Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.
Abstract
דרך ביטוי אקטופי של ארבעה גורמי שעתוק, Oct4, Klf4, Sox2 וcMyc, תאים אנושיים סומטיים ניתן להמיר למדינת pluripotent, יצירת תאים שנקראים מושרים pluripotent גזע (iPSCs) 1-4. iPSCs מטופל ספציפי חסר הדאגות המוסריות האופפות תאי גזע עובריים (ESCs) ויעקפו דחייה חיסונית אפשרית. לפיכך, iPSCs שמשך תשומת לב רבה ללימודי מחל דוגמנות, ההקרנה של תרכובות תרופתיות, טיפולי משובים 5.
הראנו הדור של iPSCs האדם transgene חינם מחולים עם מחלות ריאה שונות באמצעות קלטת אחת excisable polycistronic lentiviral תאי גזע (STEMCCA) קידוד יאמאנאקה גורמי 6. קווי iPSC אלה נוצרו מfibroblasts עור, סוג התא הנפוץ ביותר המשמש לתכנות מחדש. בדרך כלל, קבלת fibroblasts דורשת עור ביופסיה ואחרי ההתרחבות של התאזה בתרבות לכמה קטעים. חשוב מכך, מספר הקבוצות דיווח תכנות מחדש של תאי דם היקפי אדם לiPSCs 7-9. במחקר אחד, גרסה מושרה ט של וקטור STEMCCA הועסקה 9, שנדרשת תאי הדם להידבק בו זמנית עם lentivirus constitutively פעיל קידוד טטרציקלין transactivator ההפוך. בניגוד לפיברובלסטים, תאי דם היקפיים ניתן לאסוף באמצעות נהלים פולשנית, צמצום אי הנוחות ומצוקתו של החולה באופן משמעותי. פרוטוקול פשוט ויעיל לתכנות מחדש של תאי דם באמצעות וקטור excisable אחת מכונן עשוי להאיץ את היישום של טכנולוגית iPSC על ידי שהופך אותו נגיש לקהילת מחקר רחבה יותר. יתר על כן, תכנות מחדש של תאי דם היקפיים מאפשר לדור של iPSCs מאנשים שביש להימנע מהם ביופסיות עור (כלומר. חריג הצטלקות) או עקב תנאי מחלה קיים preventiגישת ננוגרם לביופסיות אגרוף.
כאן אנו מדגימים פרוטוקול עבור הדור של iPSCs אדם מתאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) באמצעות וקטור lentiviral floxed-excisable אחת constitutively להביע 4 הגורמים. PBMCs נאסף טרי או מופשר הם התרחבו במשך 9 ימים כפי שתוארו 10,11 בחומצה אסקורבית המכילה בינונית, SCF, IGF-1, IL-3 ו-EPO לפני שtransduced עם lentivirus STEMCCA. תאים אז מצופים על MEFs ומושבות ESC דמויים יכולות להיות דמיינו שבועות לאחר הדבקה. לבסוף, שיבוטים נבחרו הורחבו ונבדקו לביטוי של סמני pluripotency SSEA-4, טרה-1-60 וטרה-1-81. פרוטוקול זה הוא פשוט, הגיוני ועקבי ביותר, ומספק מתודולוגיה אמינה לדור של iPSCs אדם מ4 מ"ל נגיש של דם.
Protocol
1. בידוד והרחבת תאי mononuclear דם היקפיים (PBMCs)
יום 0
- צייר 4 מ"ל של דם היקפי לתוך צינור BD Vacutainer CPT תא הכנה עם ציטרט הנתרן. הפכו צינור 8-10 פעמים וסרכזת ב1800 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. באופן אידיאלי, בשלב זה צריך להיעשות תוך 2 שעות של אוסף.
- איסוף תאי mononuclear (MCS) על ידי pipetting המעייל באפים (שכבת תאים בין הקריש חוסם ופלזמה) לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה. הבא נפח כולל עד 10 מ"ל עם תמיסת מלח סטרילית פוספט שנאגר-(PBS), היפוך כמה פעמים וצנטריפוגות XG ב 300 במשך 15 דקות.
- Resuspend התאים ב10 מ"ל של PBS סטרילי ולבצע ספירת תאים. העברת 1 עד 6 2x10 תאים לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה וצנטריפוגה XG ב 300 למשך 10 דקות.
- Resuspend התאים ב2 מ"ל של מדיום הרחבה (EM) (QBSF-60 בינוני תאי גזע המכיל 50 מיקרוגרם / המ"ל Ascoחומצת rbic, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, דקסאמתאזון 1 מיקרומטר ו 100 מיקרוגרם / המ"ל primocin או 1% עט / דלקת) ולהעביר ל אחד טוב של 12-צלחת היטב. דגירת התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממה.
- צנטריפוגה תאים שנותרו בגודל 300 x גרמתי למשך 10 דקות והקפאה ~ 2x10 6 תאים / בקבוקון המכיל בFBS DMSO 10%.
- כדי להפעיל את הפרוטוקול באמצעות PBMCs קפוא, להפשיר בקבוקון 1 של תאים לתוך 10 מ"ל של מדיום וצנטריפוגה QBSF ב 300 XG למשך 10 דקות. Resuspend התאים ב2 מ"ל של א"מ וגם להעביר לאחד מצלחת 12-כן. דגירת התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממה.
יום 3 ויום 6
- להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטים ולשטוף היטב פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום QBSF-60 לתאי גזע לאיסוף תאי חסיד.
- צנטריפוגה התאים XG ב 300 למשך 10 דקות.
- Resuspend התאים ב2 מ"ל של EM ולהעביר לאחד טוב של 12היטב צלחת. דגירת התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממה.
2. תמרה של PBMCs עם STEMCCA lentivirus
יום 9
- להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטים ולשטוף היטב פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום QBSF-60 לתאי גזע לאיסוף תאי חסיד.
- צנטריפוגה התאים XG ב 300 למשך 10 דקות.
- Resuspend התאים ב1 מ"ל של EM טרי המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל של polybrene וSTEMCCA lentivirus (משרד פנים = 1 עד 10) והעברה לטיפוס אחד מוכר היטב של צלחת 12-כן. (הפרוטוקול המתאר ייצור של חלקיקי lentiviral ניתן למצוא בhttp://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/)
- ספין הצלחת ב2250 סל"ד ב 25 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
- אחרי ספין, הוסף מ"ל נוסף של 1 EM הטרי המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל של polybrene עבור סכום כולל של 2 מ"ל של מדיום ודגירה את הצלחת ב37 מעלות צלזיוס,5% CO 2 חממה.
יום 10
- להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטים ולשטוף היטב פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום QBSF-60 לתאי גזע לאיסוף תאי חסיד.
- צנטריפוגה התאים XG ב 300 למשך 10 דקות.
- Resuspend התאים ב2 מ"ל של א"מ וגם להעביר ל1 מתוך צלחת 12-כן. דגירת התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממה.
3. ציפוי transduced תאים על MEFs
יום 11
- מעייל הבארות של צלחת 6-fibroblasts היטב עם הצלחת המומת עכבר העוברי (MEFs) 0.1% וג'לטין ב2x10 5 תאים / היטב במדיום MEF (IMDM המכיל, מיקרומטר 100 β-10% FBS, 1% חומצות ללא אמינו חיוניים mercaptoethanol, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / המ"ל primocin או 1% עט / דלקת). הכן 3 בארות לזיהום.
יום 12
- להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטים ולשטוף היטב פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום QBSF-60 לתאי גזע לאיסוף תאי חסיד.
- Resuspend התאים ב3 מ"ל של מדיום MEF המכיל 10 ng / ml bFGF, וחומצה אסקורבית וגורמי גדילה באותם ריכוזים כמו בשימוש במדיום EM (חומצת 50 מיקרוגרם / מ"ל אסקורבית, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 מיקרומטר דקסאמתאזון).
- מיליליטר צלחת 1 מתוך תאים להיטב של צלחת 6-גם מכילה MEFs. הוסף 1.5 מ"ל של תקשורת עם MEF bFGF, חומצה אסקורבית, וגורמי גדילה בהיקף כולל של 2.5 מ"ל של תקשורת / כן.
- ספין הצלחת ב 500 סל"ד ב 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. דגירה את הצלחת ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממה.
14 יום
- תאי הזנה בכל יום אחר עם 2.5 מ"ל של תקשורת המכילה MEF 10 ng / ml bFGF וחומצה 50 מיקרוגרם / מ"ל אסקורבית (אין גורמי צמיחה). לשאוב ולסלק תאים צפים לכל עדכון.
- הוסף MEFs נוסף לפי הצורך (בדרך כלל פעם בשבוע).
- ברגע מושבות קטנות מופיעות, תאי הזנה יומיומית עם 2 מ"ל של מדיום (DMEM/F12 20% החלפה מכילה נוק סרום, חומצות אמינו לא חיוניות 1%, 100 β-mercaptoethanol מיקרומטר, 2 מ"מ L-גלוטמין בתאי גזע עובריים האנושיים (hESC) , 100 מיקרוגרם / המ"ל primocin או 1% עט / דלקת ו10 ng / ml bFGF).
4. קטיף והרחבה משובטים iPSC
~ יום 30-40
- פיק כל מושבה בבארות בודדות של צלחת 12-היטב מראש seeded-עם MEFs מומת המכיל 1 מ"ל / היטב של מדיום hESC תוספת של 10 מיקרומטר של Stemolecule Y27632 (ROCK מעכב).
- להאכיל את התאים יומיים לאחר מכן עם 1 מ"ל של מדיום hESC בלבד (ללא מעכב ROCK).
5. כתמי immunofluorescence לסמני pluripotency
- צביעה בוצעה באמצעות "קיט ES Cell מרקר לדוגמה" ערכה מMillipore ובעקבות הפרוטוקול של היצרן.
6. כריתת integמדורג STEMCCA וקטור
- כריתה של תכנות מחדש של קלטת מושגת ניצול transfection Cre-ires-Puro להביע וקטור הבא ובחירת Puromycin קצרה כמתואר 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו מדגימים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם מPBMCs באמצעות וקטור lentiviral אחת. איור 1 א מציג ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. הדם נאסף לתוך צינור BD Vacutainer CPT תא הכנה עם ציטרט הנתרן, ולאחר צנטריפוגה, תאי mononuclear ניתן לאסוף מהממשק בין ג'ל פוליאסטר והפלזמה (אפי מעייל) (1B איור). את PBMCs הבודד לאחר מכן הרחיב בתרבות במשך 9 ימים. איור 2 משווה PBMCs ביום: 0 ויום 9, מראה כי התאים מתחלקים באופן ניכר. כ 10-15 ימים שלאחר transduction עם lentivirus STEMCCA, מראה של מושבות קטנות, בהירות הם נצפו, עם מורפולוגיה מושבה עדיין לא מוגדרת. בעקבות התוספת של מדיום hESC, מושבות hESC דמויים יכולות להיות מזוהות בקלות (האיור 2D). חלק ממושבות אלה נאספים באופן מכאני, הרחיב ומאופייןלביטוי של סמני pluripotency כגון SSEA-4, טרה-1-60 וטרה-1-81 (איור 3). שימוש בגישת בחירת Puromycin קצרה 6, אנו מסוגלים באופן עקבי להשיג שיבוטי iPSC transgene ללא כמתואר באיור 4.
איור 1. דור של iPSCs אדם מדם היקפי. א) ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המשמש לייצור iPSCs אדם מתאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) באמצעות וקטור STEMCCA. א"מ: בינוני הרחבה; GF: גורמי צמיחה; RBC: תאי דם אדומים; MEF: פיברובלסטים עובריים של עכבר; hESC: תאי גזע עובריים אנושיים B) Tube BD Vacutainer CPT תא ההכנה עם ציטרט הנתרן משמש לאיסוף כל הדם וההפרדה. של תאי mononuclear. ההפרדה מתרחשת במהלך צנטריפוגה כאשר הקריש החוסם מפריד tהוא תאי mononuclear ופלזמה ממרכיבי הדם הצפופים יותר. לאחר צנטריפוגה, ניתן לבודד תאים וטסיות mononuclear משכבה לבנבנה (באפי מעייל) מתחת לשכבת הפלזמה. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תמונות מייצגות של שינויים מורפולוגיים של תאים בפרוטוקול. א) יום 0: תאי mononuclear מבודדים מדם היקפי ותרבית במדיום התרחבות. . 20x הגדלת B) יום 9: לאחר התרחבות בתרבות במשך 9 ימים, אשכולות "אשכול הענבים כמו 'של תאים הם נצפו (חיצים) המצביעים על כך שהתאים בריאים ומתרבה לפני שtransduced. 20x הגדלת C) יום 20:. יצירת מושבות נצפתה שבוע לאחר הספירהLLS מצופים על MEFs. גדלת 10x ד) יום 30:. hESC דמוי מושבות iPSC להראות מורפולוגיה אופיינית ומוכנים לקטיף, והתרחבות. גדלה פי 4.
איור 3. אפיון iPSCs אדם נוצר מדם. ניתוח immunofluorescence של iPSCs נוצר מPBMCs מראה ביטוי של סמני pluripotency SSEA-4, טרה-1-60 וטרה-1-81. את iPSCs גם כתם חיובי לphosphatase אלקליין (Alk Phos).
איור 4. iPSCs הדור של iPSCs transgene חינם. הם transfected עם פלסמידcoexpressing Cre recombinase וגן puromycin-התנגדות, כפי שתוארו בסומרס et al, 2010.) A iPSCs לפני transfection. ב ') מוות של תאים הוא ציין, לאחר ימים של puromycin הבחירה C) מושבות חדשות לצאת מתאים עמידים סביב 10 ימים לאחר transfection . ד ') כמה מושבות נקטפות והתרחבו, וכתם דרום מבוצע כדי לאשר הכריתה של transgene. 1, 3, 5 ו 7: שיבוטי iPSC לפני הכריתה, 2, 4, 6 ו 8: שיבוטי iPSC לאחר כריתה. כל התמונות לעומת השלב בהגדלת 4x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו להלן מתארים את השימוש של וקטור lentiviral STEMCCA לייצר iPSCs אדם מתאי mononuclear בודד מכמה מיליליטרים של דם היקפי נאסף טרי. פרוטוקול יכול לשמש גם לתכנת מחדש PBMCs הקפוא (מתקבל ישירות מהמעייל באפים), פירוט של השלכות מעשיות משמעותיות כאשר ניצול תאי תורם נרכשו ממיקום מרוחק. לפני הגיוס של תכנות מחדש, PBMCs המבודד חייבת לעבור שלב התרחבות קריטית שהופך את אוכלוסייה מתרבה בריאה של תאים המתאימים יותר לתכנות מחדש גרעיני. זו נצפתה בקלות על ידי הנוכחות של 'אשכול ענבים כמו "האשכולות של תאים על התרחבות בתנאי תרבות hematopoietic. כאשר פחות מ 5x10 5 תאים transduced, תאים עשויים להיות מצופים על בארות אחד או שתיים של צלחת 6 היטב המכילה MEFs. יש לנו ניסיון מסוים בהשתנות הזמן הדרוש כדי להתבונן מושבות hESC דמויים, במקרים מסוימים עד 25 ימים שלאחר התמרה.השימוש במעכבי ROCK הוא קריטי כדי לשפר את ההישרדות ויעילות שיבוט על הבחירה של מושבות iPSC מתעורר. למרבה הפלא ובניגוד למה שנצפינו בעת לקיחת מושבות מfibroblasts reprogrammed, כמעט 100% ממושבות שנקטפו מPBMCs reprogrammed מקים שיבוטי iPSC יציבים שניתן להרחיב וcryopreserved. לבסוף, אנו מאמינים כי פשטות איסוף הדגימה בשילוב עם הגישה היעילה ומתואמת היטב תכנות מחדש שתוארה כאן, מייצג פלטפורמת תום לב ליישומים בם מספר גדול של שיבוטי iPSC צריך להיות שנוצר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקרים אלו מומנו בחלקו פרס NIH UO1HL107443-01 לGJM ו-GM על ידי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
