Summary
Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.
Abstract
Durch die ektopische Expression von vier Transkriptionsfaktoren, Oct4, Klf4, Sox2 und cMyc können menschliche Körperzellen zu einer pluripotenten Zustand umgewandelt werden, erzeugen so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) 1-4. Patienten-spezifischen iPS fehlen die ethischen Bedenken, die embryonalen Stammzellen (ESC) umgeben und möglich wäre Immunabwehr zu umgehen. So haben iPSCs große Aufmerksamkeit für die Krankheit Modeling-Studien, das Screening von pharmakologischen Verbindungen und regenerative Therapien 5 angezogen.
Wir haben die Erzeugung von Transgen-freien menschlichen iPS von Patienten mit unterschiedlichen Lungenerkrankungen mit einer einzigen verbrauchsteuerpflichtiger polycistronischen lentiviralen Stem Cell Kassette (STEMCCA) Codieren der Yamanaka Faktoren 6 gezeigt. Diese Linien wurden iPSC aus Hautfibroblasten, die häufigste Zelltyp zum Umprogrammieren verwendet erzeugt. Normalerweise erfordert ein Erhalten Fibroblasten Haut Stanzbiopsie gefolgt durch Expansion der Zelles in der Kultur für ein paar Passagen. Wichtigerweise haben eine Anzahl von Gruppen die Umprogrammierung von menschlichen peripheren Blutzellen in IPSCs 7-9 berichtet. In einer Studie wurde eine induzierbare Tet Version des STEMCCA Vektor 9 verwendet, welche erforderlich ist, um die Blutzellen gleichzeitig mit einem konstitutiv aktiven Lentivirus Codieren des Reverse Tetracyclin-Transaktivator-infiziert. Im Gegensatz zu Fibroblasten, kann peripheren Blutzellen mittels minimal-invasive Verfahren gesammelt werden, stark reduziert die Beschwerden und Leiden des Patienten. Eine einfache und effektive Protokoll zur Reprogrammierung Blutkörperchen Verwendung eines konstitutiven einzigen verbrauchsteuerpflichtiger Vektor kann die Anwendung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen. Darüber hinaus Umprogrammierung der Zellen des peripheren Blutes ermöglicht die Erzeugung von iPS von Einzelpersonen in der Hautbiopsien vermieden werden (dh. Aberrante Narbenbildung) oder sollten aufgrund bereits bestehenden Krankheitszuständen preventing Zugang zu Stanzbiopsien.
Hier zeigen wir, ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung eines einzigen floxed-verbrauchsteuerpflichtigen Lentivirusvektor konstitutiv exprimieren die 4 Faktoren. Frisch gesammelten oder aufgetaute PBMCs werden für 9 Tage wie beschrieben in Medium enthaltenden 10,11 Ascorbinsäure, SCF, IGF-1, IL-3 und EPO bevor es mit dem STEMCCA Lentivirus transduziert erweitert. Die Zellen werden dann auf MEFs ausplattiert und ESC-ähnliche Kolonien visualisiert werden kann 2 Wochen nach der Infektion. Schließlich werden selektierten Klone expandiert und auf die Expression der Marker Pluripotenz SSEA-4, Tra-1-60 und Tra-1-81. Dieses Protokoll ist einfach, robust und sehr konsistente, eine zuverlässige Methode zur Herstellung von menschlichen IPSCs aus leicht zugänglichen 4 ml Blut.
Protocol
Ein. Isolation und Expansion von peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMCs)
DAY 0
- Zeichnen 4 ml peripheres Blut in einen BD Vacutainer CPT Zellpräparation Tube mit Natriumcitrat. Das Röhrchen 8 bis 10 Mal und zentrifugieren bei 1.800 xg für 30 min bei Raumtemperatur. Idealerweise sollte dieser Schritt innerhalb von 2 h der Entnahme erfolgen.
- Sammeln Sie die mononukleären Zellen (MCs) durch Pipettieren der Buffy-Coat (Zellschicht zwischen Gelbarriere und Plasma) in ein steriles 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Bringt Gesamtvolumen auf 10 ml mit sterilem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Invertzucker mehrmals und Zentrifuge bei 300 × g für 15 min.
- Die Zellen in 10 ml sterilem PBS und führen Zellzahl. Übertragen 1 bis 2x10 6 Zellen in einen sterilen konischen 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und bei 300 g zentrifugiert für 10 min.
- Die Zellen in 2 ml der Expansion Medium (EM) (QBSF-60 Stem Cell Medium, das 50 ug / ml AscoRBIC Acid, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 nM Dexamethason und 100 ug / ml primocin oder 1% Pen / Strep) und zu übertragen eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
- Zentrifuge restlichen Zellen bei 300 x g für 10 min und gefriergetrocknet ~ 2x10 6 Zellen / Fläschchen in FBS, das 10% DMSO.
- Um das Protokoll mit gefrorenen PBMCs beginnen, aufzutauen 1 Fläschchen von Zellen in 10 ml QBSF mittel-und Zentrifuge bei 300 xg für 10 min. Die Zellen in 2 ml EM und Transfer in ein Well einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
Tag 3 und Tag 6
- Übertragen der Zellen an ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und wäscht die auch einmal mit 1 ml QBSF-60 Stem Cell Medium um anhaftende Zellen zu sammeln.
- Zentrifugation der Zellen bei 300 g für 10 min.
- Die Zellen in 2 ml EM und Übertragung auf eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
2. Transduktion von PBMCs mit STEMCCA Lentivirus
TAG 9
- Übertragen der Zellen an ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und wäscht die auch einmal mit 1 ml QBSF-60 Stem Cell Medium um anhaftende Zellen zu sammeln.
- Zentrifugation der Zellen bei 300 g für 10 min.
- Die Zellen in 1 ml frischem EM enthaltend 5 ug / ml Polybren und STEMCCA Lentivirus (MOI = 1 bis 10) aufnehmen und in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. (Das Protokoll beschreibt die Produktion von lentiviralen Partikeln finden Sie unter http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Spin die Platte bei 2250 UpM bei 25 ° C für 90 min.
- Nach Spin, eine zusätzliche 1 ml frisches EM enthaltend 5 ug / ml Polybren für insgesamt 2 ml Medium und Inkubation der Platte bei 37 ° C,5% CO 2-Inkubator.
TAG 10
- Übertragen der Zellen an ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und wäscht die auch einmal mit 1 ml QBSF-60 Stem Cell Medium um anhaftende Zellen zu sammeln.
- Zentrifugation der Zellen bei 300 g für 10 min.
- Die Zellen in 2 ml EM und Transfer zum 1 Well einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
3. Plating transduzierten Zellen auf MEFs
TAG 11
- Bestreichen Sie die Wells einer 6-Well-Platte mit 0,1% Gelatine und Platte inaktivierte embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) bei 2x10 5 Zellen / Well in MEF Medium (IMDM mit 10% FBS, 1% Non-Essential Amino Acids, 100 uM β- Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml primocin oder 1% Pen / Strep). Bereiten 3 Wells pro Infektion.
TAG 12
- Übertragen der Zellen an ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und die gut waschen einmal mit 1 ml QBSF-60 Stem Cell Medium, um anhaftende Zellen zu sammeln.
- Die Zellen in 3 ml Medium, das MEF 10 ng / ml bFGF und Ascorbinsäure und Wachstumsfaktoren in den gleichen Konzentrationen wie im EM genutzte Medium (50 ug / ml Ascorbinsäure, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM Dexamethason).
- Plate 1 ml der Zellen pro Well einer 6-Well-Platte mit MEFs. 1,5 ml Medium mit bFGF MEF, Ascorbinsäure, und Wachstumsfaktoren für insgesamt 2,5 ml Medium / Vertiefung.
- Spin die Platte bei 500 UpM bei 25 ° C für 30 min. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
TAG 14
- Feed-Zellen jeden zweiten Tag mit 2,5 ml MEF Medien mit 10 ng / ml bFGF und 50 ug / ml Ascorbinsäure (keine Wachstumsfaktoren). Absaugen und entsorgen schwimmenden Zellen mit jedem Feed.
- Fügen Sie zusätzliche MEFs nach Bedarf (in der Regel einmal pro Woche).
- Sobald kleine Kolonien erscheinen, Futtermittel-Zellen täglich mit 2 ml humanen embryonalen Stammzellen (hES) mittel (DMEM/F12 mit 20% Knockout Serum Replacement, 1% Non-Essential Amino Acids, 100 uM β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin , 100 ug / ml primocin oder 1% Pen / Strep und 10 ng / ml bFGF).
4. Kommissionier-und Ausbau der iPSC Clones
~ DAY 30 bis 40
- Wählen Sie jede Kolonie in einzelnen Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit inaktivierten MEFs mit 1 ml / Well hESC Medium plus 10 uM Stemolecule Y27632 (ROCK-Inhibitor) voreingestellt ausgesät.
- Führen Zellen danach täglich mit 1 ml hESC Medium nur (keine ROCK-Inhibitor).
5. Immunfluoreszenzfärbung für Pluripotenz Markers
- Färbung erfolgte mit dem Kit "ES Cell Marker Sample Kit" von Millipore und nach dem Protokoll des Herstellers.
6. Exzision Integrated STEMCCA Vector
- Excision der Reprogrammierung Kassette erreicht Verwendung eines Cre-IRES-Puro Expressionsvektor nach Transfektion und kurze Puromycin Selektion als 6 beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir demonstrieren eine einfache und effektive Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus PBMCs unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektor. 1A zeigt eine schematische Darstellung des Protokolls. Das Blut wird in einen BD Vacutainer CPT Zellpräparation Tube mit Natriumcitrat gesammelt, und nach Zentrifugation, mononukleären Zellen können von der Schnittstelle zwischen dem Polyester Gel und dem Plasma (buffy coat) (1B) gesammelt werden. Die isolierten PBMCs werden dann in der Kultur für 9 Tage erweitert. Abbildung 2 vergleicht PBMCs an Tag 0 und Tag 9, die zeigen, dass die Zellen spürbar teilen. Etwa 10-15 Tage nach der Transduktion mit dem STEMCCA Lentivirus, sind Aussehen von kleinen hellen Kolonien beobachtet, mit noch undefined Koloniemorphologie. Nach Zugabe von HES Medium kann HES-ähnliche Kolonien leicht identifiziert werden (2D). Einige dieser Kolonien sind mechanisch aufgenommen, erweitert und gekennzeichnetfür die Expression von Pluripotenz Marker wie SSEA-4, Tra-1-60 und Tra-1-81 (Abb. 3). Mit einem kurzen Puromycin-Ansatz 6, sind wir in der Lage, konsequent zu erhalten Transgen-free iPSC Klone wie in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 1. Herstellung von humanen IPSCs aus dem peripheren Blut. A) Schematische Darstellung des Protokolls verwendet werden, um menschliche IPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung des Vektors STEMCCA erzeugen. EM: Expansion Medium; GF: Growth Factors, RBC: Red Blood Cells; MEF: Mouse Embryonic Fibroblast; hESC: humanen embryonalen Stammzellen B) BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube mit Natriumcitrat für die Sammlung von Vollblut und der Trennung. mononukleärer Zellen. Die Trennung erfolgt während der Zentrifugation, wenn das Gel Barriere trennt ter einkernigen Zellen und Plasma von den dichteren Blutbestandteilen. Nach Zentrifugation kann mononukleären Zellen und Blutplättchen aus einer weißlichen Schicht (buffy coat) knapp unter der Plasmaschicht isoliert werden. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Repräsentative Bilder von morphologischen Veränderungen der Zellen während des Protokolls. A) Tag 0: mononukleären Zellen aus peripherem Blut isoliert und in Expansionsmedium. . 20facher Vergrößerung B) TAG 9: nach der Expansion in Kultur für 9 Tage, 'Weintraube-like' Cluster von Zellen beobachtet werden (Pfeile) darauf hindeutet, dass die Zellen gesund sind und proliferierenden bevor transduziert. 20-facher Vergrößerung C) DAY 20:. Koloniebildung wird eine Woche nach der ce beobachtetlls werden auf MEFs ausplattiert. 10facher Vergrößerung D) DAY 30:. HESC-like iPSC Kolonien typische Morphologie zeigen und bereit sind, für die Kommissionierung und Expansion. 4x Vergrößerung.
Abbildung 3. Charakterisierung humaner IPSCs aus Blut erzeugt. Immunfluoreszenz Analyse IPSCs aus PBMCs zeigt die Expression der Marker Pluripotenz SSEA-4, Tra-1-60 und Tra-1-81 erzeugt. Die iPS auch färben Alkaline Phosphatase (Alk Phos) positiv.
Abbildung 4. Erzeugung von Transgen-freie IPSCs. IPSCs werden mit einem Plasmid transfiziertKoexpression Cre-Rekombinase und eine Puromycin-Resistenz-Gen, wie in Somers et al, 2010 beschrieben. A) iPSCs vor der Transfektion. B) Zelltod nach zwei Tagen Puromycin-Selektion C beobachtet wird) New Kolonien entstehen aus resistenten Zellen etwa 10 Tage nach der Transfektion . D) Einige Kolonien werden ausgewählt und expandiert, und Southern Blot durchgeführt wird, um die Excision des Transgens zu bestätigen. 1, 3, 5 und 7: iPSC Klone vor Exzision; 2, 4, 6 und 8: iPSC Klonen nach Exzision. Alle Phasen kontrastreiche Bilder mit 4x Vergrößerung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir beschreiben hier die Verwendung des STEMCCA Lentivirusvektor die menschliche IPSCs aus mononukleären Zellen von einigen ml frisch gesammelten peripheren Blut isoliert erzeugen. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um gefrorene PBMCs (direkt aus dem Buffy-Coat) erhalten ein Detail erhebliche praktische Auswirkungen umzuprogrammieren bei der Nutzung Spenderzellen von einem entfernten Standort erworben werden. Vor der Induktion von Umprogrammierung muss isolierten PBMCs durchlaufen eine kritische Expansionsstufe, die einen gesunden proliferierenden Zellpopulation zugänglicher für nukleare Umprogrammierung rendert. Dies wird leicht durch das Vorhandensein von 'Weintraube-like "Clustern von Zellen bei Expansion in hämatopoetischen Kulturbedingungen beobachtet. Wenn weniger als 5x10 5 Zellen transduziert werden können Zellen auf ein oder zwei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit MEFs plattiert werden. Wir haben eine gewisse Variabilität in der erforderlichen Zeit HES-ähnliche Kolonien beobachtet erfahren, in einigen Fällen bis zu 25 Tage nach der Transduktion.Die Verwendung von ROCK-Inhibitor ist entscheidend für das Überleben und die Klonierungseffizienz auf Kommissionierung von Schwellenländern iPSC Kolonien zu verbessern. Bemerkenswert und im Gegensatz zu dem, was wir beobachtet, wenn Kommissionierung Kolonien von umprogrammiert Fibroblasten nahezu 100% abgeholt Kolonien von umprogrammiert PBMCs etablieren stabile iPSC Klone, die erweitert und kryokonserviert werden können. Schließlich glauben wir, dass die Einfachheit der Probenentnahme mit der hoch effizienten und konsistenten Umprogrammierung Ansatz kombiniert hierin beschrieben, stellen eine bona fide-Plattform für Anwendungen, in denen eine große Zahl von iPSC Klone müssen generiert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studien wurden zum Teil durch NIH UO1HL107443-01 Award GJM und GM finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
