Summary
这里，我们表明一个简单而有效的协议，用于从外周血3-4毫升，使用一个单一的慢病毒重新编程矢量代人类iPSCs。现成的血细胞重新编程的承诺，加快利用IPSC的技术，使其接触到更广泛的研究团体。
Abstract
通过四个转录因子，即Oct4，Klf4导入正常的异位表达，Sox2和cMyc，人的体细胞可以被转换到多能干状态，产生所谓的诱导多能干细胞（iPS细胞）1-4。特定病人的iPS细胞缺乏的伦理问题，围绕胚胎干细胞（ES细胞），并会绕过可能的免疫排斥反应。因此，iPS细胞疾病模型研究，药效成分的筛选和再生疗法5，已经引起相当大的关注。
我们已经证实了代转基因人类iPSCs从不同的肺部疾病的患者使用一个单一的应纳税多顺反子慢干细胞盒式录音带（STEMCCA）的编码山因素6。这些的IPSC的线产生的皮肤成纤维细胞中，最常见的用于重新编程的细胞类型。通常情况下，获得成纤维细胞，需要皮肤活检冲头，然后通过细胞的膨胀秒，文化几段。更重要的是，若干组报道人外周血细胞的重新编程到iPSCs的7-9。在一项研究中，采用的TET诱导版本的STEMCCA载体9，这需要同时感染的血细胞组成性激活的慢病毒编码的逆四环素反式激活。与成纤维细胞，外周血细胞可以收集通过微创手术，大大减少了病人的不适和痛苦的。一个简单而有效的协议可能会加速血细胞重新编程的一个组成单应纳税载体IPSC的技术应用到更广泛的研究。此外，外周血细胞重新编程，允许从个人产生的iPS细胞在皮肤活检应该是可以避免的（ 即 。异常疤痕），或由于预先存在的疾病状况preventi纳克冲的活组织切片检查。
在这里，我们展示了一个协议，用于人类iPSCs从外周血单核细胞（PBMCs）使用一个单一的两侧装接loxP的消费税慢病毒载体的组成型表达的4个因子的产生。被用的STEMCCA慢病毒转导之前，新鲜收集的或解冻的外周血单个核细胞被扩展为9，10,11天的描述在介质中含有抗坏血酸，SCF，IGF-1，IL-3和EPO。然后将细胞培养皿上MEFs和感染两周后，可以可视化ESC样集落。最后，所选的克隆被扩展和测试的多能性干细胞标记SSEA-4，TRA-1-60和Tra-1-81的表达。该协议是简单的，鲁棒的和高度一致，提供了一个可靠的方法用于产生人类iPSCs从易于接触的4毫升血液。
Protocol
1。外周血单个核细胞（PBMC）的分离和扩展
0天
- 画出4毫升外周血的BD真空采血管CPT细胞下游管与柠檬酸钠。倒置管8至10倍，并在1,800 xg离心30分钟，在室温下离心。在理想的情况下，这一步应在采集后2小时内完成。
- 收集的单核细胞（MCs），通过移液到一个无菌的15毫升锥形离心管中的血沉棕黄层（小区凝胶屏障和血浆层之间）。到10毫升，用无菌磷酸盐缓冲的盐水（PBS），将总体积，倒置几次并在300×g离心15分钟离心。
- 重悬在10毫升无菌PBS中的细胞，并进行细胞计数。 1至2×10 6个细胞转移到一个无菌的15毫升锥形离心管中，并在300×g离心10分钟离心。
- 重悬细胞的膨胀介质在2毫升（EM）（QBSF-60干细胞培养基含有50微克/毫升阿斯科40毫微克/毫升50毫微克/毫升SCF，山梨酸，10 ng / ml的IL-3，2 U / ml的EPO，IGF-1，1μM地塞米松和100微克/毫升primocin的1％青/链霉素），并转移到一个孔的12孔板中。孵育的细胞中，在37℃下，5％CO 2培养箱中。
- 离心剩余的细胞在300× 克并冷冻10分钟〜2×10 6个细胞/ FBS的含10％DMSO的样品瓶。
- 要启动协议冻结的外周血单个核细胞，细胞解冻1瓶10毫升QBSF介质和离心机，在300×g离心10分钟。在2ml的EM和重悬细胞，转移到12孔板的一个阱。孵育的细胞中，在37℃下，5％CO 2培养箱中。
3天，第6天
- 将细胞转移到无菌的15毫升锥形管和洗一次的QBSF-60干细胞中等至收集贴壁细胞用1ml。
- 离心细胞在300×g离心10分钟。
- 在2ml的EM和重悬细胞，以及一个12转移到一个孔板中。孵育的细胞中，在37℃下，5％CO 2培养箱中。
2。与STEMCCA慢病毒转导对外周血单核细胞（PBMC）
第九天
- 将细胞转移到无菌的15毫升锥形管和洗一次的QBSF-60干细胞中等至收集贴壁细胞用1ml。
- 离心细胞在300×g离心10分钟。
- 细胞重悬在1毫升含5微克/毫升的聚凝胺和STEMCCA慢病毒新鲜EM（MOI = 1到10）和转移到12孔板的一个孔。 （慢病毒颗粒的协议描述生产可以发现在http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/的 ）
- 旋转板上，在2250转速在25℃下90分钟。
- 分拆后，添加一个额外的1毫升的新鲜EM 2毫升培养基共孵育的板在37℃的含5微克/毫升的聚凝胺（polybrene），5％CO 2培养箱中。
10天
- 将细胞转移到无菌的15毫升锥形管和洗一次的QBSF-60干细胞中等至收集贴壁细胞用1ml。
- 离心细胞在300×g离心10分钟。
- 在2ml的EM和重悬细胞，转移到1井的12孔板。孵育的细胞中，在37℃下，5％CO 2培养箱中。
3。电镀转染细胞上的MEF
第11天
- 涂在6孔板的孔中有0.1％明胶和板灭活小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）为2×10 5个细胞/孔在MEF培养基（IMDM中含有10％FBS，1％非必需氨基酸，100μM的β-巯基乙醇，2mM的L-谷氨酰胺，100微克/毫升primocin或1％青/链霉素）。准备感染每3个井。
12天
- 将细胞转移到无菌的15毫升锥形管洗井一次的QBSF-60干细胞中等至收集贴壁细胞，用1ml。
- 重悬细胞的MEF培养基中含有10纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子，和抗坏血酸和在相同浓度的生长因子，如使用在EM在3ml培养基（50μg/ ml的抗坏血酸，50 ng / ml的SCF，10 ng / ml的IL -3，2 U / ml的促红细胞生成素，40 ng / ml的IGF-1，1μM地塞米松）。
- 板1毫升细胞每孔的6孔板中，含有的MEF。共2.5毫升/孔的介质，添加1.5毫升的MEF媒体，抗坏血酸，碱性成纤维细胞生长因子和生长因子。
- 旋转板在500rpm下在25℃下30分钟。板在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。
14天
- 饲料细胞每隔一天用2.5毫升含有10 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和50μg/ ml的抗坏血酸（无生长因子）的MEF媒体。每个饲料漂浮的细胞吸出并丢弃。
- 添加额外的MEF中，根据需要（通常每周一次）。
- 一旦小群出现，饲料的细胞每天用2毫升的人类胚胎干细胞（hESC）培养基（DMEM/F12含20％淘汰赛血清替代物，1％非必需氨基酸，100μM的β-巯基乙醇，2毫米L-谷氨酰胺，100微克/毫升primocin或1％青/链霉素和10 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子）。
4。采摘的IPSC的克隆和扩展
〜30天 - 40
- 拾取每个菌落预先接种含有1毫升/孔的胚胎干细胞介质中加10μMY27632（ROCK抑制剂）Stemolecule与灭活的MEF的12孔板在个别井。
- 此后每天饲料细胞的胚胎干细胞培养基（无ROCK抑制剂）与1毫升。
5。多能性标记免疫荧光染色法
- 使用工具包“ES细胞标记物样品套件”自Millipore，并按照制造商的协议进行染色。
6。切除INTEG的额定STEMCCA向量
- 切除磁带重新编程实现，利用一个酶Cre-IRES-PURO表达载体，转染后的和短暂的嘌呤霉素筛选的说明6。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们展示了一个简单而有效的协议，用于人类iPSCs从使用一个单一的慢病毒载体的外周血单个核细胞的产生。 图1A示出了示意性表示的协议。血液被收集到的BD真空采血管CPT细胞下游管与柠檬酸钠，和单核细胞，离心后，可以收集到的聚酯凝胶和血浆（血沉棕黄层）（ 图1B）之间的界面。然后将分离的外周血单个核细胞扩大培养9天。 图2比较了在第0天，第9天的外周血单个核细胞，示出细胞明显分割。约10-15天，后转导的STEMCCA慢，外观明亮的小殖民地，菌落形态仍然不确定。胚胎干细胞培养基的添加之后，可以很容易地确定的（ 图2D）胚胎干细胞样集落。这些殖民地的一些机械采摘，扩大和特点如SSEA-4，TRA-1-60和Tra-1-81（ 图3）的多能性标志物的表达。使用一个简短的嘌呤霉素选择方法6中 ，我们能够始终如一地得到，如在图4中示出的转基因-自由IPSC的克隆。
图1。从外周血人类iPSCs的生成。 A）的协议，用于生成人类iPSCs从外周血单个核细胞（PBMC）使用的STEMCCA的矢量的示意图。 EM：扩张中，GF：生长因子; RBC：红细胞; MEF：小鼠胚胎成纤维细胞的人类胚胎干细胞：胚胎干细胞，B）BD真空采血管CPT细胞制备柠檬酸钠用于全血的收集和分离管的单核细胞。发生分离时，在离心过程中的凝胶屏障分隔吨他的单核细胞和血浆从致密的血液成分。离心后，单核细胞和血小板可以从一个白色层（棕黄色外套）下的等离子层隔离。 点击这里查看大图 。
图2。整个协议的细胞的形态变化的代表图像。 A）DAY 0：单核细胞中分离从外周血和培养的膨胀介质。 20倍的放大倍率。B）第9天：在为期9天的文化扩张后，“一串葡萄状的细胞群（箭头）的细胞是健康的，前转和增殖。 20倍的放大倍率。C）第20天：观察细胞集落形成一个星期后，行政长官会同行政LLS镀上MEF中。 10倍的放大倍率。D）第30天：人类胚胎干细胞iPSC的殖民地一样表现出典型的形态，准备采摘和扩展。 4倍的放大倍率。
图3。从血液中产生的人类iPSCs表征。示出的多能性干细胞标记SSEA-4，TRA-1-60和Tra-1-81的表达的外周血单个核细胞产生的iPS细胞的免疫荧光分析。 iPS细胞也染色阳性碱性磷酸酶（ALK PHOS）。
图4。代的转基因-自由iPSCs的。iPSCs的被转染的质粒共表达Cre重组酶和嘌呤霉素抗性基因，萨默斯等人 ，2010）iPS细胞转染前B）观察到细胞死亡后两天的嘌呤选择C）出现新的殖民地，从耐药细胞转染后10天左右D）一些殖民地挑选和扩大，并进行Southern blot检测，以确认切除的转基因。 1，3，5，7：iPSC的克隆前切除术，2，4，6，8：iPSC的克隆切除后。在所有的相衬图像放大4倍。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们在此描述的STEMCCA慢病毒载体的使用，以产生从几毫升的新鲜收集的外周血单核细胞分离的人类iPSCs。协议也可以用于利用从一个遥远的位置获得的供体细胞重编程冷冻的外周血单个核细胞（直接得自血沉棕黄层）时，显着的实际影响的细节的。分离的外周血单个核细胞重编程诱导前，必须经过一个关键的扩展步骤，使一个健康的增殖人口更适合核重编程的细胞。由'膨胀时在造血的培养条件下的一串葡萄状的细胞群的存在，这是很容易观察。当小于5×10 5个细胞的转导，细胞可以被镀到一个或两个井的6孔板中，含有的MEF。我们经历了一些变化所需的时间来观察人类胚胎干细胞样集落，在某些情况下，以25天转导。ROCK抑制剂的使用是关键的，以提高生存与拾取时的新兴IPSC的菌落克隆效率。值得注意的是，我们观察到采摘时重新编程成纤维细胞的克隆，几乎100％的IPSC的，可扩展的克隆和冷冻建立稳定的外周血单个核细胞重新编程的挑菌落。最后，我们认为，本文描述的简单高效的和一致的重新编程方法结合的样本集合，代表一个真正的平台的应用中，需要产生大量IPSC的克隆。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这些研究的部分经费由美国国立卫生研究院UO1HL107443-01奖，郭敬明和GM。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
