Summary
一个过程的描述，操纵大脑皮质锥体神经元的活动optogenetically而脑电图，肌电图，脑乳酸浓度监测。进行实验记录，电缆绳系小鼠，而他们自发的睡眠/觉醒周期。 optogenetic设备被组装在我们的实验室;记录设备是市售的。
Abstract
尽管大脑表示小于5质量％的身体时，它利用身体所利用的葡萄糖在休息1的约四分之一。非快速眼动睡眠（NREMS），睡眠时间的最大部分的功能是不确定的。然而，一个显着的特点NREMS是一个显着的减少的速率相对于觉醒2-4脑葡萄糖利用率。这与其他研究结果已广泛持有的信念，睡眠提供相关的脑代谢的功能。然而，仍有待澄清NREMS期间脑葡萄糖代谢的降低机制。
与的NREMS可能影响脑代谢率相关联的一种现象是慢波，在小于4赫兹的频率的振荡的发生，在脑波5,6。这些慢波在颅骨或大脑皮质表面的水平反映了检测相关的神经元去极化/状态和超极化/下的状态7之间振荡。在向下状态，细胞不发生动作电位到几百毫秒的间隔。后续动 作电位的离子浓度梯度的恢复是一个重要的代谢负荷对细胞8，动作电位与NREMS在掉电状态的情况下可能会有助于减少代谢相关唤醒的。
为了要测试这个假设的关系，必须解决两个技术挑战。首先，它是必要的测量脑糖酵解代谢与脑EEG的动态反射的时间分辨率（即，超过秒，而不是分钟）。要做到这一点，我们测得的乳酸浓度，有氧糖酵解的产物，因此，在老鼠的大脑中的葡萄糖代谢率的读数。乳酸是采用基于乳酸氧化酶的实时传感器嵌入的额叶皮层。感测机构包括由乳酸氧化酶分子的层包围的铂 - 铱电极。由乳酸氧化酶的乳酸代谢产生的过氧化氢，其产生的电流中的铂 - 铱电极。因此，一个加速脑糖酵解提供乳酸氧化酶，然后被反射在增加的电流在检测电极中的底物浓度的增加。这是另外需要这些变量，而操纵大脑皮质的兴奋性，以找出这个变量的NREMS从其他方面来衡量。
我们设计了一个实验系统的神经元活动的同时测量通过大脑皮质神经元的活动的elecetroencephalogram，通过乳酸生物传感器的糖酵解流量测量，操作通过optogenetic激活的金字塔midal神经元。我们已经利用本系统之间的睡眠相关的脑电图波形和在大脑皮质的乳酸浓度的时刻到时刻动态文件的关系。该协议可能是有用的任何个人感兴趣，学习，在自由活动的啮齿动物，在脑电图能量大脑内的水平和细胞之间的关系测定的神经元活性。
Protocol
1。动物的外科下游
1。实验的主题
使用小鼠的Tg（Thy1-COP4/eYFP）的的B6.Cg 18Gfng / J转线9; JAX应变＃7612）或其他小鼠表达的蓝色光敏感的阳离子通道，Channelrhodopsin-2，在大脑皮质的神经元。应用到大脑皮质的B6.Cg-TG（Thy1-COP4/eYFP）的18Gfng / J，转基因株系的蓝色光会导致锥体神经元去极化，并进行动作电位9,10表达Channelrhodopsin-2。作为一个结果，锥体细胞的活化，本地的interneurons被激活，和电势的变化传播到神经元刺激10以外的部位。执行手术遵守适用的监管指引：在无菌条件下的高压釜手术工具和softpacks（外科领域，纱布垫），热珠消毒所有热性植入的金属设备（套管，螺丝和电线）30秒，10秒浸在乙醇消毒热不耐受可植入设备（光纤电缆，塑料接头）应用的罐装空气干燥的打击乙醇浸项目。
2。麻醉，立体定位和颅骨的间隙
使用IMPAC 6集成多病人系统（VET装备公司），麻醉鼠标。使用5％Isoflurane/95％氧诱导和3％Isoflurane/97％氧气维持在手术过程中。将动物设置为37℃，这是没有必要监测体温，如果在此温度下保持橡皮布上的循环水毯。
3。准备植入头骨
准备切口部位剃所有毛皮从头骨的顶部。剃区域横向延伸，从耳朵到耳朵和前后从眼睛到后端的头骨。裸露的皮肤消毒有三个consecutivË拭子优碘，然后用乙醇。从两眼中间到后面的骷髅头骨的顶部，使内侧切口。与过氧化氢和无菌生理盐水（0.9％NaCl）中，清洁颅骨。控制出血烧灼工具。确定立体定向定位和标记前囟门和lambda。立体定向坐标的电极/ optogenetic刺激配置，我们已经使用的是在表1中给出，并在图1A中示意性地示出。
4。在头骨植入部位的制备
使用高速牙钻0.5mm的球毛刺位来建立每个着床部位的头骨。每个使用了0.7毫米的球毛刺位，以方便插入螺丝孔倒角外部边缘。
5。插管插入和保护，肌电图（EMG）信息和EEG信息
插入脑电图螺钉（0.8mm的长度，有2厘米的未涂覆30隔距镀锡铜总线线预焊接到旋拧头）插入孔中并驱动它们以一个开槽的手螺丝刀约4-5革命，以获得所需的深度。保持在一个立体的导管架，然后贴上他们的头骨和美女主播与丙烯酸水泥的引导插管。每个导管应包含一个虚拟的管/管芯（塑料件，部件编号：C312 DC \ 1）从实验的时间（10-14天），手术时保持通畅。
6。关闭手术部位
一旦脑电图和引导插管的位置在头骨，把它们绑定一起牙骨水泥（郎牙科 - 邻水泥旋喷）。水泥台后，塑料连接器（品尼高技术部件编号：8402）以上的干水泥土墩的位置。焊锡从EEG引线的塑料连接器上的接触所产生的电线的端部。包住导线连接水泥。然后，通过颈部肌肉的肌电图线画s的滑入桶的21ga针穿透肌肉。领带的双重外科医生的结5-0尼龙缝线周围这些电线远端，他们退出肌肉。缝合到一起的皮肤，后退到访问的肌肉组织与单一中断的外科医生节，使用反向切割P-3针和5-0尼龙线。
7。手术后的镇痛和恢复
管理在手术后立即丁丙诺啡作为镇痛药（0.1毫克/千克，皮下）和氟胺烟酸葡胺（0.1毫克/千克，皮下）作为一种抗炎，并且每天在手术后1-2天。让动物恢复标准的殖民地的住房条件，在试验前至少7天。超越标准的殖民地房屋没有额外的照顾，插管留置钢丝固定到位，预计将保持至少两个星期的专利。 EEG和EMG传感器也可保留这个时间的功能。
2。代光脉冲定时
1。 MC刺激机组编程
刺激MC-单元（多通道系统）连接，通过USB连接到一台台式电脑。使用类似电子表格的用户界面，刺激MC-MC刺激单元进行编程。输入所需的TTL（晶体管 - 晶体管逻辑）上的期间的电压，刺激的持续时间和关闭期间，每秒的周期需要的话，并重复循环的总数为刺激整个会话的数目。如需进一步详细信息，请参阅MC刺激技术手册：
3。制造/装配的光纤PR灵魂出窍光传输到大脑皮层
- 用品和设备，被发现在： http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
- 切割和抛光的光纤电缆。 http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
4。大会的的啮齿动物Optogenetic刺激系统
1。 MC刺激组和激光接口
一旦被编程的MC-刺激单元，它作为一个独立的一个5伏的ON / OFF信号的二进制信号发生器运行。将刺激MC-TTL功能的动力单元与BNC连接器的激光装置。
2。产生激光的输出，通过光纤电缆
使用的数字显示和可变的激光功率单元的输出功率拨盘手册光年调整激光的输出功率。通过带状电缆连接的激光功率单元的激光。将阴（FC连接器）套圈的激光的男性的FC连接器电缆（3米长，直径为200μm的玻璃传导纤维包裹在光反射的丙烯酸酯聚合物包层）上的光纤活动光纤适配器。
3。输送的动物：激光旋转整流子
连接始发的光纤电缆（3米长）和交付的光纤电缆（45厘米长）包住两个准直透镜（多利安镜片）的光纤旋转接头的相对的两端。光纤旋转接头作为换向器：作为动物有关它在笼的移动，旋转接头旋转，以防止破损的光纤电缆。使用塑料扎带固定换向器的金属，站在上面放置的圆柱笼中的动物被安置。
4。附加交货光纤电缆总目
抑制鼠标用一只手到脚的鼠标下一个杯状的手掌。东方实验者的中间和食指之间的头。移除虚设插管从导向套管放置为光纤套管。清除指南套管碎片使用无菌25GA针的。用手工插入的光纤电缆，并把它固定在带有螺纹的螺丝帽从一个虚拟套管打捞光纤导向套管。控制由缝线结绑在纤维上的固定距离处的平面切割的端部的光缆的光纤电缆，在大脑中的插入深度。在图1B中示出的整个实验装置。
5。测量的的EEG定义的睡眠和乳酸浓度在Optogenetic刺激
1。预校准的乳酸传感器
在体外进行的乳酸传感器的预校准试剂盒（品尼高技术部件编号：7000-K1-T）。该传感器是平衡的磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中，然后在每个制造商的协议的逐步的方式暴露于三种不同浓度的L-乳酸。
2。插入的的乳酸传感器和EEG电缆
将预校准的传感器安装头骨乳酸引导套管的光纤电缆插入程序（第4.4节）相同的方式。乳酸传感器连接到品尼高8400双极型生物传感器插头连接器的前置放大器。将前置放大器的手术植入头戴8针连接器上。
3。建立Optogenetic刺激强度
在收集数据之前，使用激光强度控制旋钮的调整力度的optogenetic刺激。的脑电反应的幅度各不相同的动物，由于还没有系统地研究了因素， d必须通过目测验证，在发病的刺激。在实践中，一个强度80-120μWatts，将典型地产生的频率刺激脑电图振幅的约50％的增加。事后快速傅里叶变换分析（参见5.5节）是必要的，以量化的绝对星等的响应。
4。数据采集
收集数据使用品尼高8400系统： http://pinnaclet.com/pal-8400.html 。
5。数据处理与Neuroscore
分类睡眠状态目视检查脑电图，肌电图数据的Neuroscore接口（DataSciences，国际http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ）的或海牛接口的（品尼高技术：F =“http://www.pinnaclet.com/sirenia.html”目标=“_blank”> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html）。在10秒的时代唤醒，非快速眼动睡眠，快速眼动睡眠脑电图和肌电图的基础上的过程数据。保存为Microsoft Excel电子表格的数据进一步分析和统计检验。
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Representative Results
正如在图2中所示， 经历了自发的睡眠/唤醒状态转换，同时鼠标配备optogenetic刺激和乳酸/ EEG / EMG数据收集的脑电图，肌电图和脑乳酸浓度连续监测。目前在乳酸传感器增加了在低振幅脑电图的时期，期间，高振幅EEG下降。正如在图3中所示，两个通道的脑电图响应于optogenetic刺激交付的额叶皮层。
图1，A）的示意图的外科手术植入的EEG电极，乳酸传感器和插管optogenetic刺激。 B）的整个实验系统的示意图。 1，脑电图领先1。 2，脑电图领先2。 GND，EEG接地螺钉。参考文献，EEG参考螺钉。TP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/4328/4328fig1large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图2实施例的数据收集表明动物进入和退出睡眠转变而仪表录音使用图1A所示结构的生物传感器/ optogenetic刺激。此处所示的时间间隔期间不施加optogenetic刺激。唤醒（W）两种亚型的睡眠，快速眼动睡眠（R）和非快速眼动睡眠（N）的定义的基础上的脑电图（EEG）和肌电图（EMG）。高振幅EMG的陪同，低振幅EEG定义唤醒。低幅度低振幅定义快速眼动睡眠脑电图肌电图的陪同下。低振幅EMG伴随着高幅度EEG定义非快速眼动睡眠。乳酸生物传感器的电流上升，低振幅的函数脑电图（ 即 ，在唤醒和快速眼动睡眠）和属于作为高振幅脑电图（ 即 ，在非快速眼动睡眠）功能。
图3在1 Hz（A）或（B）的10赫兹进行optogenetic刺激的动物，使用图1A所示结构的生物传感器/ optogenetic刺激的代表性数据。跟踪代表60秒的录音。刺激的30秒间隔的时间显示在每个面板的顶部。 点击此处查看大图 。
| 正面的刺激，相对于前囟门（毫米） | |||
| 蚂蚁/ POST | 纬度 | D / V | |
| EEG1 | +2.2 | +1.6 | - |
| EEG2 | +2.2 | -1.6 | - |
| 参考 | -3.5 | -1.5 | - |
| 地面 | -3.5 | 1.5 | - |
| 乳酸套管 | +1.0 | +1.6 | -0.5 |
| Optogenetic套管 | +1.0 | -1.6 | -0.5 |
表1。立体定位手术植入的设备。
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Discussion
这里介绍的方法允许一个以前是不可能实现的时间尺度上测量大脑中的浓度之间的关系的睡眠和变化的糖酵解中间乳酸。动物自发唤醒，的NREMS和REMS之间的转换。此外，我们当动物接受这些转变可以申请optogenetic刺激。最新收集到的数据表明，自发和诱发波影响的乳酸氧化酶为基础的生物传感器的读出。
人们可以构建实验系统，类似于此处所述的设备和软件从其他来源。多导睡眠监测系统，适用于啮齿动物的替代来源包括数据科学国际11和恩布拉12的 。软件提供了睡眠状态分类的Somnologica 12，睡眠，注册13和Icelus 14。安培型生物传感器的测量乳酸可从Quanteon 15。据我们所知，品尼高技术提供了唯一的系统中，生物传感器，脑电图和肌电图可以同时测量一个软件接口。
我们已经测量在两个乳酸浓度和脑电远端站点optogenetic刺激的变化。的等远端站点optogenetic刺激的确认，optogenetically引起的电位变化刺激部位以外的传播。一个可以直接测量这些参数范围内的皮质暴露在光线下，测量他们在其他地方，可以确保反应是由于波的传播，反对的生物传感器，光曝光（记录16）artifactual。是不同的，因为它们不同步由皮层下突出神经元从睡眠慢波optogenetically诱导1-Hz的波。因此，他们不会出现在其他睡眠相关的定型时间关系，的现象，如主轴和K-络合物17。无论optogenetic刺激模仿 自然慢波（如在突触强度18或homoeostatic的变化，脑电图慢波活动11）其他影响是不确定的。这里介绍的方法可以用来解决这个问题，在今后的研究中。
动物被拴由输送从动物到计算机和光纤电缆，蓝色光传送到大脑皮质中的生物电势的两个导线。两个无线的的EEG / bioanalyte记录的系统（http://pinnaclet.com/biosensor-recording-sys/fixed-frequency.html）的和无线optogenetic刺激装置19已被报道。然而，这两个还没有被整合到一个单一的工作系统，我们的知识。尽管与圈养电缆相关的约束，动物经常看到周围移动它们的笼子，和睡着了花费的时间量是典型s中研究的小鼠imilar的实验条件。与该系统兼容的传感器可用于测量其他bioanalytes，包括葡萄糖和谷氨酸。因此，该系统在其他的实验行为，EEG和bioanalyte浓度进行分析的情况可能是有用的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
由国防部（国防高级研究计划局，青年教师奖，项目编号N66001-09-1-2117）和NINDS（R15NS070734）的研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. | |||
References
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