Summary
Här visar vi ett enkelt och effektivt protokoll för generering av humana iPSCs 3 till 4 ml perifert blod med användning av en enda Lentiviral omprogrammering vektor. Omprogrammering av lättillgängliga blodkroppar lovar att påskynda användningen av IPSC tekniken genom att göra det tillgängligt för en bredare forskarsamhället.
Abstract
Genom ektopiskt uttryck av fyra transkriptionsfaktorer, Oct4, Klf4,, Sox2 och cMyc kan humana somatiska celler omvandlas till en pluripotent tillstånd, genererar så kallade inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) 1-4. Patientspecifika iPSCs saknar de etiska problem som omger embryonala stamceller (ESC) och skulle kringgå eventuella avstötning. Därför har iPSCs fått stor uppmärksamhet för studier sjukdom modellering, screening av farmakologiska föreningar och regenerativa terapier 5.
Vi har visat att generera transgenen-fria människor iPSCs från patienter med olika lungsjukdomar med en enda punktskattepliktiga polycistronisk Lentiviral kassett Stem Cell (STEMCCA) som kodar för Yamanaka faktorerna 6. Dessa IPSC linjer genererades från huden fibroblaster, den vanligaste cellen som används för omprogrammering. Normalt erhållande fibroblaster kräver en hud stansbiopsi följt av expansion av cellens i kultur för några passager. Viktigt, har ett antal grupper rapporterat omprogrammering av humana perifera blodceller i iPSCs 7-9. I en studie, var en Tet inducerbar version av STEMCCA vektorn användes 9, vilket krävde blodcellerna att samtidigt infekterad med en konstitutivt aktiv lentivirus kodar den omvända tetracyklin transaktivatorn. I motsats till fibroblaster, kan perifera blodceller samlas genom minimalt invasiva procedurer, avsevärt minskar det obehag och ångest hos patienten. En enkel och effektiv protokoll för omprogrammering blodkroppar med en konstitutiv enda punktskattepliktiga vektor kan påskynda tillämpningen av IPSC teknik genom att göra det tillgängligt för en bredare forskarsamhället. Dessutom omprogrammering av perifera blodceller tillåter generering av iPSCs från personer som hudbiopsier bör undvikas (dvs. Avvikande ärrbildning) eller på grund av redan existerande sjukdomstillstånd preventing tillgång till stansbiopsier.
Här visar vi ett protokoll för generering av mänskliga iPSCs från perifera mononukleära blodceller (PBMC) med en enda floxed-punktskattepliktiga lentivirusvektor konstitutivt uttrycker 4 faktorer. Nyligen insamlade eller tinade PBMC expanderas under 9 dagar enligt 10,11 i medium innehållande askorbinsyra, SCF, IGF-1, IL-3 och EPO innan transducerade med STEMCCA lentivirus. Celler därefter ut på MEF och ESC-liknande kolonier kan visualiseras två veckor efter infektion. Slutligen, är utvalda kloner expanderas och testas för uttryck av de pluripotensbestämmande markörerna SSEA-4, Tra-1-60 och Tra-1-81. Detta protokoll är enkel, robust och mycket konsekvent, ger en tillförlitlig metod för generering av humana iPSCs från lättillgänglig 4 ml blod.
Protocol
1. Isolering och expansion av perifera mononukleära blodceller (PBMC)
DAG 0
- Rita 4 ml perifert blod i en BD Vacutainer CPT cellberedning Rör med natriumcitrat. Invertera röret 8 till 10 gånger och centrifugera vid 1.800 xg i 30 min vid rumstemperatur. Helst bör detta steg ske inom 2 timmar efter insamling.
- Samla de mononukleära cellerna (MC) genom pipettering av buffy coat (cellskiktet mellan gelbarriär och plasma) i en steril 15 ml koniskt centrifugrör. Ta den totala volymen till 10 ml med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), invertsocker flera gånger och centrifugera vid 300 xg under 15 minuter.
- Återsuspendera cellerna i 10 ml steril PBS och utföra celltal. Överför 1 till 2x10 6 celler i en steril 15 ml koniskt centrifugrör och centrifugera vid 300 xg under 10 minuter.
- Återsuspendera cellerna i 2 ml expansionsmedium (EM) (QBSF-60 Stem Cell Medium innehållande 50 pg / ml Ascorbic Acid, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 iM dexametason och 100 pg / ml primocin eller 1% Pen / Strep) och överför till en brunn av en 12-brunnars platta. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO-2-inkubator.
- Centrifugera kvarvarande celler vid 300 x g under 10 minuter och frysa ~ 2x10 6 celler / flaska i FBS innehållande 10% DMSO.
- För att starta protokollet använder frysta PBMC, tina 1 flaska med celler i 10 ml QBSF medium och centrifugera vid 300 xg under 10 minuter. Återsuspendera cellerna i 2 ml EM och överföring till en brunn av en 12-brunnars platta. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO-2-inkubator.
Dag 3 och dag 6
- Överför cellerna till en steril 15 ml koniskt rör och skölj väl en gång med 1 ml QBSF-60 Stem Cell medium för att samla vidhäftande celler.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 minuter.
- Återsuspendera cellerna i 2 ml EM och överföring till en brunn av en 12-Brunnsplatta. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO-2-inkubator.
2. Transduktion av PBMC med STEMCCA Lentivirus
DAG 9
- Överför cellerna till en steril 15 ml koniskt rör och skölj väl en gång med 1 ml QBSF-60 Stem Cell medium för att samla vidhäftande celler.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 minuter.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml färsk EM innehållande 5 pg / ml polybren och STEMCCA lentivirus (MOI = 1 till 10) och överföring till en brunn i en 12-brunnars platta. (Protokollet beskriver produktionen av Lentiviral Particles finns på http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Snurra plattan vid 2.250 rpm vid 25 ° C under 90 minuter.
- Efter spinn, lägga till ytterligare 1 ml färsk EM innehållande 5 | ig / ml polybren under totalt 2 ml medium och inkubera plattan i en 37 ° C,5% CO 2 inkubator.
DAG 10
- Överför cellerna till en steril 15 ml koniskt rör och skölj väl en gång med 1 ml QBSF-60 Stem Cell medium för att samla vidhäftande celler.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 minuter.
- Återsuspendera cellerna i 2 ml EM och överför till 1 brunn i en 12-brunnars platta. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO-2-inkubator.
3. Plätering transducerade celler på MEF
DAG 11
- Belägga brunnarna i en 6-brunnars platta med 0,1% gelatin och platta inaktiverade mus embryonala fibroblaster (MEF) vid 2x10 5 celler / brunn i MEF-medium (IMDM innehållande 10% FBS, 1% icke-essentiella aminosyror, 100 | iM β- merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 pg / ml primocin eller 1% Pen / Strep). Bered 3 brunnar per infektion.
DAG 12
- Överför cellerna till en steril 15 ml koniskt rör och tvätta den väl en gång med 1 ml QBSF-60 Stem Cell medium för att samla vidhäftande celler.
- Återsuspendera cellerna i 3 ml MEF medium innehållande 10 ng / ml bFGF och askorbinsyra och tillväxtfaktorer vid samma koncentrationer som används i EM-medium (50 ug / ml askorbinsyra, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 iM dexametason).
- Platta 1 ml celler per brunn i en 6-brunnars platta innehållande MEF. Lägg 1,5 ml MEF medium med bFGF, askorbinsyra, och tillväxtfaktorer för totalt 2,5 ml medium / brunn.
- Snurra plattan vid 500 rpm vid 25 ° C under 30 minuter. Inkubera plattan i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
DAG 14
- Feed celler varannan dag med 2,5 ml av MEF-medium innehållande 10 ng / ml bFGF och 50 ug / ml askorbinsyra (inga tillväxtfaktorer). Aspirera och kassera flytande celler med varje matning.
- Lägg till ytterligare MEF vid behov (vanligen en gång i veckan).
- När små kolonier visas foder celler dagligen med 2 ml mänskliga embryonala stamceller (hESC) medium (DMEM/F12 innehållande 20% Knockout Serum Byte, 1% icke-essentiella aminosyror, 100 M β-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin , 100 pg / ml primocin eller 1% Pen / Strep och 10 ng / ml bFGF).
4. Plockning och expansion av IPSC kloner
~ DAG 30 till 40
- Pick varje koloni i individuella brunnar i en 12-brunnars platta i förväg ympats med inaktiverat MEF innehållande 1 ml / brunn av hESC medium plus 10 iM Stemolecule Y27632 (ROCK-inhibitor).
- Mata celler dagligen därefter med 1 ml hESC-medium enbart (ingen ROCK hämmare).
5. Immunofluorescensfärgning för pluripotens markörer
- Färgning utfördes med användning av satsen "ES-cell Kit Marker Prov" från Millipore och följa tillverkarens protokoll.
6. Excision av Integbetyg STEMCCA vektor
- Excision av omprogrammering kassett uppnås med användning av en Cre-IRES-Puro uttrycker vektorn efter transfektion och kort puromycinselektion som beskrivs 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi visar en enkel och effektiv protokoll för generering av humana iPSCs från PBMC med användning av en enda lentivirusvektor. Figur 1A visar en schematisk representation av protokollet. Blodet uppsamlas i en BD Vacutainer CPT cellberedning Rör med natriumcitrat, och efter centrifugering, kan mononukleära celler samlas in från gränsytan mellan polyester gelén och plasman (buffy coat) (Figur 1B). De isolerade PBMC expanderas sedan i odling under 9 dagar. Figur 2 jämför PBMC dag 0 och dag 9, som visar att cellerna märkbart är att dela. Cirka 10-15 dagar efter transduktion med STEMCCA lentivirus är utseendet av små ljusa kolonier observeras med fortfarande odefinierad kolonimorfologi. Efter tillsats av hESC medium kan hESC-liknande kolonier vara lätt identifieras (Figur 2D). Vissa av dessa kolonier är mekaniskt plockas, expanderas och karakteriserasför expression av pluripotensbestämmande markörer såsom SSEA-4, Tra-1-60 och Tra-1-81 (figur 3). Med användning av en kort metod puromycinselektion 6, kan vi konsekvent erhålla transgen-fria IPSC kloner som visas i figur 4.
Figur 1. Generering av humana iPSCs från perifert blod. A) Schematisk representation av det protokoll som används för att generera humana iPSCs från perifera mononukleära blodceller (PBMC) med hjälp av STEMCCA vektorn. EM: Expansion Medium, GF: tillväxtfaktorer; RBC: röda blodkroppar; MEF: Mus embryonala Fibroblast, hESC: mänskliga embryonala stamceller B) BD Vacutainer CPT cellberedning Tube med natriumcitrat användes för insamling av helblod och separationen. av mononukleära celler. Separationen sker under centrifugeringen när gelbarriär separerar than mononukleära celler och plasma från komponenterna tätare blod. Efter centrifugering kan mononukleära blodkroppar och blodplättar isoleras från en vitaktig lager (buffycoat) precis under plasmaskiktet. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Representativa bilder av morfologiska förändringar av cellerna i hela protokollet. A) DAG 0: är mononukleära celler isoleras från perifert blod och odlas i expansion-medium. . 20x förstoring B) Dag 9: efter expansion i kultur under 9 dagar, "druvklase-liknande" kluster av celler observerades (pilar) antyder att cellerna är friska och förökar innan omvandlas. 20x förstoring C) Dag 20:. Kolonibildning observeras en vecka efter ceLLS stryks ut på MEF. 10x förstoring D) DAG 30:. HESC-liknande IPSC kolonier visar typiska morfologi och är redo för plockning och expansion. 4x förstoring.
Figur 3. Karakterisering av humana iPSCs genereras från blod. Immunofluorescensanalys av iPSCs genererade från PBMC visar uttrycket av pluripotensbestämmande markörerna SSEA-4, Tra-1-60 och Tra-1-81. De iPSCs färgar också positivt för alkaliskt fosfatas (Alk Phos).
Figur 4. Generation av transgen-fria iPSCs. IPSCs transfekteras med en plasmidsamuttrycker Cre-rekombinas och en puromycin-resistensgen, såsom beskrivs i Somers et al, 2010.) A iPSCs före transfektion. B) Celldöd observeras efter två dagar av puromycinselektion C) Nya kolonier ur resistenta celler omkring 10 dagar efter transfektion . D) Vissa kolonier plockas och expanderas, och Southern blot utförs för att bekräfta excisionen av transgenen. 1, 3, 5 och 7: IPSC kloner före excision, 2, 4, 6 och 8: IPSC kloner efter excision. Alla faskontrast bilder med 4x förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver häri användandet av STEMCCA lentivirusvektorn att generera humana iPSCs från mononukleära celler som isolerats från några milliliter nyligen uppsamlat perifert blod. Protokollet kan även användas för att programmera frusna PBMC (erhålls direkt från buffy coat), en detalj av betydande praktiska konsekvenser vid användning donatorceller förvärvats från en avlägsen plats. Innan induktion av omprogrammering måste isolerade PBMC genomgå en kritisk utvidgning steg som gör en frisk förökande population av celler mer mottagliga för kärnkraft omprogrammering. Detta är lätt observeras genom närvaron av "druvklase-liknande" kluster av celler vid expansion i hematopoetiska odlingsbetingelser. När mindre än 5x10 5 celler transducerade kan celler ströks ut på en eller två brunnar i en 6-brunnars platta innehållande MEF. Vi har upplevt en viss variation i den tid som behövs för att observera hESC-liknande kolonier, i vissa fall upp till 25 dagar efter transduktion.Användningen av ROCK-hämmare är kritisk för att öka överlevnad och kloningseffektiviteten vid plockning av nya IPSC kolonier. Anmärkningsvärt och i motsats till vad vi observerade när plocka kolonier från omprogrammerade fibroblaster, nästan 100% av plockade kolonier från omprogrammerade PBMC etablera stabila IPSC kloner som kan utökas och kryokonserverade. Slutligen anser vi att enkelheten i provsamlingen kombination med mycket effektiv och konsekvent omprogrammering tillvägagångssätt som beskrivs häri, utgör en äkta plattform för applikationer där ett stort antal IPSC kloner måste genereras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Dessa studier har finansierats delvis av NIH UO1HL107443-01 Award till GJM och GM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
