Summary
Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.
Abstract
Dört transkripsiyon faktörleri, Oct4, Klf4 ve ektopik ekspresyonu ile, Sox2 ve cMyc, insan somatik hücre sözde indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSCs) 1-4 üreten, bir pluripotent durum için dönüştürülebilir. Hastaya özel iPSCs embriyonik kök hücreler (EKH) çevreleyen ve olası immün red baypas edecek etik kaygılar yoksundur. Böylece, iPSCs hastalığı modelleme çalışmaları, farmakolojik bileşikler tarama ve rejeneratif tedaviler 5 için oldukça dikkat çekmiştir.
Bu Yamanaka faktörler 6 kodlayan bir tek vergilendirilebilir polisistronik lentiviral Kök Hücre Kaseti (STEMCCA) kullanılarak farklı akciğer hastalıkları olan hastalardan alınan transgeni içermeyen insan iPSCs üretimi göstermiştir. Bu IPSC çizgiler deri fibroblastları, yeniden programlanması için en yaygın olarak kullanılan hücre tipinden elde edildi. Normal olarak, fibroblastlar elde hücrenin genişlemesi punch biyopsi ardından bir cilt gerektirirBirkaç pasajlar için kültür s. Önemli olarak, grup halinde iPSCs 7-9, insan periferik kan hücrelerinin yeniden programlanması bildirilmiştir. Bir çalışmada, STEMCCA vektörünün bir Tet indüklenebilir versiyon kan hücreleri eşzamanlı olarak ters tetrasiklin Transaktivatörü kodlayan bir yapısal olarak aktif lentivirüs ile enfekte edilmesi için gerekli olan, 9 kullanılmıştır. Fibroblastlar tersine, periferik kan hücrelerinin büyük ölçüde hastanın rahatsızlık ve sıkıntı azaltarak, minimal invazif yoluyla toplanabilir. Kurucu bir tek vergiye tabi vektör kullanarak kan hücreleri yeniden programlama için basit ve etkili bir protokol daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknolojisi uygulama hızlandırabilir. Bundan başka, periferal kan hücrelerinin yeniden programlanması deri biyopsileri kaçınılmalıdır (örn. Anormal yara) ya da bağlı olarak önceden var olan hastalık durumlannın preventi için gereken bireyler dan iPSCs üretilmesine olanak tanırpunch biyopsi için ng erişim.
Burada yapısal 4 faktörleri ifade eden bir tek floxed-vergiye tabi lentiviral vektörü kullanılarak periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) insan iPSCs üretimi için bir protokol göstermektedir. Yeni toplanmış ve çözülmüş olan PBMC STEMCCA lentivirüs ile transdük önce olduğu gibi ortam içeren askorbik asit, 10,11 tarif 9 gün, SCF, IGF-1, IL-3 ve EPO için genişletilir. Hücreler daha sonra MEFS üzerine kaplanır ve ESC gibi koloniler iki hafta sonra enfeksiyon canlandırılabilir. Son olarak, seçilen klonlar genişletildi ve pluripotency işaretleri SSEA-4, Tra-1-60 ve Tra-1-81 ekspresyonu açısından test edilmiştir. Bu protokol kan kolayca erişilebilir 4 ml insan iPSCs üretimi için güvenilir bir yöntem sağlayan, basit, güçlü ve son derece tutarlıdır.
Protocol
1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izolasyonu ve Genişletme
GÜN 0
- Sodyum sitrat içeren bir BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp içine periferik kan 4 ml çizin. Tüp 8-10 kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 30 dakika için 1800 x g'da santrifüjlenir. İdeal olarak, bu adımı toplama 2 saat içinde yapılmalıdır.
- Steril bir 15 ml konik santrifüj tüpüne buffy coat (jel bariyeri ve plazma arasındaki hücre tabakası) pipetleme mononükleer hücre (MH) toplayın. 15 dakika 300 x g santrifüj ile birkaç kez, invert steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 10 ml toplam hacmi getirmek.
- Steril PBS içinde 10 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve hücre sayımı ile yerine getirir. 10 dakika boyunca 300 xg'de steril 15 ml konik santrifüj tüpü ve santrifüj içine 1 2x10 6 hücre aktarın.
- Genişleme ortam, 2 ml (EM) (içinde tekrar süspansiyon hücreleri 50 ug / ml içeren Asco QBSF-60 Kök Hücre Ortarbic asit, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml, IGF-1, 1 uM Deksametazon ve 100 ug / ml primocin ya da% 1 pen / strep) ve aktarma bir iyi bir 12-kuyulu plakanın. % 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin.
- 300 x kalan hücreleri santrifüjleyin % 10 DMSO içeren FBS 10 dk ve donma ~ 2x10 6 hücre / flakon için g.
- PBMC kullanılarak dondurulmuş protokol başlamak için, 10 dakika boyunca 300 xg'de QBSF orta ve santrifüj 10 ml içine hücre 1 vial eritin. EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12-kuyulu plakanın iyi bir transfer. % 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin.
GÜN 3 ve 6. GÜN
- Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın.
- 10 dakika için 300 x g'da hücre santrifüjleyin.
- EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12 de bir transfer-Plaka. % 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin.
2. STEMCCA Lentivirus ile PBMC'ler ve İletimi
GÜN 9
- Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın.
- 10 dakika için 300 x g'da hücre santrifüjleyin.
- 5, ug / polybrene ve STEMCCA lentivirüs ml içeren taze EM, 1 ml hücre yeniden süspanse edin (MOI = 1-10) ve bir 12-kuyulu plakanın de bir transfer. (Lentiviral parçacıklarının üretim tarif protokol bulunabilir http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- 90 dakika için 25 ° C'da 2,250 rpm'de plaka Spin.
- Spin sonra, taze EM ilave 1 ml ekleyin ortam, 2 ml toplam olarak 5 ug / ml polybrene ihtiva eden ve 37 ° C de inkübe plaka,% 5 CO 2 inkübatör.
10. GÜN
- Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın.
- 10 dakika için 300 x g'da hücre santrifüjleyin.
- EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12-kuyulu plakanın 1 iyi transfer. % 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin.
3. Kaplama MEFS üzerine Hücreleri transdüklü
GÜN 11
- Coat 2x10 5 hücre az% 0.1 jelatin ve plaka inaktive fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) ile / iyi MEF orta (IMDM% 10 FBS,% 1 Temel Olmayan Amino Asitler içeren, 100 mcM β-bir 6-plaka kuyu merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 ug / ml primocin ya da% 1 Pen / Strep.) Infeksiyon başına 3 kuyu hazırlayın.
GÜN 12
- Bir steril 15 ml konik tüpe transfer hücreleri ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın.
- 10 ng / ml bFGF, ve askorbik asit ve EM kullanıldığı gibi aynı konsantrasyonlarda, büyüme faktörü içeren MEF orta 3 ml hücreler yeniden süspanse edin, orta (50 ug / ml Askorbik Asit, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml, IGF-1, 1 uM deksametazon).
- Levha 1 hücreleri ml başına iyi MEFS ihtiva eden bir 6-kuyulu plakanın. / Kuyu ortamı 2.5 ml toplam bFGF, askorbik asit ve büyüme faktörleri ile MEF ortam 1.5 ml ilave edilir.
- 25 500 rpm'de döndürme tabağı ° C'de 30 dakika süre ile. 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin.
GÜN 14
- 10 ng / ml bFGF ve 50 mg / ml Askorbik Asit (hiçbir büyüme faktörleri) içeren MEF medyanın 2,5 ml Yem hücrelerini her geçen gün. Aspire ve her besleme ile yüzen hücreler atın.
- Olarak (genellikle haftada bir kez) ihtiyaç duyulan ek MEFS ekleyin.
- Bir kez küçük koloniler yem hücreler insan embriyonik kök hücre (hESC) orta (DMEM/F12 içeren% 20 Knockout Serum Değiştirme,% 1 Temel Olmayan Amino Asitler, 100 mcM β-merkaptoetanol, 2 mM L-Glutamine 2 ml ile günlük, görünür , 100 ug / ml primocin ya da% 1 Pen / Strep ve 10 ng / ml bFGF).
4. Toplama ve IPSC Klonların Genişletme
~ GÜN 30 - 40
- 12-plaka inaktive MEFS / iyi hESC orta 1 ml artı Stemolecule Y27632 (ROCK inhibitörü) 10 uM içeren önceden seeded bireysel kuyularda her koloni seçin.
- Yalnızca hESC orta (hayır ROCK inhibitörü) 1 ml bundan sonra günlük hücreleri besleyin.
5. Pluripotency Markers için İmmünofloresan Boyama
- Boyama Millipore gelen kit "ES Hücre Marker örnek Kiti" kullanılarak ve üreticinin protokolü takip yapıldı.
6. INTEG eksizyonunominal STEMCCA Vektör
- Kaset yeniden programlanması eksizyonu Kre-IRES-Puro ifade vektörü ve transfeksiyon sonrasında 6 tarif edildiği gibi kısa puromisin seçim kullanılarak elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek bir lentiviral vektörü kullanılarak, insan PBMC'leri iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Şekil 1A protokol şematik bir temsilini gösterir. Kan BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp sodyum sitrat ile toplanır ve santrifüj sonrasında, mononükleer hücreler polyester jel ve plazma (buffy coat) (Şekil 1B) arasındaki arayüz alınabilir. İzole PBMC'ler sonra 9 gün boyunca kültürü yayılmaktadır. Şekil 2 hücreleri belirgin bölünmesi olduğunu gösteren, 0. gün ve günde 9 PBMC'ler karşılaştırır. STEMCCA lentivirüs ile yaklaşık 10-15 gün sonrası transdüksiyon, küçük parlak kolonilerin görünümü hala tanımlanmamış koloni morfolojisi ile izlenmektedir. HESC orta ilavesinden sonra, hESC gibi koloniler kolaylıkla (Şekil 2B) tespit edilebilir. Bu kolonilerin bazıları mekanik aldı genişletilmiş ve karakterizeBu tür SSEA-4, Tra-1-60 ve Tic-1-81 (Şekil 3) gibi pluripotency markırlerinin için. Kısaca puromisin seçim yaklaşımı 6 kullanarak, Şekil 4'te gösterildiği gibi sürekli transgen ücretsiz IPSC klonlar elde edebiliyoruz.
Şekil 1. Periferik kandan insan iPSCs Üretimi. STEMCCA vektörü kullanılarak periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) insan iPSCs üretmek için kullanılan protokol A) şematik gösterimi. EM: Genişleme Orta; GF: Büyüme Faktörleri; RBC: Kırmızı Kan Hücreleri; MEF: Fare Embriyonik Fibroblast; hESC: İnsan Embriyonik Kök Hücre B) BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp sodyum tam kan toplanması için kullanılan sitrat ve ayırma ile. mononükleer hücrelerin. Jel bariyeri t ayrıldığında ayrılık santrifüjleme sırasında oluşuryoğun kan bileşenleri o mononükleer hücreler ve plazma. Santrifüj sonra, mononükleer hücreler ve trombositler sadece plazma tabakasının altında bir beyazımsı tabaka (buffy coat) izole edilebilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Protokol boyunca hücrelerin morfolojik değişikliklerin Örnek görüntüler. A) Gün 0: mononükleer hücreler periferik kandan izole edilen ve genişleme ortam içinde kültürlenmiştir. . 20x büyütme B) GÜN 9: 9 gün boyunca kültür genişleme sonrasında, hücrelerin 'demet üzüm-benzeri' kümeler hücrelerinin sağlıklı olduğunu düşündüren ve transduced önce çoğalan (oklar) görülmektedir. 20x büyütme C) GÜN 20:. Koloni oluşumu bir hafta ce sonrasında gözlenenlls MEFS üzerine kaplanır. 10x büyütme D) GÜN 30:. IPSC kolonileri tipik morfoloji gösteren ve toplama ve genişleme için hazır hESC gibi. 4x büyütme.
Şekil 3,. Kan üretilen insan iPSCs karakterizasyonu. Pluripotency belirteçler SSEA-4, Tra-1-60 ve Tic-1-81 ekspresyonu gösteren PBMC'ler elde iPSCs immünofloresan analizi. IPSCs da Alkalin Fosfataz (Alk Phos) için pozitif leke.
Şekil 4. Transgeni içermeyen iPSCs üretilmesi. IPSCs bir plasmid ile transfekte edilircoexpressing Cre rekombinaz ve bir puromisin-direnç geni gibi Somers ve diğerleri, 2010 içinde tanımlanmıştır. A) iPSCs transfeksiyondan önce. b) Hücre ölümü puromisin seçme C arasında iki gün sonra gözlenmiştir) Yeni transfeksiyon koloniler 10 gün sonra çevresinde dirençli hücrelerin ortaya . D) Bazı koloniler toplandı ve genişletilmiş ve Southern Blot transgen eksizyonu onaylamak için yapılır edilir. 1, 3, 5 ve 7: IPSC klonlar eksizyon önce, 2, 4, 6 ve 8: IPSC klonlar çıkarma sonrası. 4x büyütme tüm faz kontrast görüntüler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, yeni toplanmış periferik kan birkaç mililitre izole edilen mononükleer hücreler insan iPSCs oluşturmak için STEMCCA lentiviral vektörünün kullanımı açıklanmaktadır. Protokol ayrıca uzak bir yerde alınan verici hücreleri kullanılarak, dondurulmuş zaman PBMC'ler (buffy coat doğrudan elde), önemli pratik etkileri bir ayrıntı yeniden programlanması için de kullanılabilir. Yeniden programlama indüksiyonundan önce izole PBMC'ler nükleer reprogramming daha makul hücrelerin sağlıklı çoğalan nüfus kılan kritik bir genişleme adım geçmelidir. Bu kolayca hematopoietik kültür koşullarında büyüme üzerine hücre kümeleri "üzüm gibi bir demet 'varlığı ile gözlenmiştir. En az 5x10 5 hücre transdük zaman, hücreler MEFS ihtiva eden bir 6-plaka, bir veya iki kuyu üzerine kaplanmış olabilir. Biz 25 gün sonrası transdüksiyonu ile bazı durumlarda, hESC gibi koloniler gözlemlemek için gerekli zaman içinde bir değişkenlik yukarı meydana gelmiştir.ROCK inhibitörü kullanımı gelişmekte IPSC kolonilerin toplama üzerine hayatta kalma ve klonlama verimliliği artırmak için önemlidir. Dikkate değer ve reprogrammed fibroblastlardan koloniler, genişletilmiş ve kriyoprezerve edilebilir kararlı IPSC klonları oluşturması reprogrammed PBMC'ler çekilen kolonilerinin neredeyse% 100 seçerken biz ne gözlenen aksine. Son olarak, son derece verimli ve tutarlı yeniden programlanması yaklaşım ile kombine numune toplama basitlik tarifnamede, IPSC klon çok sayıda elde edilmesi için gereken uygulamalar için iyi niyetli platformu temsil tarif inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmalar GJM ve GM NIH UO1HL107443-01 Ödülü tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
