Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

Published: December 19, 2012 doi: 10.3791/4328

Summary

Процедура описана для управления деятельностью коры головного мозга пирамидальных нейронов optogenetically в то время как электроэнцефалограммы, электромиограммы, и церебральной концентрации лактата контролируется. Экспериментальные записи выполняются на кабельно-привязанный мышей, когда они подвергаются спонтанному сон / бодрствование циклы. Optogenetic сборки оборудования в нашей лаборатории; записывающее оборудование является коммерчески доступным.

Protocol

1. Хирургическая подготовка животных

1. Испытуемых

Используйте мышей B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J трансгенной линии 9; JAX штамм # 7612) или других мышей, экспрессирующих синие светочувствительных катионов канал, Channelrhodopsin-2, в коры головного мозга нейроны. Применение синего света в коре головного мозга B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J линию трансгенных вызывает пирамидальные нейроны, экспрессирующие Channelrhodopsin-2 для деполяризации и пройти потенциалы действия 9,10. Как следствие пирамидальной активации клеток, местные интернейроны будут активированы, и изменение потенциала распространяется на нейроны за пределами площадки стимуляции 10. Выполнить операции в стерильных условиях в соблюдении применимых нормативных принципов: автоклаве хирургические инструменты и softpacks (операционного поля, марлевые прокладки); горячая борта стерилизовать все тепло терпимым имплантированных металлических устройств (канюли, винты и провода)для 30-сек; Лечить тепла непереносимостью имплантируемых устройств (волоконно-оптический кабель, пластиковый разъем) с 10-секундный провал в этанол; удар этанола ближнего пунктов сухой применением сжатым воздухом.

2. Анестезия, Стереотаксическая размещения и оформления черепа

Используйте IMPAC 6 Интегрированные нескольких пациентов (Vet Если на персонаже Inc) системы, чтобы обезболить мыши. Используйте 5% Isoflurane/95% кислорода для индукции и 3% Isoflurane/97% кислорода для поддержания во время операции. Поместите животное на циркуляцией воды одеяло установлена ​​на 37 ° С. Не нужно контролировать температуру тела, если одеяло выдерживают при этой температуре.

3. Подготовка черепа для имплантации

Подготовьте место разреза после бритья все меха из верхней части черепа. Побрился область должна проходят сбоку от уха до уха и передне-заднего от глаз к заднему концу черепа. Лечить открытые участки кожи с тремя consecutivэлектронной мазки бетадин следует этанола. Сделайте медиальный разрез в верхней части черепа, из промежутка между глазами к задней части черепа. Очистите череп с перекисью водорода и стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl). Управление кровотечения с прижигание инструмент. Найдите и отметьте брегмы и лямбда для определения стереотаксических координат. Стереотаксическая координаты для электрода / optogenetic стимул конфигураций, которые мы использовали представлены в таблице 1 и схематически показано на рисунке 1а.

4. Подготовка к имплантации сайтов на череп

Используйте высокую скорость бормашины с 0,5 бит мяч заусенцев установить каждом участке имплантации в черепе. Фаска внешнего края каждого отверстия с помощью 0,7 мм мяч заусенцев немного для облегчения винта.

5. Вставка и крепления канюли, ЭМГ и ЭЭГ снабжении покупателей

Вставьте ЭЭГ винтов (0,8 мм в длину, 2 см без покрытия 30-калибровочного луженой медной шины провода предварительно припаяны к головке винта) в отверстия и вести их через прорези руки отвертку примерно на 4-5 оборотов для получения желаемой глубины. Держите руководство канюли на месте с помощью стереотаксической держателя канюли, а затем прикрепите их к черепу и якоря с акриловым цементом. Каждый канюли должны содержать фиктивные канюлю / Стилет (пластмассы One, часть # C312 DC \ 1) с момента операции до момента эксперимента (10-14 дней) для поддержания проходимости.

6. Хирургическое закрытие сайта

После ЭЭГ и руководство канюли расположены в черепе, объединить их с зубным цементом акриловые (Lang Dental - Орто-Jet цемента). После цемент наборы, установите пластиковый разъем (Pinnacle Технология части № 8402) над сушеные курган цемента. Припой концы проводов, исходящих из ЭЭГ приводит к контактам на пластиковый разъем. Encase провода приводит в цементе. Затем нарисуйте EMG провода через затылочных мышцы, сдвинув их в ствол 21ga иглой пронзил мышцы. Завяжите узлом двойной хирург из нейлона 5-0 шва вокруг этих проводах только дистально, где они выходят мышц. Шовный вместе кожу, которая была втянута доступ к мышечной ткани с одной прервал узлов хирург, используя обратную резки P-3 иглы и 5-0 нейлоновые нити.

7. Послеоперационное обезболивание и восстановление

Администрирование бупренорфина в качестве обезболивающего средства (0,1 мг / кг, подкожно) и Flunixin меглумина (0,1 мг / кг, подкожно) в качестве противовоспалительного сразу после операции, и ежедневно на 1-2 дней после операции. Разрешить животных, чтобы восстановить в стандартном жилищные условия колонии, по крайней мере за семь дней до эксперимента. При отсутствии дополнительного ухода за стандартный корпус колонии, канюли может быть как ожидается, останется патент, по крайней мере, двух недель с внутренним стилеты закреплены на месте. ЭЭГ и ЭМГ датчики можно ожидать сохраненияфункциональностью для этого срок.

2. Генерация Timed световых импульсов

1. Программирование блока Стимул MC

Подключите MC-Стимул блок (Multi-Channel Systems) через соединение USB к настольному компьютеру. Использование электронной таблицы как MC-Стимул пользовательский интерфейс для программирования MC блок стимул. Введите желаемое TTL (транзисторно-транзисторной логики) напряжения для на период, длительность стимула и выключать периодов, число циклов в секунду лучшего, а общее число повторяющихся циклов в течение всей сессии стимул. Для получения дополнительной информации см. MC-Стимул технического руководства:

3. Производство / Сборка волоконно-оптических PrOBEs для легкой доставки к коре головного мозга

  1. Расходные материалы и оборудование, необходимые находятся по адресу: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
  2. Огранки и полировки волоконно-оптических кабелей. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. Собрание грызунов системы стимулирования Optogenetic

1. Интерфейс MC-Стимул группы и лазерная

После MC-Стимул устройство запрограммировано, запустить его в качестве автономного генератора сигналов 5-ти вольт двоичной ON / OFF сигнала. Подключите MC-Стимул устройства к TTL включен блок лазера с BNC разъемами.

2. Производство лазерных Выход через волоконно-оптический кабель

С помощью цифрового дисплея и переменной набора мощности силового агрегата на ручной лазерныйют регулировать выходную мощность лазера. Подключите устройство мощность лазера для лазерной помощью ленточного кабеля. Подключите женщины FC (наконечник разъема) волоконно-оптического адаптера лазера на разъем FC на волоконно-оптический патч-кабель (3 м длиной, диаметром 200 мкм стекла проводимости волокна, заключенного в свет, отраженный акрилатный полимер оболочки).

3. Транспортировка лазера на животных: Роторный Коммутатор

Подключите происходящих волоконно-оптический кабель (3 м в длину) и доставки волоконно-оптический кабель (45 см длиной), чтобы противоположных концах зрительного поворотные совместной упаковывая две коллиматорные линзы (линзы дорического). Волоконно-оптических поворотные совместной служит в качестве коммутатора: как животное движется вокруг своей клетке, поворотные совместной вращается, чтобы предотвратить поломку волоконно-оптического кабеля. Использование пластиковых стяжек для прикрепления коммутатор на металлической подставке расположены над цилиндрической клетке, в которой находится животное.

4. Присоединение доставки волоконно-оптическихКабельные Главы

Сдерживать мыши с помощью одной руки, чтобы прикрепить мышь под сложенные ладони. Orient голову между средним экспериментатора и указательным пальцем. Удалить манекен канюлю из канюли размещены на волоконно-оптические канюли. Очистите направляющие канюли космического мусора с помощью стерильной иглой 25ga. Вставьте волоконно-оптического кабеля от руки и прикрепите ее к волоконно-оптической канюли руководство с резьбовой крышкой винта спасти от манекена канюли. Контролировать глубину введения волоконно-оптического кабеля в мозге шва узел, завязанный на волоконно-оптический кабель на фиксированном расстоянии от плоского расщепленного конца. Весь экспериментальной установки показана на рисунке 1b.

5. Измерение ЭЭГ определенных сна и концентрации лактата во время стимуляции Optogenetic

1. Precalibration из лактата датчика

Предварительная калибровка датчика лактата осуществляется с в пробиркеКомплект (Pinnacle Технология части № 7000-K1-T). Датчик уравновешенную фосфатным буферным раствором (рН 7,4), а затем подвергается трех концентраций L-лактата в скачком на производителя протоколов.

2. Размещение лактата датчиков и ЭЭГ кабельные

Вставьте предварительно откалибровать датчик в череп монтажа лактата канюли руководство таким образом, идентична волоконно-оптического кабеля процедуру введения (раздел 4.4). Подключите лактата датчик предусилитель Pinnacle 8400 биосенсора с биполярным разъемы. Прикрепите этот предусилитель к 8-контактному разъему на хирургически имплантированных headmount.

3. Создание Optogenetic интенсивности стимула

До начала сбора данных, использование контроля интенсивности лазерного излучения регулятором интенсивности раздражителя optogenetic. Амплитуды ЭЭГ ответ будет варьироваться в зависимости от животных, в связи с факторами, которые не изучались систематически, D должна быть проверена при визуальном осмотре в начале стимуляции. На практике, интенсивность 80-120 μWatts, как правило, приводят к увеличению амплитуды ЭЭГ примерно на 50% на частоте стимуляции. После специальной быстрого преобразования Фурье анализ (см. раздел 5.5) является необходимым для количественного определения абсолютной величины ответа.

4. Сбор данных

Сбор данных с помощью Pinnacle 8400 Система: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .

5. Обработка данных с Neuroscore

Оцените состояние сна путем визуального осмотра ЭЭГ и ЭМГ данных с Neuroscore интерфейс (DataSciences, International: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) или Sirenia интерфейс (Pinnacle технологии:F = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" целевых = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Обработка данных в десять секунд эпох, как следа, без быстрого движения глаз сон, или быстрого сна движения глаз на основе ЭЭГ и ЭМГ. Сохранить данные в таблицы Microsoft Excel для дополнительного анализа и статистических испытаний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как показано на рисунке 2, мышь оборудована для optogenetic стимуляции и лактат / ЭЭГ / ЭМГ сбора данных прошли спонтанные сон / бодрствование переходов государства, а ЭЭГ, ЭМГ и церебральной концентрации лактата контролируется постоянно. Ток при лактата датчик увеличился в периоды низкой амплитуды ЭЭГ и снижение в периоды высокой амплитуды ЭЭГ. Как показано на рисунке 3, оба канала ЭЭГ, которые реагируют на раздражители optogenetic доставлен в лобной коре.

Рисунок 1
Рисунок 1.) Схематическое представление хирургически имплантированных электродов ЭЭГ, лактат датчика и канюли для стимуляции optogenetic. Б) Схематическое изображение всей экспериментальной системы. 1, ЭЭГ свинца 1. 2, ЭЭГ свинца 2. Gnd, ЭЭГ винтом землю. Ref, ЭЭГ винт ссылки.TP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/4328/4328fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.

Рисунок 2
Рисунок 2. Пример сбора данных показывает, что животные перешли в и из сна, в то время как аппаратурой для записи на основе биосенсоров / optogenetic стимул конфигурации показано на рисунке 1а. Optogenetic стимуляция не была применена во время интервала показано здесь. Wake (W) и двух подтипов сна, быстрого сна движения глаз (R) и не быстрого движения глаз сон (N) определяется на основе электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и электромиограммы (ЭМГ). Высокая амплитуда ЭМГ сопровождается низкой амплитуды ЭЭГ определяет пути. Низкая амплитуда ЭМГ сопровождается низкой амплитуды ЭЭГ определяет быстрого сна движения глаз. Низкая амплитуда ЭМГ сопровождается высокой амплитуды ЭЭГ определяется без быстрого движения глаз сон. Лактатбиосенсора ток возрастает в зависимости от малой амплитуды ЭЭГ (т.е.., как во время бодрствования и быстрого сна движения глаз) и падает в зависимости от большой амплитуды ЭЭГ (т.е.., во время отсутствия быстрого сна движения глаз).

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель данные из животных, подвергнутых стимуляции optogenetic с частотой 1 Гц (A) или 10 Гц (B) с помощью биосенсоров / optogenetic стимул конфигурации показано на рисунке 1а. Следы представляют собой 60-секунд записи. Сроки 30-сек интервал стимуляции указывается в верхней части каждой панели. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Фронтальная стимуляция-Относительное брегмы (мм)
Ant / POST Lat D / V
ЕГЭ-1 2,2 1,6 -
EEG2 2,2 -1,6 -
Ссылка -3,5 -1,5 -
Земля -3,5 1,5 -
Лактат Канюля 1,0 1,6 -0,5
Optogenetic Канюля 1,0 -1,6 -0,5

Таблица 1. Стереотаксическая координаты хирургически имплантированные устройства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, представленные здесь, позволяют измерять отношения между сном и изменения в головном мозге концентрация лактата гликолитических промежуточные на шкале времени не было возможно ранее. Животные проходят спонтанные переходы между следа, NREMS и REMS. Кроме того, мы в состоянии применить optogenetic раздражителей в то время как животные проходят эти переходы. Данные, собранные на сегодняшний день показывают, что как спонтанных, так и индуцированных волн влияние на считывание лактат оксидаза на основе биосенсоров.

Можно было бы построить экспериментальные системы, подобные описанным здесь с оборудования и программного обеспечения из других источников. Альтернативные источники полисомнографические систем, пригодных для грызунов включают данные Sciences International 11 и Embla 12. Программное обеспечение для сна классификации состояния можно получить Somnologica 12, сна Зарегистрироваться Icelus 13 и 14. Амперометрических биосенсоров для измерения лактатадоступны Quanteon 15. Насколько нам известно, Pinnacle Технология предлагает только система, в которой биосенсоры, ЭЭГ и ЭМГ могут быть измерены одновременно с одного программного интерфейса.

Мы измерили изменения как концентрация лактата и ЭЭГ дистальнее места стимуляции optogenetic. Воздействие optogenetic стимуляции при таких дистальных участках подтверждает, что optogenetically вызванных возможным изменением распространяются за пределы места стимуляции. Можно было бы измерить эти параметры непосредственно в зоне коры под воздействием света, но измерение их в другом месте уверяет, что ответы в связи с распространения волны, в отличие от искусственной реакции биосенсора для освещенности (как описано 16). Optogenetically вызванной 1-Гц волны отличаются от сна медленной волны в том, что они не синхронизированы с помощью подкорковых нейронов проектирования. Как таковые, они не встречаются в стереотипных временные отношения с другими сна связаныявлений, таких как шпинделей и K-комплексы 17. Если optogenetic стимуляции имитирует другие последствия стихийных медленных волн (например, изменения в синаптической силы 18 или homoeostatic изменений в ЭЭГ медленных волн деятельность 11) является неопределенным. Методы, описанные здесь, могут быть использованы для решения этого вопроса в будущих исследованиях.

Животные привязаны как провода передачи биопотенциалов от животного к компьютеру и волоконно-оптический кабель, который передает синего света в коре головного мозга. Обе беспроводные ЭЭГ / bioanalyte записи системы (http://pinnaclet.com/biosensor-recording-sys/fixed-frequency.html) и беспроводной стимуляции optogenetic устройств 19 не поступало. Однако, два не были интегрированы в единую рабочую систему наших знаний. Несмотря на ограничения, связанные с модема кабель, животные часто можно увидеть движущиеся вокруг своих клеток, и количество времени, потраченное спал является типичным мышей изучена сimilar экспериментальной ситуации. Датчики, совместимые с этой системой доступных для измерения других bioanalytes, в том числе глюкозы и глутамата. Система Поэтому, вероятно, будет полезна и в других экспериментальных ситуаций, в которых поведение, ЭЭГ и bioanalyte концентрации проанализированы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Исследования, финансируемого Министерством обороны (Defense Advanced Research Projects Agency, премия для молодых факультет, номер гранта N66001-09-1-2117) и NINDS (R15NS070734).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BASi Mouse Guide Cannula Pinnacle Technology/BASi Inc 7032
Lactate Biosensor Pinnacle Technology 7004
Head Mount Pinnacle Technology 8402
Sleep/Biosensor Recording system Pinnacle Technology 8400-K1-SL 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor
Tethered Mouse in-vitro Calibration kit Pinnacle Technology 7000-K1-T
Fiber Optic Guide Cannula Plastics One C312G 21 Gauge Guide Cannula
Dummy Cannula Plastics One C312DC 21 Gauge Dummy
Diamond Fiber Scribe Thorlabs S90W
Fiber Connector Crimp Tool Thorlabs CT042
Furcation Tubing Thorlabs FT030 03.0 mm
Thorlabs T10S13 Max Dia. 0.012
Furcation Tube Stripper Thorlabs FTS3
Bare Hard Cladding Multimode Fiber Thorlabs BFL37-200 200 μm Core, 0.37 NA
Wire Snips/Kevlar Shears Thorlabs T865
Fiber Optic Epoxy Thorlabs F112
Fiber Stripper Tool Thorlabs
Glass Polishing Plate Thorlabs CTG913
Rubber Polishing Pad Thorlabs NRS913
Eye Loupe Thorlabs JEL10
Kim Wipes Thorlabs KW32
Compressed Air Thorlabs CA3
Polishing Puck Thorlabs D50-xx
Fiber Inspection scope Thorlabs CL-200
Polishing Films Thorlabs LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P
FC/PC connector end Thorlabs 30126G2-240 240 μm Bore, SS Ferrule
MC Stimulus Unit Multi-Channel Systems STG-4002
MC Stimulus Software Multi-Channel Systems MC-Stimulus V 2.1.5
Blue Laser CrystaLaser CL473-050-0
Laser Power supply CrystaLaser CL2005
Fiber Optic Rotary Joint Doric Lenses FRJ-v4
Table 2. Supplies and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magistretti, P. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. , Academic Press. New York. 389-413 (1999).
  2. Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
  3. Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
  4. Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
  5. Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
  6. Borbely, A. A., Achermann, P. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. , 3rd, W.B. Saunders. Philadelphia. 377-390 (2004).
  7. Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
  8. Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
  9. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  10. Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
  11. Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
  12. El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
  13. Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
  14. Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
  15. Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
  16. Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  17. Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).
  18. Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
  19. Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).

Tags

Neuroscience выпуск 70 физиология анатомия медицина фармакология хирургия сна быстрое движение глаз глюкозы гликолиз пирамидальные нейроны channelrhodopsin optogenetics optogenetic стимуляции электроэнцефалограмма ЭЭГ ЭМГ головного мозга животной модели
Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clegern, W. C., Moore, M. E.,More

Clegern, W. C., Moore, M. E., Schmidt, M. A., Wisor, J. Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (70), e4328, doi:10.3791/4328 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter