Summary
Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.
Abstract
Através da expressão ectópica de quatro factores de transcrição, Oct4, Klf4, Sox2 e cMyc, as células somáticas humanas pode ser convertido para um estado pluripotente, gerando assim chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 1-4. Específicas do paciente iPSCs faltam as preocupações éticas que envolvem as células-tronco embrionárias (CTEs) e seria ignorar rejeição imunológica possível. Assim, iPSCs têm atraído considerável atenção para estudos de doenças de modelagem, a triagem de compostos farmacológicos e terapias regenerativas 5.
Nós mostramos a geração de transgene livres iPSCs humanos a partir de pacientes com doenças pulmonares diferentes, utilizando um único coletável policistrónica lentiviral Cassete Stem Cell (STEMCCA) codificando os factores Yamanaka 6. Estas linhas iPSC foram gerados a partir de fibroblastos da pele, o tipo celular mais comum utilizado para a reprogramação. Normalmente, a obtenção de fibroblastos requer uma biópsia por punção da pele seguido de expansão das célulass na cultura de algumas passagens. É importante notar que um certo número de grupos têm relatado a reprogramação de células humanas de sangue periférico em iPSCs 7-9. Num estudo, uma versão induzível Tet do vector STEMCCA foi empregue 9, o que exigia que as células do sangue a ser simultaneamente infectadas com um lentivírus constitutivamente activo que codifica a tetraciclina reversa transactivador. Em contraste com os fibroblastos, células do sangue periférico podem ser recolhidas através de procedimentos minimamente invasivos, reduzindo o desconforto e sofrimento do paciente. Um protocolo simples e eficaz para a reprogramação de células de sangue utilizando um único vetor constitutivo coletável pode acelerar a aplicação da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Além disso, a reprogramação de células de sangue periférico permite a geração de iPSCs de indivíduos em que as biópsias da pele devem ser evitados (ie. Aberrante cicatriz) ou devido a condições de doença pré-existente prevenng acesso a punch.
Aqui demonstramos um protocolo para a geração de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), utilizando um vector floxed-coletável único lentiviral que expressam constitutivamente as quatro factores. PBMCs recolhidos de fresco ou descongelado são expandidos durante 9 dias, tal como descrito em 10,11 de ácido ascórbico, meio contendo SCF, IGF-1, IL-3 e EPO antes de serem transduzidas com o lentivirus STEMCCA. As células são então plaqueadas em MEFs e ESC-como colónias podem ser visualizadas de duas semanas após a infecção. Finalmente, os clones seleccionados são expandidos e testados quanto a expressão dos marcadores de pluripotência SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Este protocolo é simples, robusto e altamente consistente, fornecendo uma metodologia fiável para a geração de iPSCs humanos prontamente acessível a partir de 4 ml de sangue.
Protocol
1. Isolamento e expansão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)
DIA 0
- Aspire 4 ml de sangue periférico num Vacutainer CPT BD Tubo Preparação celular com citrato de sódio. Inverter o tubo de 8 a 10 vezes e centrifugar a 1800 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Idealmente, esta etapa deve ser feito dentro de 2 horas da coleta.
- Recolher as células mononucleares (MCs), pipetando buffy coat (camada de células entre barreira de gel e de plasma) para um tubo de 15 ml estéril de centrífuga cónico. Levar o volume total a 10 ml com fosfato estéril-salino tamponado (PBS), invertido várias vezes e centrifugar a 300 xg durante 15 min.
- Ressuspender as células em 10 ml de PBS estéril e efectuar a contagem de células. Transferir 1 a 2x10 6 células para um tubo estéril de 15 ml de centrífuga cónico e centrifugar a 300 xg durante 10 min.
- Ressuspender as células em 2 ml de meio de expansão (EM) (QBSF-60 Medium Stem Cell contendo 50 ug / ml AscoÁcido rbic, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml de IL-3, de 2 U / mL de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 uM de dexametasona e 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep) e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
- Centrifugar células restantes a 300 x g durante 10 min e liof ~ 2x10 6 células / frasco em FBS contendo DMSO a 10%.
- Para iniciar o protocolo utilizando PBMCs congelados, descongelar uma ampola de células para 10 ml de meio QBSF e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
Dia 3 eo dia 6
- Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes.
- Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min.
- Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de um 12Bem-placa. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
2. Transdução de PBMCs com STEMCCA Lentivirus
DIA 9
- Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes.
- Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min.
- Ressuspender as células em 1 ml de EM fresco contendo 5 ug / ml de polibreno e lentivírus STEMCCA (MOI = 1 a 10) e transferência para uma cavidade de uma placa de 12 poços. (O protocolo descreve a produção de partículas de lentivirais podem ser encontradas em http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Girar a placa a 2250 rpm a 25 ° C durante 90 min.
- Depois de girar, adicionar um adicional de 1 ml EM frescos contendo 5 ug / ml de polibreno durante um total de 2 ml de meio e incubar a placa a 37 ° C,5% de CO 2 incubadora.
DIA 10
- Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes.
- Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min.
- Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
3. Plating células transduzidas para MEFs
DIA 11
- Revestir os poços de uma placa de 6 poços com 0,1% de gelatina e de fibroblastos de ratinho inactivado placa embrionárias (MEFs) a 2x10 5 células / poço em meio de MEF (IMDM contendo 10% de FBS, 1% de não-aminoácidos essenciais, 100 uM β- -mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep). Prepare três poços por infecção.
DIA 12
- Transferir as células para um tubo estéril de 15 mL cónico e lavar o bem uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes.
- Ressuspender as células em 3 ml de MEF meio contendo 10 ng / ml de bFGF, e Ácido Ascórbico e factores de crescimento, nas mesmas concentrações utilizadas como meio de EM (50 Ácido Ascórbico ug / ml, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / mL de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 uM de dexametasona).
- Placa 1 ml de células por cavidade de uma placa de 6 poços contendo MEFs. Adicionar 1,5 ml de meio MEF com bFGF, ácido ascórbico, e factores de crescimento para um total de 2,5 ml de meio / poço.
- Girar a placa a 500 rpm a 25 ° C durante 30 min. Incubar a placa num 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
DIA 14
- Células de alimentação a cada dois dias com 2,5 ml de meio de MEF contendo 10 ng / ml de bFGF e 50 Ácido Ascórbico ug / ml (sem factores de crescimento). Aspirar e descartar células flutuantes com cada refeição.
- Adicionar MEFs adicional conforme necessário (normalmente uma vez por semana).
- Uma vez que as colónias aparecem pequenas, as células de alimentação diária com 2 ml de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) meio (DMEM/F12 substituição Knockout contendo 20% de soro, 1% de não-aminoácidos essenciais, 100 uM β-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina , 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep e 10 ng / ml de bFGF).
4. Picking e Expansão da iPSC Clones
~ DIA 30-40
- Escolha cada colónia em poços individuais de uma placa de 12 poços pré-semeadas com MEFs inactivada contendo 1 ml / poço de meio hESC mais 10 uM de Stemolecule Y27632 (ROCK inibidor).
- Alimentar as células depois diariamente com 1 ml de meio hESC apenas (sem inibidor ROCK).
5. Imunofluorescência para Marcadores pluripotência
- A coloração foi realizada utilizando o kit "ES celular Kit Amostra Marker" da Millipore e seguindo o protocolo do fabricante.
6. Excisão de IntegPopulares STEMCCA Vector
- Excisão de reprogramação cassete é conseguido utilizando uma Cre-IRES-Puro transfecção vetor expressando seguindo e seleção Puromicina breve como descrito 6.
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Representative Results
Nós demonstramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de PBMCs, utilizando um vector lentiviral única. Figura 1A mostra uma representação esquemática do protocolo. O sangue é recolhido para um tubo CPT Vacutainer BD Preparação celular com citrato de sódio, e após a centrifugação, as células mononucleares pode ser recolhida a partir da interface entre o gel de poliéster e o plasma (buffy coat) (Figura 1B). As PBMCs isoladas são então expandidas em cultura durante 9 dias. A Figura 2 compara PBMCs no dia 0 e ao dia 9, que mostra que as células são visivelmente divisória. Cerca de 10-15 dias pós-transdução com o lentivírus STEMCCA, aparecimento de pequenas colônias brilhantes são observadas, com morfologia da colônia ainda indefinido. Após a adição do meio de hESC, hESC-como colónias podem ser facilmente identificados (Figura 2D). Algumas destas colónias são mecanicamente colhidas, expandidas e caracterizadopara a expressão de marcadores de pluripotência como SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81 (Figura 3). Utilizando uma abordagem de selecção breve Puromicina 6, que é capaz de obter de forma consistente transgene livres de clones iPSC, conforme ilustrado na Figura 4.
Figura 1. Geração de iPSCs humanos a partir de sangue periférico. A) Representação esquemática do protocolo utilizado para gerar iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), utilizando o vector STEMCCA. EM: Médio Expansão; GF: Fatores de Crescimento; RBC: glóbulos vermelhos; MEF: fibroblastos embrionário; CTEh: células estaminais embrionárias humanas B) BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com citrato de sódio utilizado para a coleta de sangue total e da separação. de células mononucleares. A separação ocorre durante a centrifugação, quando a barreira de gel separa tele células mononucleares e de plasma a partir dos componentes sanguíneos mais densas. Após centrifugação, as células mononucleares e de plaquetas podem ser isolados a partir de uma camada esbranquiçada (buffy coat) apenas sob a camada de plasma. para ver figura maior .
Figura 2. Imagens representativas de alterações morfológicas das células de todo o protocolo. A) DIA 0: Células mononucleares são isoladas a partir de sangue periférico e cultivadas em meio de expansão. . 20x B) Dia 9: após expansão em cultura durante 9 dias, "cacho de uvas-tais como" aglomerados de células são observadas (setas), sugerindo que as células saudáveis e a proliferar antes de serem transduzidas. 20x C) Dia 20:. Formação de colónias é observado após uma semana do cells são plaqueadas em MEFs. 10x D) Dia 30:. HESC-como colônias iPSC mostrar morfologia típica e estão prontos para a colheita e expansão. Ampliação de 4x.
Figura 3. Caracterização de iPSCs humanos gerados a partir de sangue. Análise por imunofluorescência da iPSCs gerados a partir de PBMC que mostram a expressão dos marcadores de pluripotência SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Os iPSCs também coloração positiva para fosfatase alcalina (Alk Phos).
Figura 4. IPSCs geração de transgene livres iPSCs. São transfectadas com um plasmídeocoexpressing Cre recombinase e um gene de resistência à puromicina, como descrito em Somers et al, 2010. iPSCs A) antes da transfecção. B) A morte celular é observada após dois dias de selecção puromicina C) as colónias New emergir a partir de células resistentes a cerca de 10 dias após a transfecção . D) Algumas colónias são colhidas e expandidas, e Southern Blot é realizado para confirmar a excisão do transgene. 1, 3, 5 e 7: clones iPSC antes da excisão, 2, 4, 6 e 8: clones iPSC após excisão. Todas as imagens de contraste de fase com aumento de 4x.
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Discussion
Descrevemos aqui a utilização do vector lentiviral STEMCCA para gerar iPSCs humanos a partir de células mononucleares isoladas de alguns mililitros de solução recentemente colhido sangue periférico. O protocolo pode também ser usado para reprogramar PBMCs congelados (obtido directamente a partir de buffy coat), um detalhe de implicações práticas quando se utilizam células de dador adquiridas a partir de um local distante. Antes da indução de reprogramação, PBMCs isoladas deve ser submetida a um passo de expansão críticos que torna uma população saudável de proliferação de células mais passíveis de reprogramação nuclear. Isto é facilmente observado pela presença de "cacho de uvas-tais como" aglomerados de células após a expansão em condições de cultura hematopoiéticas. Quando inferior a 5x10 5 células são transduzidas, as células podem ser colocadas em um ou dois poços de uma placa de 6 poços contendo MEFs. Temos experimentado alguma variabilidade no tempo necessário para se observar colónias hESC semelhantes, em alguns casos, até 25 dias após a transdução.O uso de inibidor de rocha é fundamental para aumentar a sobrevivência e eficiência de clonagem em cima pegando de emergentes colônias IPSC. Notavelmente e em contraste com o que observamos ao escolher colônias de fibroblastos reprogramadas, praticamente 100% das colônias selecionadas a partir de PBMCs reprogramadas estabelecem estáveis clones iPSC que podem ser expandidas e criopreservados. Finalmente, pensamos que a simplicidade da colheita da amostra combinada com a abordagem altamente eficiente e consistente de reprogramação aqui descrito, representa uma plataforma bona fide para aplicações em que um grande número de clones iPSC precisam de ser gerada.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Estes estudos foram financiados em parte pelo NIH Prêmio UO1HL107443-01 a GJM e GM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
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