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Biology

मानव परिधीय रक्त से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का प्रयोग STEMCCA lentiviral वेक्टर पीढ़ी

Published: October 31, 2012 doi: 10.3791/4327
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 3, 1, 3, 1, 1
1Center for Regenerative Medicine (CReM), Boston University School of Medicine, 2Department of Hematology, Children's Hospital of Philadelphia, 3Center for Cellular and Molecular Therapeutics, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

यहाँ हम एक एकल lentiviral reprogramming वेक्टर का उपयोग परिधीय रक्त के 3-4 मिलीग्राम से मानव iPSCs पीढ़ी के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल दिखाते हैं. आसानी से उपलब्ध रक्त कोशिकाओं की Reprogramming यह एक व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए सुलभ बनाने के द्वारा iPSC प्रौद्योगिकी के उपयोग में तेजी लाने का वादा किया है.

Protocol

1. और परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का अलगाव विस्तार

0 दिन

  1. एक बी.डी. Vacutainer सोडियम साइट्रेट के साथ CPT सेल तैयारी ट्यूब में परिधीय रक्त के 4 मिलीलीटर ड्रा. ट्यूब 8 से 10 बार पलटना और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1800 XG पर अपकेंद्रित्र. आदर्श रूप में, इस कदम के संग्रह के 2 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए.
  2. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में buffy कोट (जेल बाधा और प्लाज्मा के बीच सेल परत) pipetting द्वारा mononuclear कोशिकाओं (MCS) ले लीजिए. 10 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) के साथ कई बार और 15 मिनट के लिए 300 XG अपकेंद्रित्र को पलटना कुल मात्रा लाओ.
  3. बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और सेल गिनती करते हैं. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र और 10 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र में 1 2x10 6 कोशिकाओं स्थानांतरण.
  4. विस्तार मध्यम के 2 मिलीलीटर (EM) (कोशिकाओं Resuspend QBSF 60 स्टेम सेल 50 ग्राम / मिलीलीटर Asco युक्त मध्यमrbic एसिड, 50 एनजी / एमएल SCF, 10 एनजी / IL-3 मिलीग्राम 2 यू / मिलीलीटर ईपीओ, 40 एनजी / एमएल IGF-1, 1 सुक्ष्ममापी Dexamethasone और 100 छ / मिलीलीटर primocin या 1% / पेन Strep) और करने के लिए स्थानांतरण एक अच्छी तरह से एक 12-अच्छी तरह से थाली की. एक 37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं सेते हैं, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.
  5. X 300 पर शेष कोशिकाओं अपकेंद्रित्र 10 मिनट और फ्रीज ~ 2x10 6 कोशिकाओं / 10% DMSO युक्त FBS में शीशी के लिए जी.
  6. जमी प्रोटोकॉल का उपयोग कर PBMCs शुरू करने के लिए, - QBSF मध्यम और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर में 10 मिनट के लिए 300 XG में कोशिकाओं की एक शीशी पिघलना करने के. EM के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और एक 12-अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण. एक 37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं सेते हैं, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.

3 दिन और 6 दिन

  1. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और के 1 मिलीलीटर QBSF 60-स्टेम सेल पक्षपाती कोशिकाओं को इकट्ठा मध्यम के साथ एक बार अच्छी तरह से धो लो.
  2. 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  3. EM के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और एक अच्छी तरह से एक 12 के हस्तांतरणअच्छी तरह से थाली. एक 37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं सेते हैं, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.

2. PBMCs के STEMCCA lentivirus साथ Transduction

दिन 9

  1. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और के 1 मिलीलीटर QBSF 60-स्टेम सेल पक्षपाती कोशिकाओं को इकट्ठा मध्यम के साथ एक बार अच्छी तरह से धो लो.
  2. 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  3. ताजा 5 ग्राम / polybrene और STEMCCA lentivirus मिलीलीटर युक्त EM के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend (MOI = के लिए 1 से 10) और एक 12-अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से एक को हस्तांतरण. (Lentiviral कणों के उत्पादन का वर्णन प्रोटोकॉल में पाया जा सकता http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
  4. २,२५० rpm पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए थाली स्पिन.
  5. स्पिन के बाद, ताजा EM के एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर जोड़ें मध्यम के 2 मिलीलीटर की एक कुल के लिए 5 ग्राम / polybrene मिलीलीटर युक्त और एक 37 डिग्री सेल्सियस में थाली सेते हैं,5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.

10 दिन की

  1. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और के 1 मिलीलीटर QBSF 60-स्टेम सेल पक्षपाती कोशिकाओं को इकट्ठा मध्यम के साथ एक बार अच्छी तरह से धो लो.
  2. 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  3. EM के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और एक 12-अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण. एक 37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं सेते हैं, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.

3. चढ़ाना MEFs पर कक्ष transduced

11 दिन

  1. कोट के साथ 0.1% जेलाटीन 2x10 5 कोशिकाओं में थाली और निष्क्रिय माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) / अच्छी तरह MEF मध्यम (IMDM FBS 10%, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड युक्त, 100 सुक्ष्ममापी β में एक 6-अच्छी तरह से थाली के कुओं mercaptoethanol, 2 मिमी एल Glutamine, 100 छ / मिलीलीटर primocin या 1 / कलम Strep%). संक्रमण के प्रति 3 कुओं तैयार.

12 दिन

  1. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और अच्छी तरह से एक बार धोने के 1 मिलीलीटर QBSF 60-स्टेम सेल पक्षपाती कोशिकाओं को इकट्ठा मध्यम के साथ.
  2. MEF मध्यम युक्त 10 एनजी / एमएल bFGF, और Ascorbic एसिड और एक ही सांद्रता में वृद्धि कारकों EM में उपयोग के रूप में की 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend मध्यम (50 / ग्राम मिलीलीटर Ascorbic एसिड, 50 एनजी / एमएल SCF, 10 एनजी / एमएल आईएल -3, 2 यू / मिलीलीटर ईपीओ, 40 एनजी / एमएल IGF-1, 1 सुक्ष्ममापी Dexamethasone).
  3. प्लेट कोशिकाओं के 1 मिलीग्राम प्रति एक 6 अच्छी तरह MEFs युक्त थाली की अच्छी तरह से. BFGF, Ascorbic एसिड, और वृद्धि कारकों के साथ / अच्छी तरह से मीडिया की 2.5 मिलीलीटर की एक कुल के लिए MEF मीडिया के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. 500 rpm पर 25 में थाली ° सी 30 मिनट के लिए स्पिन. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं.

14 दिन

  1. फ़ीड कोशिकाओं MEF 10 एनजी / एमएल bFGF और 50 Ascorbic / ग्राम मिलीलीटर एसिड (कोई वृद्धि कारकों) युक्त मीडिया की 2.5 मिलीलीटर के साथ हर दूसरे दिन. Aspirate और प्रत्येक फ़ीड के साथ चल कोशिकाओं को त्यागने.
  2. अतिरिक्त MEFs जरूरत के रूप में (आमतौर पर सप्ताह में एक बार).
पी "> दिन ~ 20

  1. एक बार छोटी कालोनियों में दिखाई देते हैं, फ़ीड कोशिकाओं मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) मध्यम (DMEM/F12 युक्त 20% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 100 सुक्ष्ममापी β-mercaptoethanol, 2 मिमी एल Glutamine के 2 मिलीलीटर के साथ दैनिक , 100 छ / मिलीलीटर primocin या 1% / कलम Strep और 10 एनजी / एमएल bFGF).

4. उठा और iPSC क्लोन का विस्तार

~ 30 दिन - 40

  1. पूर्व निष्क्रिय MEFs / hESC मध्यम की अच्छी तरह से 1 मिलीग्राम प्लस Y27632 Stemolecule (रॉक अवरोध करनेवाला) 10 सुक्ष्ममापी युक्त वरीयता प्राप्त एक 12 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में प्रत्येक कॉलोनी उठाओ.
  2. कोशिकाओं दैनिक तत्पश्चात फ़ीड hESC केवल मध्यम (कोई रॉक अवरोध करनेवाला) के 1 मिलीग्राम के साथ.

5. Pluripotency मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. धुंधला किट Millipore से "ES सेल मार्कर नमूना किट 'का उपयोग कर और निर्माता प्रोटोकॉल के बाद किया गया था.

6. Integ का काटनारेटेड STEMCCA वेक्टर

  1. कैसेट reprogramming की छांटना Cre IRES - Puro व्यक्त वेक्टर के बाद अभिकर्मक और संक्षिप्त Puromycin चयन के रूप में 6 वर्णित का उपयोग हासिल की है.

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Representative Results

हम एक एकल lentiviral वेक्टर का उपयोग PBMCs से मानव iPSCs की पीढ़ी के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल प्रदर्शित चित्रा 1A प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है. रक्त सोडियम साइट्रेट के साथ एक BD Vacutainer CPT सेल तैयारी ट्यूब में एकत्र किया जाता है, और centrifugation के बाद mononuclear कोशिकाओं पॉलिएस्टर जेल और प्लाज्मा (buffy कोट) (चित्रा 1 बी) के बीच इंटरफेस से एकत्र किया जा सकता है. पृथक PBMCs 9 दिनों के लिए तो संस्कृति में विस्तार चित्रा 2 0 दिन और 9 वें दिन में PBMCs तुलना, दिखा रहा है कि कोशिकाओं को काफ़ी बांट रहे हैं. के साथ लगभग 10-15 STEMCCA lentivirus दिन के बाद पारगमन, छोटे उज्ज्वल कालोनियों की उपस्थिति, अभी भी अपरिभाषित कॉलोनी आकारिकी के साथ मनाया जाता है. HESC माध्यम के अलावा के बाद, hESC तरह कालोनियों को आसानी से पहचाना (चित्रा 2 डी) हो सकता है. इन कालोनियों के कुछ यंत्रवत् से उठाया जाता है का विस्तार किया है और विशेषताpluripotency मार्करों SSEA-4, Tra-1-60 और Tra-1-81 (चित्रा 3) के रूप में की अभिव्यक्ति के लिए. एक संक्षिप्त Puromycin चयन 6 दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम लगातार transgene मुक्त iPSC क्लोनों प्राप्त के रूप में 4 चित्र में दर्शाया करने में सक्षम हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. परिधीय रक्त से मानव iPSCs जनरेशन. ए) परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) STEMCCA सदिश का उपयोग से मानव iPSCs को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. EM: विस्तार मध्यम, GF: वृद्धि कारक है, आरबीसी: लाल रक्त कोशिकाओं, MEF: माउस भ्रूणीय तंतुकोशिका; hESC: मानव भ्रूण स्टेम सेल बी) बी.डी. Vacutainer सोडियम पूरे रक्त का संग्रह के लिए इस्तेमाल किया साइट्रेट और जुदाई के साथ CPT सेल तैयारी ट्यूब. mononuclear कोशिकाओं की. जुदाई centrifugation के दौरान होता है जब जेल बाधा टी अलगवह mononuclear denser रक्त घटकों से कोशिकाओं और प्लाज्मा. Centrifugation के बाद, mononuclear कोशिकाओं और प्लेटलेट्स प्लाज्मा परत के नीचे एक सफेद परत (buffy कोट) से अलग किया जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रोटोकॉल में कोशिकाओं के morphological परिवर्तन के प्रतिनिधि छवियों. ए) 0 दिन: mononuclear कोशिकाओं परिधीय रक्त से अलग कर रहे हैं और विस्तार मध्यम में संवर्धित. 20x बढ़ाई बी) के 9 दिन: संस्कृति में 9 दिनों के लिए विस्तार के बाद, कोशिकाओं की 'का गुच्छा अंगूर की तरह' समूहों (तीर) मनाया जाता है सुझाव है कि कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और जा रहा है transduced पहले proliferating. 20x बढ़ाई सी) 20 दिवस: कॉलोनी गठन CE के एक सप्ताह के बाद मनाया जाता हैLLS MEFs पर चढ़ाया जाता है. 10x बढ़ाई डी) 30 दिवस: hESC तरह iPSC कालोनियों ठेठ आकारिकी दिखाने और उठा और विस्तार के लिए तैयार हैं. 4x बढ़ाई.

चित्रा 3
चित्रा 3. मानव रक्त से उत्पन्न iPSCs की विशेषता pluripotency SSEA-4, Tra 1 60 और Tra-1-81 मार्करों की अभिव्यक्ति दिखा PBMCs से उत्पन्न iPSCs इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण. iPSCs भी alkaline फॉस्फेट (Alk फॉसफोरस) के लिए सकारात्मक दाग.

चित्रा 4
चित्रा 4. Transgene मुक्त iPSCs की पीढ़ी. IPSCs एक प्लाज्मिड साथ ट्रांसफ़ेक्टके रूप में coexpressing Cre recombinase और एक जीन प्रतिरोध puromycin, Somers एट अल, 2010 में अभिकर्मक पहले वर्णित ए) iPSCs) बी कोशिका मृत्यु puromycin चयन सी के दो दिनों के बाद मनाया जाता है) नई कालोनियों अभिकर्मक के बाद 10 दिनों के आसपास प्रतिरोधी कोशिकाओं से उभरने डी) कुछ कालोनियों उठाया रहे हैं और विस्तार किया है, और दक्षिणी ब्लाट transgene की छांटना की पुष्टि करने के लिए किया जाता है. 1, 3, 5 और 7: iPSC क्लोनों छांटना पहले, 2, 4, 6 और 8: iPSC क्लोनों छांटना के बाद. 4x बढ़ाई सभी चरण विपरीत छवियों.

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Discussion

हम यहाँ STEMCCA lentiviral वेक्टर का उपयोग करने के लिए हौसले से एकत्र परिधीय रक्त के कुछ मिलीलीटर से अलग mononuclear कोशिकाओं से मानव iPSCs उत्पन्न का वर्णन करता है. प्रोटोकॉल भी जमी PBMCs (buffy कोट से सीधे प्राप्त), महत्वपूर्ण व्यावहारिक निहितार्थ के एक विस्तार reprogram जब दाता एक दूरस्थ स्थान से प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Reprogramming की प्रेरण पहले, पृथक PBMCs है कि अधिक परमाणु reprogramming करने के लिए उत्तरदायी कोशिकाओं की एक स्वस्थ proliferating आबादी renders एक महत्वपूर्ण विस्तार कदम से गुजरना होगा. यह आसानी से hematopoietic संस्कृति शर्तों में विस्तार पर कोशिकाओं के समूहों 'अंगूर की तरह का गुच्छा' की उपस्थिति के द्वारा मनाया जाता है. जब कम से कम 5 5x10 कोशिकाओं transduced रहे हैं, कोशिकाओं एक छह अच्छी तरह से MEFs युक्त थाली के एक या दो कुओं पर चढ़ाया जा सकता है. हम hESC तरह कालोनियों का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक समय में कुछ परिवर्तनशीलता अनुभव किया है, कुछ मामलों में 25 दिन के बाद पारगमन के लिए.रॉक अवरोध करनेवाला का उपयोग और उभरते iPSC कालोनियों के उठा पर क्लोनिंग दक्षता के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है. उल्लेखनीय है और हम क्या देखा जब reprogrammed fibroblasts से कालोनियों, स्थिर iPSC क्लोन है कि और विस्तार किया जा सकता है cryopreserved की स्थापना reprogrammed PBMCs से उठाया कालोनियों के लगभग 100% उठा विपरीत. अंत में, हमें विश्वास है कि अत्यधिक कुशल और लगातार reprogramming दृष्टिकोण के साथ संयुक्त नमूना संग्रह की सादगी का वर्णन यहाँ, अनुप्रयोगों में iPSC क्लोनों में से एक बड़ी संख्या को उत्पन्न करने की आवश्यकता के लिए एक सदाशयी मंच का प्रतिनिधित्व.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इन अध्ययनों के हिस्से में NIH UO1HL107443-01 जीजेएम और जीएम के लिए पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate BD Biosciences 362760
QBSF-60 Stem Cell Medium Quality Biological 160-204-101
IMDM Invitrogen 12440
DMEM/F12 Invitrogen 11330
FBS Atlanta Biologicals S10250
Knockout Serum Replacement Invitrogen 10828
Primocin Invivogen ant-pm-2
Pen/Strep Invitrogen 15140
L-Glutamine Invitrogen 25030
Non-Essential Amino Acids Invitrogen 11140
β-mercapt–thanol MP Biomedicals 190242
Ascorbic Acid Sigma A4544
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
SCF R&D Systems 255-SC
EPO R&D Systems 286-EP
Dexamethasone Sigma D4902
Polybrene Sigma H-9268
bFGF R&D Systems 233-FB
Stemolecule Y27632 Stemgent 04-0012
ES Cell Marker Sample Kit Millipore SCR002

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References

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Sommer, A. G., Rozelle, S. S.,… More

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