Summary
Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.
Abstract
Door ectopische expressie van vier transcriptiefactoren, Oct4, Klf4, SOX2 en cMyc kunnen menselijke somatische cellen worden omgezet pluripotent toestand genereren zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) 1-4. Patiënt-specifieke iPSCs missen de ethische bezwaren die embryonale stamcellen (SER's) omringen en mogelijk zou afstoting te omzeilen. Zo zijn iPSCs veel aandacht voor de ziekte modelstudies de screening van farmacologische verbindingen en regeneratieve therapieën 5.
We hebben aangetoond dat de generatie van transgene-vrije menselijke iPSCs van patiënten met verschillende longaandoeningen met een enkele accijnsproducten polycistronisch lentivirale Stem Cell Cassette (STEMCCA) dat codeert voor het Yamanaka factoren 6. Deze iPSC lijnen werden gegenereerd uit huidfibroblasten, de meest voorkomende celtype gebruikt voor het herprogrammeren. Normaal verkrijgen fibroblasten heeft een huid biopsie punch gevolgd door expansie van de cels in de cultuur voor een paar passages. Belangrijker is dat een aantal groepen rapporteerden de herprogrammering van humane perifere bloedcellen in iPSCs 7-9. In een studie werd een induceerbare Tet versie van de vector gebruikt STEMCCA 9, welk de bloedcellen gelijktijdig geïnfecteerd met een constitutief actieve lentivirus codeert omgekeerde tetracycline transactivator. In tegenstelling tot fibroblasten, kunnen perifere bloedcellen worden verzameld via minimaal invasieve procedures, wat veel ongemak en pijn van de patiënt. Een eenvoudige en effectieve protocol voor het herprogrammeren van bloedcellen met behulp van een constitutieve enkele accijnsgoederen vector kan versnellen van de toepassing van IPSC-technologie door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap. Bovendien herprogrammering van perifere bloedcellen maakt het genereren van iPSCs van individuen waarin huidbiopsies worden vermeden (dwz. Afwijkende littekens) of door reeds bestaande aandoeningen preventing toegang tot stansbiopsieën.
Hier laten we zien een protocol voor het genereren van menselijke iPSCs van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) met een floxed-accijnsgoederen lentivirale vector constitutief tot expressie de 4 factoren. Vers verzameld of ontdooide PBMC's worden uitgebreid voor 9 dagen, zoals beschreven 10,11 in medium bevattende ascorbinezuur, SCF, IGF-1, IL-3 en EPO alvorens getransduceerd met de STEMCCA lentivirus. Cellen worden vervolgens uitgeplaat op MEFs en ESC-achtige kolonies te visualiseren twee weken na infectie. Tenslotte worden geselecteerde klonen uitgebreid en getest op de expressie van markers pluripotentie de SSEA-4, Tra-1-60 en Tra-1-81. Dit protocol is eenvoudige, robuuste en zeer consistent, een betrouwbare methode voor het genereren van menselijke iPSCs uit gemakkelijk toegankelijke 4 ml bloed.
Protocol
1. Isolatie en expansie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs)
DAG 0
- Trek 4 ml van perifeer bloed in een BD Vacutainer CPT Cell Voorbereiding Buis met natriumcitraat. Inverteer de buis 8 tot 10 keer en centrifugeer bij 1800 g gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Idealiter zou deze stap gedaan worden binnen 2 uur na afname.
- Verzamel de mononucleaire cellen (MC's) door pipetteren de buffy coat (cellaag tussen gel barrière en plasma) in een steriele 15 ml conische centrifugebuis. Breng totale volume op 10 ml met steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), invertsuiker herhaaldelijk en centrifugeer bij 300 xg gedurende 15 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml steriel PBS en voer cellen. Breng 1 tot 2x10 6 cellen in een steriele 15 ml conische centrifugebuis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 2 ml expansie medium (EM) (QBSF-60 Stem Cell medium dat 50 ug / ml Ascorbic Acid, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM dexamethason en 100 ug / ml primocin of 1% Pen / Strep) en overbrengen in een putje van een 12-well plaat. Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Centrifugeer overige cellen bij 300 x g gedurende 10 min en vries ~ 2x10 6 cellen / flacon in FBS bevattende 10% DMSO.
- Het protocol die ingevroren PBMCs starten ontdooien 1 injectieflacon cellen in 10 ml van QBSF medium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Resuspendeer de cellen in 2 ml EM en overgedragen naar een putje van een 12-well plaat. Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
Dag 3 en dag 6
- Breng de cellen naar een steriele 15 ml conische buis en eenmaal wassen en met 1 ml van QBSF-60 Stem Cell Medium voor hechtende cellen te verzamelen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 2 ml EM en goed naar een van een 12-Well plaat. Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
2. Transductie van PBMCs met STEMCCA Lentivirus
DAG 9
- Breng de cellen naar een steriele 15 ml conische buis en eenmaal wassen en met 1 ml van QBSF-60 Stem Cell Medium voor hechtende cellen te verzamelen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml vers EM met 5 pg / ml polybreen en STEMCCA lentivirus (MOI = 1 tot 10) en overbrenging naar een putje van een 12-well plaat. (Het protocol beschrijft de productie van lentivirale deeltjes is te vinden op http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Draai de plaat bij 2250 rpm bij 25 ° C gedurende 90 minuten.
- Na het centrifugeren, voeg een extra 1 ml vers EM met 5 pg / ml polybreen voor een totaal van 2 ml medium en incubeer de plaat in een 37 ° C,5% CO2 incubator.
DAG 10
- Breng de cellen naar een steriele 15 ml conische buis en eenmaal wassen en met 1 ml van QBSF-60 Stem Cell Medium voor hechtende cellen te verzamelen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 2 ml EM en overbrengen in een well van een 12-well plaat. Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
3. Plating getransduceerde cellen op MEF
DAG 11
- Coat de putjes van een 6-wells plaat met 0,1% gelatine en plaat geïnactiveerd muis embryonale fibroblasten (MEF) op 2x10 5 cellen / putje in MEF medium (IMDM dat 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, 100 pM β- mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 100 ug / ml primocin of 1% Pen / Strep). Bereid 3 wells per infectie.
DAG 12
- Breng de cellen naar een steriele 15 ml conische buis en eenmaal wassen en met 1 ml van QBSF-60 Stem Cell Medium voor hechtende cellen te verzamelen.
- Resuspendeer de cellen in 3 ml van MEF medium dat 10 ng / ml bFGF en ascorbinezuur en groeifactoren in dezelfde concentraties als gebruikt in EM medium (50 ug / ml ascorbinezuur, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM dexamethason).
- Plaat 1 ml cellen per putje van een 6-wells plaat met MEFs. Voeg 1,5 ml van MEF media met bFGF, ascorbinezuur en groeifactoren voor een totaal van 2,5 ml medium / putje.
- Draai de plaat bij 500 rpm bij 25 ° C gedurende 30 minuten. Incubeer de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
DAG 14
- Feed cellen om de dag met 2,5 ml van MEF medium dat 10 ng / ml bFGF en 50 ug / ml ascorbinezuur (geen groeifactoren). Zuig en gooi drijvende cellen met elke feed.
- Voeg extra MEFs als nodig (meestal een keer per week).
- Zodra kleine kolonies verschijnen, voer cellen dagelijks met 2 ml van menselijke embryonale stamcellen (hESC) medium (DMEM/F12 dat 20% Knockout Serum vervanging, 1% niet-essentiële aminozuren, 100 uM β-mercapto-ethanol, 2 mM L-glutamine , 100 ug / ml primocin of 1% Pen / Strep en 10 ng / ml bFGF).
4. Picking en uitbreiding van IPSC Clones
~ DAG 30 tot 40
- Extra elke kolonie in afzonderlijke putjes van een 12-well plaat vooraf geënt met geïnactiveerd MEFs die 1 ml / putje hESC medium plus 10 pM Stemolecule Y27632 (ROCK inhibitor).
- Dagelijks voeden cellen daarna met 1 ml van hESC medium (geen ROCK inhibitor).
5. Immunofluorescentiekleuring voor Pluripotentie Markers
- Kleuring werd uitgevoerd met de kit "ES Cell Marker Sample Kit" van Millipore en volgens protocollen van de fabrikant.
6. Excisie van Integnominaal STEMCCA Vector
- Excisie van herprogrammering cassette wordt bereikt met behulp van een Cre-IRES-Puro expressie vector na transfectie en kortstondige puromycineselectie als beschreven 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We tonen een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs van PBMCs met een lentivirale vector. Figuur 1A toont een schematische weergave van het protocol. Het bloed wordt verzameld in een BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube met natriumcitraat en na centrifugeren, mononucleaire cellen kunnen worden verzameld uit het raakvlak tussen de polyester gel en het plasma (buffy coat) (Figuur 1B). De geïsoleerde PBMC worden dan uitgezet in cultuur 9 dagen. Figuur 2 vergelijkt PBMCs op dag 0 en dag 9, waaruit blijkt dat de cellen merkbaar delende. Ongeveer 10-15 dagen na transductie met de STEMCCA lentivirus, zijn verschijning van kleine heldere kolonies waargenomen, met nog undefined kolonie morfologie. Na toevoeging van hESC medium kan hESC-achtige kolonies gemakkelijk geïdentificeerd (Figuur 2D). Sommige van deze kolonies worden opgepikt mechanisch, uitgebreid en gekarakteriseerdvoor de expressie van markers zoals pluripotentie SSEA-4, Tra-1-60 en Tra-1-81 (Figuur 3). Met een korte puromycineselectie benadering 6, kunnen we consistent verkrijgen transgene vrij iPSC klonen zoals afgebeeld in figuur 4.
Figuur 1. Generatie van menselijke iPSCs uit perifeer bloed. A) Schematische weergave van het protocol voor menselijke iPSCs uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) met de vector STEMCCA genereren. EM: Uitbreiding medium, GF: Groeifactoren; RBC: rode bloedcellen; MEF: muis embryonale fibroblast; hESC: menselijke embryonale stamcellen B) BD Vacutainer CPT Cell Voorbereiding Buis met natrium citraat, gebruikt voor de inzameling van bloed en de scheiding. mononucleaire cellen. De scheiding gebeurt tijdens centrifugeren wanneer de gel barrière scheidt thij mononucleaire cellen en plasma van de dichtere bloedcomponenten. Na centrifugeren, kan mononucleaire cellen en bloedplaatjes worden geïsoleerd uit een wittige laag (buffy coat) net onder de plasma laag. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Afbeeldingen slechts ter illustratie van de morfologische veranderingen van de cellen tijdens het protocol. A) Dag 0: mononucleaire cellen werden geïsoleerd uit perifeer bloed en gekweekt in medium expansie. . 20x vergroting B) Dag 9: na expansie in de cultuur voor 9 dagen, 'tros druiven-achtige' clusters van cellen worden waargenomen (pijlen) suggereert dat de cellen gezond zijn en prolifererende voordat ze getransduceerd. 20x vergroting C) Dag 20:. Kolonievorming wordt waargenomen een week na de ceLLS worden uitgeplaat op MEFs. 10x vergroting) Dag 30:. HESC-achtige IPSC kolonies typische morfologie laten zien en zijn klaar voor het plukken en uitbreiding. 4x vergroting.
Figuur 3. Karakterisering van menselijke iPSCs gegenereerd uit bloed. Immunofluorescentie analyse van iPSCs gegenereerd uit PBMCs die de expressie van markers pluripotentie SSEA-4, Tra-1-60 en Tra-1-81. De iPSCs ook positief kleuren voor alkalische fosfatase (Alk Phos).
Figuur 4. Generatie van transgene zonder iPSCs. IPSCs worden getransfecteerd met een plasmideco-expressie Cre recombinase en een puromycine-resistentiegen, zoals is beschreven in Somers et al., 2010. A) iPSCs voor transfectie. B) celdood wordt waargenomen na twee dagen puromycineselectie C) New kolonies ontstaan van resistente cellen ongeveer 10 dagen na transfectie . D) Sommige kolonies gepikt en verder uitgegroeid en Southern Blot wordt uitgevoerd om de excisie van het transgen te bevestigen. 1, 3, 5 en 7: iPSC klonen voor excisie, 2, 4, 6 en 8: klonen iPSC na excisie. Alle fasecontrast beelden bij een vergroting van 4x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hierin de toepassing van de STEMCCA lentivirale vector menselijke iPSCs van mononucleaire cellen geïsoleerd uit enkele milliliters van vers verzameld perifeer bloed genereren. Het protocol kan ook gebruikt worden om ingevroren PBMCs (rechtstreeks verkregen uit de buffy coat), een detail van aanzienlijke praktische implicaties herprogrammeren bij gebruik donor cellen verkregen van een verre locatie. Voor de inductie van herprogrammering moet ondergaan geïsoleerde PBMCs een kritische expansiestap dat een gezonde prolifererende celpopulatie beter geschikt voor nucleaire herprogrammering maakt. Dit wordt gemakkelijk waargenomen door de aanwezigheid van "druiventros-achtige clusters van cellen na expansie in hematopoietische kweekomstandigheden. Wanneer minder dan 5x10 5 cellen getransduceerd kunnen cellen worden uitgeplaat op een of twee putjes van een 6-wells plaat met MEFs. We hebben ervaren enige variatie in de tijd die nodig hESC-achtige kolonies observeren, in sommige gevallen tot 25 dagen na transductie.Het gebruik van ROCK inhibitor is van cruciaal belang voor het voortbestaan en de kloneringsefficiëntie bij het plukken van de opkomende IPSC kolonies te verbeteren. Opmerkelijk en in tegenstelling tot wat we gezien bij het afhalen van kolonies van herprogrammeren fibroblasten, vrijwel 100% van de gekozen kolonies van geherprogrammeerd PBMCs vestigen stabiel IPSC klonen die kan worden uitgebreid en gecryopreserveerd. Tenslotte menen wij dat de eenvoud van de monstername combinatie met de zeer efficiënte en consistente herprogrammering aanpak beschreven, een bona fide platform vertegenwoordigen voor toepassingen waarbij grote aantallen klonen iPSC moeten worden gegenereerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studies werden deels gefinancierd door NIH UO1HL107443-01 Award uit aan GJM en GM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
