Summary
Her viser vi en enkel og effektiv protokol til generering af humane iPSCs 3-4 ml perifert blod under anvendelse af en enkelt lentiviral omprogrammering vektor. Omprogrammering af let tilgængelige blodlegemer lover at fremskynde udnyttelsen af IPSC teknologi ved at gøre det tilgængeligt for et bredere forskningsmiljø.
Abstract
Ved ektopisk ekspression af fire transkriptionsfaktorer, Oct4, Klf4,, Sox2 og cMyc kan humane somatiske celler omdannes til en pluripotent tilstand, genererer såkaldte induceret pluripotente stamceller (iPSCs) 1-4. Patient-specifikke iPSCs mangler de etiske bekymringer, der omgiver embryonale stamceller (ESC) og ville omgå eventuel immunafstødning. Således har iPSCs tiltrukket sig betydelig opmærksomhed for sygdom modelundersøgelser, screening af farmakologiske forbindelser, og regenerative terapier 5.
Vi har vist dannelsen af transgen-free humane iPSCs fra patienter med forskellige lungesygdomme anvendelse af en enkelt udskæres polycistronisk lentiviral Stem Cell Kassette (STEMCCA) koder for Yamanaka faktorer 6. Disse IPSC linjer blev genereret fra hudfibroblaster, den mest almindelige celle type, der anvendes til omprogrammering. Normalt opnåelse af fibroblaster kræver skin punch biopsi efterfulgt af ekspansion af cellens i kultur for et par passager. Vigtigere, har en række grupper rapporteret omprogrammering af humane perifere blodceller i iPSCs 7-9. I én undersøgelse blev en Tet-inducerbar version af STEMCCA vektoren anvendes 9, som kræves for blodlegemer at blive samtidigt inficeret med en grundlæggende aktiv lentivirus koder for revers tetracyclin transaktivator. I modsætning til fibroblaster, kan perifere blodlegemer indsamles via minimalt invasive procedurer, hvilket reducerer ubehag og lidelse for patienten. En enkel og effektiv protokol til omprogrammering blodlegemer ved hjælp af en konstitutiv enkelt punktafgifter vektor kan fremskynde anvendelsen af IPSC teknologi ved at gøre det tilgængeligt for et bredere forskningsmiljø. Endvidere omprogrammering af perifere blodceller giver mulighed for generering af iPSCs fra individer, hvor hudbiopsier bør undgås (dvs.. Aberrant ardannelse), eller på grund af allerede eksisterende sygdomstilstande forebyggelse af,ng adgang til punch biopsier.
Her viser vi en protokol til generering af humane iPSCs fra perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) ved hjælp af en enkelt floxet-udskæres lentiviral vector konstitutivt udtrykker de 4 faktorer. Nyligt opsamlede eller optøet PBMC'er ekspanderes i 9 dage som beskrevet 10,11 i medium indeholdende ascorbinsyre, SCF, IGF-1, IL-3 og EPO før det transduceret med STEMCCA lentivirus. Celler bliver så udpladet på MEF'er og ESC-lignende kolonier kan visualiseres to uger efter infektion. Endelig er udvalgte kloner ekspanderes og testes til ekspression af de pluripotency markører SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81. Denne protokol er enkel, robust og meget konsistent, hvilket giver en pålidelig metode til generering af humane iPSCs fra let tilgængelige 4 ml blod.
Protocol
1. Isolering og udvidelse af perifere mononucleære blodceller (PBMC'er)
Dag 0
- Hæld 4 ml perifert blod til en BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube med natriumcitrat. Vend røret 8 til 10 gange og centrifugeres ved 1.800 x g i 30 minutter ved stuetemperatur. Ideelt set bør dette skridt ske inden 2 timer efter prøvetagning.
- Indsamle de mononukleære celler (MC'er) ved pipettering af buffy coat (cellelag mellem gelbarriere og plasma) i en steril 15 ml konisk centrifugerør. Bring samlet volumen på 10 ml med sterilt phosphatpufret saltvand (PBS), invertsukker flere gange og centrifugeres ved 300 xg i 15 minutter.
- Cellerne resuspenderes i 10 ml sterilt PBS og udføre celletal. Overfør 1 til 2x10 6 celler til et sterilt 15 ml konisk centrifugerør og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter.
- Cellerne resuspenderes i 2 ml ekspansion medium (EM) (QBSF-60 Stem Cell Medium indeholdende 50 ug / ml Ascorbic Acid, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM dexamethason og 100 ug / ml primocin eller 1% Pen / Strep) og overføres til en brønd i en plade med 12 brønde. Inkubér cellerne i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Centrifuge resterende celler ved 300 x g i 10 minutter og fryse ~ 2x10 6 celler / hætteglas i FBS indeholdende 10% DMSO.
- At starte protokollen med frosne PBMC'er, tø 1 hætteglas med celler i 10 ml QBSF medium og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter. Cellerne resuspenderes i 2 ml EM og overføres til en brønd i en plade med 12 brønde. Inkubér cellerne i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
Dag 3 og Dag 6
- Overføre cellerne til et sterilt 15 ml konisk rør og vaskes brønden en gang med 1 ml QBSF-60 stamcellemedium at indsamle adhærente celler.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 10 minutter.
- Cellerne resuspenderes i 2 ml EM og overføres til en brønd af en 12-Brønds plade. Inkubér cellerne i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
2. Transduktion af PBMC'er med STEMCCA lentivirus
DAG 9
- Overføre cellerne til et sterilt 15 ml konisk rør og vaskes brønden en gang med 1 ml QBSF-60 stamcellemedium at indsamle adhærente celler.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 10 minutter.
- Cellerne resuspenderes i 1 ml frisk EM indeholdende 5 ug / ml polybren og STEMCCA lentivirus (MOI = 1 til 10) og overføres til en brønd i en plade med 12 brønde. (Den protokol, der beskriver produktionen af lentivirale partikler kan findes på http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Spin pladen ved 2250 rpm ved 25 ° C i 90 minutter.
- Efter spin, tilføje en ekstra 1 ml af friske EM indeholdende 5 ug / ml polybren i alt 2 ml medium og inkubere pladen i en 37 ° C,5% CO2 inkubator.
DAG 10
- Overføre cellerne til et sterilt 15 ml konisk rør og vaskes brønden en gang med 1 ml QBSF-60 stamcellemedium at indsamle adhærente celler.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 10 minutter.
- Cellerne resuspenderes i 2 ml EM og overføres til en brønd i en plade med 12 brønde. Inkubér cellerne i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
3. Udpladning transducerede celler på MEF'er
DAG 11
- Coate brøndene i en 6-brønds plade med 0,1% gelatine og plade inaktiverede muse embryonale fibroblaster (MEF) ved 2x10 5 celler / brønd i MEF medium (IMDM indeholdende 10% FBS, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 100 uM β- mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin, 100 ug / ml primocin eller 1% Pen / Strep). Fremstilles 3 brønde pr infektion.
DAG 12
- Overføre cellerne til et sterilt 15 ml konisk rør og vaske brønden en gang med 1 ml QBSF-60 stamcellemedium at indsamle adhærente celler.
- Cellerne resuspenderes i 3 ml MEF medium indeholdende 10 ng / ml bFGF og ascorbinsyre og vækstfaktorer i samme koncentrationer som anvendt i EM-medium (50 ug / ml ascorbinsyre, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM dexamethason).
- Plade 1 ml celler per brønd i en 6-brønds plade indeholdende MEF'er. Tilsættes 1,5 ml MEF medier med bFGF, ascorbinsyre og vækstfaktorer til i alt 2,5 ml medium / brønd.
- Spin pladen ved 500 rpm ved 25 ° C i 30 minutter. Inkubér pladen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
DAG 14
- Feed-celler hver anden dag med 2,5 ml MEF medium indeholdende 10 ng / ml bFGF og 50 ug / ml ascorbinsyre (ingen vækstfaktorer). Aspirer og kassér flydende celler med hvert feed.
- Tilføj yderligere MEF'er efter behov (normalt en gang om ugen).
- Når små kolonier vises, foder celler dagligt med 2 ml humane embryonale stamceller (hESC) medium (DMEM/F12 indeholdende 20% Knockout Serum erstatning, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 100 uM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin , 100 ug / ml primocin eller 1% Pen / Strep og 10 ng / ml bFGF).
4. Picking og Udvidelse af IPSC Clones
~ DAG 30 til 40
- Pick hver koloni i individuelle brønde i en plade med 12 brønde forud podet med inaktiveret MEF'er indeholdende 1 ml / brønd af hESC medium plus 10 pM af Stemolecule Y27632 (ROCK-inhibitor).
- Foder celler dagligt derefter med 1 ml hESC medium alene (ingen ROCK inhibitor).
5. Immunfluorescensfarvning for pluripotency Markers
- Farvning blev udført under anvendelse af kittet "ES cellemarkør Sample Kit" fra Millipore og følge fabrikantens protokol.
6. Excision af integrated STEMCCA Vector
- Excision af omprogrammering kassette opnås ved anvendelse af en Cre-IRES-Puro udtrykker vektor efter transfektion og korte Puromycin udvælgelse som beskrevet 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser en enkel og effektiv protokol til generering af humane iPSCs fra PBMCer ved hjælp af en enkelt lentiviral vector. Figur 1A viser en skematisk repræsentation af protokollen. Blodet opsamles i en BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube med natriumcitrat, og efter centrifugering, kan mononukleære celler opsamlet fra grænsefladen mellem polyester gelen og plasmaet (buffy coat) (figur 1B). De isolerede PBMC'er derefter ekspanderes i kultur i 9 dage. Figur 2 sammenligner PBMC'er på dag 0 og dag 9, hvilket viser, at cellerne mærkbart er dividere. Ca. 10-15 dage efter transduktion med STEMCCA lentivirus, er fremkomsten af små lyse kolonier observeret, med endnu udefineret kolonimorfologi. Efter tilsætningen af hESC medium, kan hESC-lignende kolonier let at identificere (figur 2D). Nogle af disse kolonier er mekanisk plukket, udvides og karakteriserettil ekspression af pluripotency markører, såsom SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81 (Figur 3). Anvendelse af en kort Puromycin selection strategi 6, er vi i stand til konsekvent at opnå transgen-free IPSC kloner som afbildet i fig. 4.
Figur 1. Generering af humane iPSCs fra perifert blod. A) Skematisk fremstilling af den protokol, der anvendes til at generere humane iPSCs fra perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) ved hjælp af STEMCCA vektoren. EM: Expansion Medium, GF: vækstfaktorer; RBC: røde blodlegemer, MEF: muse embryonale fibroblast, hESC: humane embryonale stamceller B) BD Vacutainer CPT Cell Forberedelse Tube med natriumcitrat anvendes til indsamling af fuldblod og adskillelsen. af mononukleære celler. Separationen forekommer under centrifugering når gelen barriere adskiller than mononukleære celler og plasma fra de tættere blodkomponenter. Efter centrifugering kan mononukleære celler og blodplader isoleres fra en hvidlig lag (buffy coat) lige under plasmalaget. se større tal .
Figur 2. Repræsentative billeder af morfologiske ændringer af cellerne gennem hele protokollen. A) Dag 0: mononukleare celler isoleres fra perifert blod og dyrkes i ekspansionsmedium. . 20x forstørrelse B) Dag 9: efter ekspansion i kultur i 9 dage, er 'klase vindruer-lignende' klynger af celler observeret (pile) tyder på, at cellerne er sunde og breder sig, før de transduceret. 20x forstørrelse C) Dag 20:. Kolonidannelse ses en uge efter ceLLS er udpladet på MEF'er. 10x forstørrelse D) Dag 30:. HESC-lignende IPSC kolonier viser typiske morfologi og er klar til plukning og ekspansion. 4x forstørrelse.
Figur 3. Karakterisering af humane iPSCs genereret fra blodet. Immunofluorescensanalyse af iPSCs genereret fra PBMC'er som viser ekspressionen af de pluripotency markører SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81. De iPSCs også farvet positive for alkalisk phosphatase (Alk Phos).
Figur 4. Generering af transgen-free iPSCs. IPSCs transficeres med et plasmidco-udtrykke Cre-rekombinase og en puromycin-resistens-gen, som beskrevet i Somers et al, 2010. A) iPSCs før transfektion. B) Celledød observeres efter to dage med puromycin selection C) Nye kolonier komme ud af resistente celler omkring 10 dage efter transfektion . D) Nogle kolonier udtages og udvides, og Southern Blot udføres for at bekræfte udskæring af transgenet. 1, 3, 5 og 7: IPSC kloner før udskæring, 2, 4, 6 og 8: IPSC kloner efter udskæring. Alle fasekontrast billeder på 4x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi heri beskriver anvendelsen af STEMCCA lentivirusvektoren at generere humane iPSCs fra mononukleære celler isoleret fra nogle få ml frisk indsamlet perifert blod. Protokollen kan også anvendes til at omprogrammere frosne PBMC'er (opnået direkte fra buffy coat), en detalje af betydelige praktiske implikationer ved anvendelse af donorceller erhvervet fra en fjern beliggenhed. Før induktion af omprogrammering, skal isolerede PBMC'er undergår en kritisk udvidelse skridt, der gør en sund prolifererende population af celler mere modtagelige for nuklear omprogrammering. Dette kan let observeres ved tilstedeværelsen af klynge af druer-lignende "klynger af celler ved ekspansion i hæmatopoietiske dyrkningsbetingelser. Når mindre end 5x10 5 celler transduceres, kan celler udpladet på en eller to brønde i en 6-brønds plade indeholdende MEF'er. Vi har oplevet en vis variabilitet i den nødvendige tid til at observere hESC-lignende kolonier, i nogle tilfælde op til 25 dage efter transduktion.Anvendelsen af ROCK-inhibitor er kritisk for at øge overlevelse og klondannelseseffektivitet ved plukning af nye IPSC kolonier. Bemærkelsesværdigt og i modsætning til, hvad vi har observeret, når picking kolonier fra omprogrammerede fibroblaster, næsten 100% af plukket kolonier fra omprogrammerede PBMC'er etablere stabile IPSC kloner, der kan udvides og kryokonserveres. Endelig mener vi, at enkeltheden af samlingen af prøver kombineret med den meget effektiv og konsekvent omprogrammering fremgangsmåde beskrevet heri, repræsenterer en bona fide platform til anvendelser, hvor et stort antal IPSC kloner skal genereres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Disse undersøgelser blev finansieret delvist af NIH UO1HL107443-01 Award til GJM og GM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
