェスター装備)平方センチメートル当たり10未満1.4 mWの入射フルエンス率で動物を照らす一様励振フィールドを作成します。 2 830 nmのフィルター(AND11333、アンドーバー社、セーラム、ニューハンプシャー州)と28ミリメートルニッコールレンズ(1992年、ニコン、との電荷結合素子を電子増倍(EMCCD、PhotonMax512、プリンストンインスツルメンツ、トレントン、ニュージャージー州)のカメラシステムメルヴィル、ニューヨーク州)は、統合ティムとリンパの画像をキャプチャするために使用されスタティックイメージング5のダイナミックイメージングと800ミリ用に200ミリ秒のES。システム構成、各構成要素の詳細については、表、およびキーイメージャの特性の簡潔な議論のための議論については、 図1を参照してください。
- 動物は加熱パッドの上に置くか、熱ランプの下で回復するとそのケージに戻るか、安楽死させることができます。
- ImageJのか、MATLABソフトウェアを使用して画像を分析します。 図6を参照してください。
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Representative Results
マウスにおけるNIRFリンパイメージングの例
ICGまたはcABD-IRDye800が通常のマウスの尾の基部にIDを注入されると、尾の基部に注射部位及び鼠径リンパ節(LN)の間にリンパ脈管はすぐに可視化しなければなりません。まもなく注入後(数秒分)、鼠径LNおよび腋窩LN間のリンパ管は、 図2に示すように可視化されるべきである。彼らは人間で行うようにしたマウスのリンパ管は、動物から動物に変化するので、図3に示すように、動物の間のアーキテクチャの変化が見られることがあります。 ICGまたはNIRF-cABDが正常マウスの後肢の背側面にIDを注入されると、2つのリンパ管は、 図4に示すように、膝窩LNに排水可視化することができる。いくつかのケースでは、それはお互いにため、その近接の両方の血管を区別することは困難である。
時には、リンパ管の可視化は、最も一般的にIDではなく、皮下に投与されている注射(SC)に起因して、遅れている。 SCの注射が与えられたとき、リンパ輸送はすぐに到達するために、皮膚のリンパ管毛細血管に取り込まれる染料に必要な追加の時間を()図5に示すように可視化されないかもしれません。それは代わりにサウスカロライナ州のIDを注入することが重要である理由です。 図5(b)に見られるような機会に、異常なリンパ管は、髪/バリカン毛皮からの咬傷やカットなどの創傷の領域において、観察される。動物の体の温度は、体温を変更すると、矛盾したリンパ機能をもたらすことができるように、正常範囲内に維持されるべきである。技術の限界は、皮膚の色素沈着による蛍光リンパ管の不明瞭化、イメージすることができないことによる深い胸部リンパ管を含む組織における光の散乱、およびリンパ機能で麻酔の効果が不明に。
一般的には、注射部位を消去するには、肝臓や膀胱をクリアするには、2日前の午前ICGまたはcABD-IRDye800デポのIDを取得し、最大3日間。残留蛍光シグナルがクリアされたときに、撮像プロトコルは、縦リンパイメージングは、いくつかの介入後にアーキテクチャやリンパ機能の変化を評価できるように、繰り返すことができます。
リンパ機能の解析
取得された画像は、データ解析のためにはImageJやMATLABにロードすることができます。一定面積、円形ROIが選択されているか、 図6(a)および図6(d)に示すように、人間と動物の10 5リンパイメージングのために行われた蛍光リンパ管の全長に沿って"描かれる"。 ROIは、その直径は約蛍光像の直径であるように選択されるntの容器。 図6(b)に示すように、各ROI内の平均蛍光強度は、リンパ管に沿って推進される染料を含んだ節の"パケット"の推進速度と頻度を評価するために、撮像時間の関数としてプロットされ、 図6(E )。図6(c)に示すように、リンパ推進のリンパ伝搬速度と周波数、2のROIを評価するためには、リンパのパケットの伝播を表す、明確に定義された最大値または最小蛍光強度の変化と、選択され、その蛍光強度プロファイルがプロットされていると図6(f)。伝搬速度は、それらの間に伝播するリンパのパケットのための2つのROIと通過時間の間の距離の比を取ることによって計算されます。蛍光パルスまたは時間ごとに単一のROIに到着する "パケット"の数を評価することにより、収縮頻度が計算されます。この技法は、ASSEする唯一の方法が用意されていますがSS走リンパの推進周波数および速度"パケット、"他の人が間接 的に造影剤のデポクリアランスを測定するため、除去速度定数11を計算することによってリンパ輸送を評価した。 10と初期感染癌転移では、動物でリンパ推進の損失を見つける。他の人が関節炎12に応答して、収縮性の変化を報告する。ヒトでは、我々は空気圧迫排水13と徒手リンパドレナージ(マッサージ)14を含むリンパ浮腫の治療後に増加推進を報告する。
図1:NIRF撮像システムは、小動物リンパイメージングのための特注のです。デバイスは、非球面レンズ、diffus装備785 nmのレーザーダイオードで構成されていますえー、蛍光リンパ10の画像をキャプチャするために、動物とEMCCDカメラ、集光レンズと、光学フィルタを照らす一様励振フィールドを作成するためのフィルタ。
図2 ICGまたはcABD-IRDye80010μlを31ゲージ針、尾の基部に注射部位及び鼠径リンパLN間のリンパ脈管を使用して、通常のマウスの尾の基部にIDを注入されるとすぐに可視化することがあります。動的蛍光イメージはすぐに注射した後、20分間、次の注入までの獲得されます。まもなく注射(数秒分)の後、注射部位及び鼠径部、LN間およびその後腋窩LNの領域にリンパ管は、側面図で可視化する。 図2に示されている画像は、5分を取られました。注射のWi後尾の付け根にIDをICGの目を10μl。鼠径部、腋窩領域の間の明るいスポットが肝臓である。
彼らは人間で行うようにしたマウスのリンパ管は、動物から動物に変化するので図3。、動物間のアーキテクチャの変化が見られ、経時的に安定であることもできる。マウス#124は、尾の付け根にICGを注入し、1日目にすぐに画像化した。上部パネルには、1日目だけでなく、同じマウスと注入/撮像プロトコルを使用して2日後に得られた画像(3日目)で得られた画像が含まれています。下のパネルは、ICGとすぐに画像化し、1日目、その後3日目に結像を注入し、別のマウス(#127)から取得した画像が含まれています。リンパアーキテクチャ(リンパ管のパターン)MOの間で変化しながら、#124と#127を使用し、NIRFを使用して得られた画像は、1日目と3日に各マウスで一貫しています。
図4:ICGまたはNIRF-cABDの5-10μlを正常マウスの後肢の背側面にIDを注入されると、2つのリンパ管は、膝窩LNに排水可視化されるべきである。動的蛍光イメージはすぐに注射した後、20分間、次の注入までの獲得されます。いくつかのケースでは、破線のボックスで表されて拡大された画像に示すようにため、その近接の両方の血管を区別することは困難である。ここに示されている代表的なマウスでは、ICGの10μlを、左後肢の背側面(最初の注射部位)およびテールベース(第二注射部位)の左側に注射した。この画像はCAだった最初の注射と約30秒後に3分 - - 2番目の注射後1分で約2 ptured。
図5:()時にはリンパ管の可視化は、IDの代わりにSCを投与された注射が原因で、最も一般的に、遅延または損なわれる。 ICGまたはcABD-IRDye80010μlの31ゲージの針を使用して、通常のマウスの尾の基部に、SC注入されると、リンパ輸送が到達するため、染料に必要な追加の時間をすぐに可視化することがないので、注意してアップ皮膚のリンパ管毛細血管によって。また、比較的深いSC注射のために、全くリンパ取り込み、したがって、血管やリンパ節のない可視化が全くないかもしれません。 図5(内)、マウスは注射後5分を取得した尾SCおよび画像のふもとICGの10μlを注入した。注射部位の色素は、可視化することができず、リンパ管やリンパ節を可視化することができません。これは、ID注射が重要である理由であり、(b)は傷に起因する異常なリンパ管の動物の腹側から可視バリカン(組織損傷部位は、動物の右側に記載)で毛皮の取り外し作業中には、1日早く検出されました。画像がキャプチャーされたICGの10μlの後、約5分間は、それぞれ左側と右側の尾の基部にIDを投与した。非負傷(動物の左)側では、鼠径LNはならびに腋窩LNSに向かって排水比較的まっすぐ輸出リンパ管を可視化することができる。マウスの右側では、しかし、正常なリンパ脈管構造が負傷のため中断し、組織修復(痂皮形成)のために異常な表示されていた。
図6リンパ管の収縮機能の定量分析は、腋窩LNに(a)は鼠径LNおよび膝窩LNに足の背側面上の(d)に注射部位から排出リンパ管に沿ってROIを選択して構成されています。赤い破線の長方形の拡大画像は、(()内のイラスト)は、蛍光血管に沿ってROIの選択を示します。 (a)と(d)は(b)と(e)は 、それぞれに示す擬似カラープロットで表されますから、すべてのROIのための時間の関数としての平均蛍光強度のコンピレーション。ピクセルにわたる蛍光強度の摂動は、リンパのROIとarを通って伝搬する "パルス"を表す矢印に平行な電子。シングルROIを22と45の平均蛍光強度から(b)に示されている(c)および単一のROI 18の平均蛍光強度と34からの(e)(f)に示されています。時間の関数伝播リンパと2つのROI間の通過時間と距離の抽出されたパケットの識別を容易にする(ように(c)と(f)に示すように)のような蛍光強度プロファイル。 2つのROIは、それらのリンパ管に沿って位置し、最大値と最小値を表すリンパ増殖が示されていると明快に部分的に基づいて選択されています。速度は2つのROIとピークの蛍光強度の間に撮影され、通過時間の間の距離の比として計算されます。 拡大図を表示するにはここをクリック
図7鼠径部から腋窩領域に排水リンパ管を可視化するためには、尾の付け根の左側または右側を注入します。一般的に、左側を視覚化するために、場所5、6、9、または10に注入し、そして右側を視覚化するために、位置7、8、11、または12に注入する。 〜4場所1は鼠径部から腋窩領域にリンパの流れを可視化するために最適な取り込みのための尾にあまりに劣るかもしれません。
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Discussion
我々は、マウスでラベルされたリンパ管の画像をキャプチャするためのカスタム、小動物NIRFイメージングシステムを使用しています。リンパ液の動きのムービーを作成するには、300枚以上の画像が収集されます。映画からリンパ管の機能解析のために、2つ以上のROIは手動でリンパ管に沿って描かれています。 ROIの寸法は、船舶ごとに一定に保たれ、約血管の直径アールアール。動物全体空間分解能が100ミクロン以下の蛍光リンパ管を描くことができますが、細かい解像度画像用マクロレンズは、10を用いることができる。解剖学的基準のため、白色光画像も低消費電力ランプを使用して取得することができます。これは、造影剤は、その後別の励起/蛍光発光スペクトル、上記のフィルタを使用して他の蛍光色素で構成されている場合は、結像性能を維持するために変更しなければならない、とエージェントの投与量は、同様に調整する必要があるかもしれないことに注意すべきである。また、励起波長はleである場合750 nm以下のSSは、自家蛍光が発生する可能性があり、バックグラウンドシグナルが増加し、撮像感度は低下します。加えて、溶液内のエージェントの不安定性は、シアニン7(Cy7)のようないくつかのNIRF染料の使用を排除することができる。
適切な注射部位の選択はリンパ管が検討されているかに依存します。鼠径部から腋窩領域に排出リンパ管を可視化するには、 図7に示すように、尾の付け根の右側または左側を注入する必要があります。宮殿のような地域から排出リンパ管を可視化するには、後足の背側面を注入する必要があります。体温を変更すると、矛盾したリンパ機能になる可能性があるため、正常範囲内で動物の体温を保つことが不可欠です。また、これは、ほとんどのCCDの限られたダイナミックレンジにより、注射部位を蛍光灯therebをブロックするために黒い紙で覆われていることyは、リンパ管を排水調光器の可視化を可能にします。イメージングは、室内の照明から蛍光バンドの光の放出に起因する不要なバックグラウンド信号を低減するために暗い部屋の中で行われるべきである。イメージングは後方散乱光を減らすために行われている間に動物にも黒い背景の上に横たわっている必要があります。
NIRFリンパイメージングは、リンパ管の病気や病気やけがに対してどのリンパアーキテクチャと機能の変化のより良い理解を可能にするかもしれない。例えば、研究チームは動物6,15のリンパ表現型を提供し、癌転移10とリンパ機能とアーキテクチャの変化を検出するために、小動物にNIRFイメージングを使用しています。ヒトでは、この技術は、リンパ浮腫2の初期徴候を検出するリンパ浮腫治療13,14,16、および遺伝性リンパ管症を有する表現型ファミリーのメンバーへの応答を評価するために使用されています。しかし、非侵襲的V人間の深いリンパ管のisualization(> 3 cm)を組織内の光の散乱によって制限されます。深さが3cmまでのリンパ管構造の画像は9豚と人間のイメージングで取得されています。ヒトでは、MRIや動的リンパシンチグラフィは、注射部位から疾患におけるリンパ節への造影剤の通過時間を定量化するために使用されてきた。しかし、それらは容易にNIRFで撮像リンパ推進イベントを可視化するのに十分な時間的·空間分解能が不足している。また、健康なリンパ管はコントラストが不足しているせいで、MRIで可視化されません。 NIRFイメージングは、共焦点、多光子顕微鏡、および生体内イメージングとは異なり、非侵襲的である。一般的に焦点と多光子顕微鏡技術は、部分的または完全に切除された組織を利用しています。 Scintographic方法は放射性核種、時にはマイナー血管カニュレーションの使用を必要とする。リンパ管を可視化するもう一つの方法は、マウスがある間の生体内イメージングを伴う安楽死させ、真皮は、エバンスブルー染料のID注射後に引き戻される。しかし、この方法は、機能または縦イメージング17,18を提供していません。 LN転移はシーメンスInveon PET / CTを用いて画像化することが可能であるが、この手法はリンパ構造や機能19の可視化を可能にしていません。
著者は推奨しておらず、特定の商業撮像素子を支持するものではありませんが、我々の経験は、光源と光学フィルターの選択はデバイスの感度を決定する最も重要な要因であるかもしれないことを示しています。としてZhu らによって記載され、染料の低濃度の成功イメージングのために、光源と光フィルタ20の透過スペクトルの発光スペクトルの間に最小限の重複が存在しなければならない。別の重要な考慮事項は、使用NIRF色素の吸収および発光スペクトルである。この紙ICGおよびcABD-IRDye800で同様のSPEを持っているCTRAなど記載のレーザダイオードの波長とフィルターの組み合わせは、それぞれに使用することができ、別の色素が吸収及び/又はこれらの波長で蛍光を発しないものに使用される場合は、光源の波長と光学フィルターがどうあるべきICGは、多くのアプリケーションで十分なことができます。それに応じて調整し、既にFDAに承認されています。 NIRF-cABDは、ヒトに使用するためにFDAに承認されていませんが、動物のイメージングのために役に立つかもしれません。 ICGは、標的化部分を取り付けるための残基を連結する化学物質を持っているようなNIRF-cABDほど他の蛍光剤は、開発されていません。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もないが、何人かの著者は、特許に記載されています。
Acknowledgments
NIHのR01 CA128919とNIH R01 HL092923:この作品はエヴァSevickに次の補助金によって支えられている。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
NAIR | Church Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
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