Summary
Her vi viser en enkel og effektiv protokoll for generering av humane iPSCs 3-4 ml perifert blod ved hjelp av en enkelt lentiviral omprogrammering vektor. Omprogrammering av lett tilgjengelige blodceller lover å akselerere bruken av IPSC teknologi ved å gjøre det tilgjengelig for et bredere forskningsmiljø.
Abstract
Gjennom ektopisk uttrykk av fire transkripsjonsfaktorer, Oct4, Klf4, Sox2 og cMyc, kan menneskelige somatiske celler bli konvertert til en pluripotent tilstand, genererer såkalte induserte pluripotente stamceller (iPSCs) 1-4. Pasient-spesifikke iPSCs mangler etiske bekymringer som omgir embryonale stamceller (ESCs) og ville hoppe mulig immun avvisning. Dermed har iPSCs vakt betydelig oppmerksomhet for sykdom modellering studier, screening av farmakologiske stoffer, og regenerative terapier 5.
Vi har vist generering av transgene-frie mennesker iPSCs fra pasienter med ulike lungesykdommer hjelp av en enkelt excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Kassett (STEMCCA) koding Yamanaka faktorene 6. Disse IPSC linjer ble generert fra hudfibroblaster, den vanligste celletype som brukes for omprogrammering. Normalt, skaffe fibroblaster trenger en hud punch biopsi etterfulgt av ekspansjon av cellens i kultur for noen passasjer. Viktigere, har en rekke grupper rapporterte omprogrammering av humant perifert blod celler til iPSCs 7-9. I en studie ble en Tet induserbar versjon av STEMCCA vektor ansatt 9, som krevde blodcellene til å bli samtidig infisert med en konstitutivt aktiv lentivirus koder for revers tetracyklin transactivator. I motsetning til fibroblaster, kan perifere blodceller samles via minimalt invasive prosedyrer, sterkt redusere ubehag og nød av pasienten. En enkel og effektiv protokoll for omprogrammering blodceller ved hjelp av en konstituerende enkelt excisable vektor kan akselerere bruken av IPSC teknologi ved å gjøre det tilgjengelig for et bredere forskningsmiljø. Videre omprogrammering av perifere blodceller tillater generering av iPSCs fra enkeltpersoner som hud biopsier bør unngås (ie. Avvikende arrdannelse) eller på grunn av pre-eksisterende sykdomstilstander preventing tilgang til punch biopsi.
Her viser vi en protokoll for generering av menneskelige iPSCs fra perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved hjelp av en enkelt floxed-excisable lentiviral vektor konstitutivt uttrykker de 4 faktorene. Fersk eller tint PBMC er utvidet for 9 dager som beskrevet 10,11 i medium som inneholder askorbinsyre, SCF, IGF-1, IL-3 og EPO før de transduced med STEMCCA lentivirus. Cellene blir deretter platet ut på MEFs og ESC-lignende kolonier kan visualiseres to uker etter infeksjon. Endelig er utvalgte kloner utvidet og testet for ekspresjon av de pluripotency markører SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81. Denne protokollen er enkel, robust og svært konsistent, og gir en pålitelig metode for generering av humane iPSCs fra lett tilgjengelig 4 ml blod.
Protocol
1. Isolasjon og utvidelse av perifere mononukleære blodceller (PBMC)
Dag 0
- Tegn 4 ml perifert blod inn i en BD Vacutainer CPT celleforberedelsen Tube med natriumsitrat. Snu røret 8 til 10 ganger, og sentrifuger ved 1800 xg i 30 minutter ved romtemperatur. Ideelt sett bør dette trinnet gjøres innen 2 timer av samlingen.
- Samle de mononukleære celler (MCS) ved pipettering av buffy coat (cellelaget mellom gel barriere og plasma) i en steril 15 ml konisk sentrifugerør. Bring totalt volum til 10 ml med steril fosfat-bufret saltløsning (PBS), invertsukker flere ganger og sentrifuger ved 300 xg i 15 min.
- Resuspender cellene i 10 ml steril PBS og utføre celletall. Overfør en til 2x10 6 celler inn i et sterilt 15 ml konisk sentrifugerør og sentrifuger ved 300 xg i 10 min.
- Resuspender cellene i 2 ml ekspansjon medium (EM) (QBSF-60 Stem Cell medium inneholdende 50 ug / ml Ascorbic Acid, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM deksametason og 100 ug / ml primocin eller 1% Pen / Strep) og overfør til en brønn av en 12-brønns plate. Inkuber cellene i et 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- Sentrifuger gjenværende celler ved 300 x g i 10 minutter og fryse ~ 2x10 6 celler / hetteglass i FBS inneholdende 10% DMSO.
- Å starte protokollen bruker frosne PBMC, tine en ampulle av celler i 10 ml medium og QBSF sentrifuge ved 300 xg i 10 min. Resuspender cellene i 2 ml EM og overføre til en brønn i en 12-brønns plate. Inkuber cellene i et 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
Dag 3 og dag 6
- Overfør cellene til en steril 15 ml konisk rør og vaske brønnen en gang med 1 ml QBSF-60 Stem Cell Middels til samle adherente celler.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 min.
- Resuspender cellene i 2 ml EM og overføre til en brønn i en 12-Brønns plate. Inkuber cellene i et 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
2. Transduksjon av PBMC med STEMCCA Lentivirus
DAG 9
- Overfør cellene til en steril 15 ml konisk rør og vaske brønnen en gang med 1 ml QBSF-60 Stem Cell Middels til samle adherente celler.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 min.
- Resuspender cellene i 1 ml frisk EM inneholdende 5 ug / ml av polybren og STEMCCA lentivirus (MOI = 1 til 10) og overføring til en brønn i en 12-brønns plate. (Protokollen beskriver produksjonen av lentiviral partikler kan bli funnet på http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Spinn plate på 2250 rpm ved 25 ° C i 90 min.
- Etter spin, legge til en ekstra 1 ml av ferske EM inneholdende 5 ug / ml av polybren for totalt 2 ml medium og inkuber platen i en 37 ° C,5% CO 2 inkubator.
DAG 10
- Overfør cellene til en steril 15 ml konisk rør og vaske brønnen en gang med 1 ml QBSF-60 Stem Cell Middels til samle adherente celler.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 min.
- Resuspender cellene i 2 ml EM og overføre til en brønn i en 12-brønns plate. Inkuber cellene i et 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
3. Plating transduced Celler på MEFs
DAG 11
- Belegge brønnene i en 6-brønns plate med 0,1% gelatin og plate inaktiverte mus embryonale fibroblaster (MEFs) ved 2x10 5 celler / brønn i MEF medium (IMDM inneholdende 10% FBS, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 100 uM β- merkaptoetanol, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml primocin eller 1% Pen / Strep). Forbered tre brønner per infeksjon.
DAG 12
- Overfør cellene til en steril 15 ml konisk rør og vaske brønnen en gang med 1 ml QBSF-60 Stem Cell Middels til samle adherente celler.
- Resuspender cellene i 3 ml MEF medium inneholdende 10 ng / ml bFGF, og askorbinsyre og vekstfaktorer på de samme konsentrasjoner som er benyttet i EM medium (50 ug / ml askorbinsyre, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 pM deksametason).
- Plate 1 ml celler pr brønn i en 6-brønns plate som inneholder MEFs. Tilsett 1,5 ml av MEF medier med bFGF, askorbinsyre, og vekstfaktorer for totalt 2,5 ml av media / brønn.
- Spinn platen ved 500 rpm ved 25 ° C i 30 min. Inkuber platen i et 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
DAG 14
- Feed celler hver annen dag med 2,5 ml MEF media inneholdende 10 ng / ml bFGF og 50 ug / ml askorbinsyre (ingen vekstfaktorer). Aspirer og kast flytende celler med hver feed.
- Legg til mer MEFs etter behov (vanligvis en gang i uken).
- Når små kolonier vises, fôr celler daglig med 2 ml humane embryonale stamceller (hESC) medium (DMEM/F12 inneholder 20% Knockout Serum Replacement, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 100 pM β-mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin , 100 ug / ml primocin eller 1% Pen / Strep og 10 ng / ml bFGF).
4. Plukking og utvidelse av IPSC Clones
~ DAG 30-40
- Pick hver koloni i individuelle brønner på en 12-brønns plate pre-sådd med inaktiverte MEFs inneholdende 1 ml / brønn av hESC medium pluss 10 uM av Stemolecule Y27632 (ROCK hemmer).
- Mate cellene deretter daglig med 1 ml medium hESC bare (ingen ROCK inhibitor).
5. Immunfluorescens Farging for pluripotency Markers
- Farging ble utført ved hjelp av kit "ES Cell Marker Sample Kit" fra Millipore og følge produsentens protokoll.
6. Excision av integkarakter STEMCCA Vector
- Excision av omprogrammering kassett oppnås ved hjelp av en Cre-IRES-Puro uttrykke vektor etter transfeksjon og kort puromycin utvalg som beskrevet 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser en enkel og effektiv protokoll for generering av humane iPSCs fra PBMC ved hjelp av en enkelt lentiviral vektor. Figur 1A viser en skjematisk fremstilling av protokollen. Blodet samles i en BD Vacutainer CPT celleforberedelsen Tube med natriumcitrat, og etter sentrifugering, kan mononukleære celler samles fra grensesnittet mellom polyester gel og plasma (buffy coat) (figur 1B). De isolerte PBMC blir deretter utvidet i kultur for 9 dager. Figur 2 sammenligner PBMC på dag 0 og dag 9, som viser at cellene er merkbart delende. Ca 10-15 dager etter transduksjon med STEMCCA lentivirus, er utseendet av små lyse kolonier observert, med fortsatt udefinert koloni morfologi. Etter tilsetningen av hESC medium, kan hESC-lignende kolonier være lett identifiseres (figur 2D). Noen av disse koloniene er mekanisk plukket, utvidet og karakterisertfor ekspresjon av pluripotency markører som SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81 (figur 3). Ved hjelp av en kort puromycin utvalg tilnærming 6, er vi i stand til konsekvent oppnå transgenet-free IPSC kloner som avbildet i figur 4..
Figur 1. Generasjon av menneskelige iPSCs fra perifert blod. A) Skjematisk fremstilling av protokollen som brukes til å generere menneskelige iPSCs fra perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved hjelp av STEMCCA vektor. EM: Utvidelse Medium; GF: vekstfaktorer, RBC: røde blodlegemer, MEF: Mouse Embryonic fibroblast, hESC: human embryonale stamceller B) BD Vacutainer CPT celleforberedelsen Tube med natriumsitrat brukes for innsamling av fullblod og separasjon. av mononukleære celler. Utskillelsen skjer under sentrifugering når gelen barriere skiller than mononukleære celler og plasma fra tettere blodkomponenter. Etter sentrifugering kan mononukleære celler og blodplater bli isolert fra en hvitaktig lag (buffy coat) like under plasma laget. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Representative bilder av morfologiske endringer av celler i hele protokollen. A) Dag 0: mononukleære celler isolert fra perifert blod, og dyrket i ekspansjon medium. . 20x forstørrelse B) Dag 9: Etter ekspansjon i kultur for 9 dager, er "haug med druer-lignende 'klynger av celler observert (piler) som tyder på at cellene er friske og proliferating før de transduced. 20x forstørrelse C) DAG 20:. Koloni formasjonen er observert en uke etter ceLLS er belagt på MEFs. 10x forstørrelse D) Dag 30:. HESC-lignende IPSC kolonier viser typiske morfologi og er klar for plukking og ekspansjon. 4x forstørrelse.
Figur 3. Karakterisering av menneskelige iPSCs generert fra blod. Immunfluorescens analyse av iPSCs generert fra PBMC viser uttrykket av pluripotency markører SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81. De iPSCs også beis positive for alkalisk fosfatase (Alk Phos).
Figur 4. Generering av transgene-frie iPSCs. IPSCs er tilført et plasmidcoexpressing Cre rekombinase og puromycin-resistens-genet, som beskrevet i Somers mfl., 2010. A) iPSCs før transfeksjon. B) Celledød er observert etter to dager med puromycin selection C) Nye kolonier komme fra resistente celler rundt 10 dager etter transfeksjon . D) Noen kolonier plukket og utvidet, og Southern Blot er utført for å bekrefte excision av transgene. 1, 3, 5 og 7: IPSC kloner før eksisjon, 2, 4, 6 og 8: IPSC kloner etter eksisjon. Alle fase kontrast på 4x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi heri beskrive bruken av STEMCCA lentiviral vektoren å generere humane iPSCs fra mononukleære celler isolert fra noen få milliliter av ferskt innsamlet perifert blod. Protokollen kan også brukes til å omprogrammere frosne PBMC (oppnådd direkte fra buffy coat), en detalj av betydelige praktiske implikasjoner når utnytte donorceller anskaffet fra et fjernt sted. Før induksjon av omprogrammering, må isolerte PBMC gjennomgå en kritisk utvidelse trinn som gjør en sunn proliferating populasjon av celler mer mottagelig for kjernefysisk omprogrammering. Dette er lett observeres av tilstedeværelsen av 'gjeng druer-lignende' klynger av celler ved ekspansjon i hematopoetiske dyrkningsbetingelser. Når mindre enn 5x10 5 celler er transduced kan celler bli belagt på en eller to brønner på et 6-brønns plate som inneholder MEFs. Vi har opplevd noen variasjon i nødvendig tid til å observere hESC-lignende kolonier, i noen tilfeller opp til 25 dager etter transduksjon.Bruken av ROCK inhibitor er avgjørende for å forbedre overlevelse og kloning effektivitet ved plukking av nye IPSC kolonier. Bemerkelsesverdig og i motsetning til hva vi har observert når plukke kolonier fra omprogrammeres fibroblaster, tilnærmet 100% av plukket kolonier fra omprogrammeres PBMC etablere stabile IPSC kloner som kan utvides og fryses ned. Til slutt tror vi at det enkle i prøvetaking kombinert med svært effektiv og konsekvent omprogrammering tilnærming beskrevet her, representerer en bona fide plattform for applikasjoner hvor et stort antall IPSC kloner må genereres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Disse studiene ble finansiert delvis av NIH UO1HL107443-01-prisen til GJM og GM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
