Summary
Um procedimento é descrito para manipular a actividade de neurónios piramidais corticais cerebrais optogenetically enquanto o electroencefalograma, electromiograma, e concentração do lactato cerebral são monitorados. Gravações experimentais são realizados em ratinhos de cabo-cativos, enquanto eles sofrem espontâneas do sono / vigília ciclos. Optogenética equipamento é montado no nosso laboratório, o equipamento de gravação encontra-se comercialmente disponível.
Abstract
Embora o cérebro representa menos de 5% da massa corporal por, utiliza cerca de um quarto da glucose utilizada pelo corpo em repouso 1. A função do sono movimento rápido dos olhos não (NREMS), a maior porção do sono pelo tempo, é incerto. No entanto, uma característica saliente do NREMS é uma redução significativa da taxa de utilização de glicose cerebral em relação ao estado de vigília 2-4. Esta e outras descobertas levaram à crença de que o sono tem uma função relacionada ao metabolismo cerebral. No entanto, os mecanismos subjacentes à redução no metabolismo da glicose cerebral durante NREMS permanecem por ser elucidados.
Um fenômeno associado com NREMS que podem afetar a taxa metabólica cerebral é a ocorrência de ondas lentas, oscilações em freqüências menos de 4 Hz, no eletroencefalograma 5,6. Estas ondas lentas detectados ao nível do crânio ou da superfície cortical cerebral reflectir aoscilações de neurônios subjacentes entre um estado despolarizado / up e um estado hiperpolarizada / baixo 7. Durante o estado para baixo, as células não sofrem potenciais de ação em intervalos de até vários milissegundos cem. Restauração dos gradientes de concentração iônica subseqüentes para os potenciais de ação representa uma carga significativa metabólica na célula 8; ausência de potenciais de ação durante os estados para baixo associados NREMS pode contribuir para um metabolismo reduzido em relação ao acordar.
Dois desafios técnicos tiveram que ser abordadas para que essa hipotética relação a ser testada. Em primeiro lugar, foi necessário medir o metabolismo glicolítico cerebral com uma resolução temporal de reflexo da dinâmica do EEG cerebral (isto é, ao longo de segundos em vez de minutos). Para o fazer, foi medida a concentração de lactato, o produto da glicólise aeróbica, e, portanto, uma leitura da taxa do metabolismo da glucose no cérebro dos ratos. Lactato foimedida utilizando um sensor de lactato-oxidase com base em tempo real, incorporado no córtex frontal. O mecanismo de detecção é constituído por um eléctrodo de platina-irídio rodeado por uma camada de moléculas de oxidase de lactato. O metabolismo do lactato pela lactato oxidase produz peróxido de hidrogénio, o qual produz uma corrente no eléctrodo de platina-irídio. Assim, uma rampa para cima da glicólise cerebral proporciona um aumento na concentração do substrato para a oxidase de lactato, que, em seguida, reflecte-se no aumento da corrente no eléctrodo de detecção. Era ainda necessário medir estas variáveis enquanto manipulando a excitabilidade do córtex cerebral, a fim de isolar esta variável de outras facetas NREMS.
Criámos um sistema experimental para a medição simultânea de actividade neuronal por meio do elecetroencephalogram, a medição do fluxo glicolítico através de um biossensor de lactato, e a manipulação da actividade neuronal cortical cerebral através optogenética activação de pyraneurônios MIDAL. Foi utilizado este sistema para documentar a relação entre o sono relacionada electroencefalográfico formas de onda e a dinâmica momento-a-momento da concentração de lactato no córtex cerebral. O protocolo pode ser útil para qualquer indivíduo interessados em estudar, em livremente comportando roedores, a relação entre a actividade neuronal medido ao nível EEG e energetics celulares dentro do cérebro.
Protocol
1. Preparação Cirúrgica de Animais
1. Assuntos experimentais
Utilizar ratos da B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) linha transgénica 18Gfng / J 9; JAX estirpe # 7612), ou outros ratos expressando o canal de catião sensível à luz azul, channelrodopsina-2, em neurónios corticais cerebrais. Aplicação de luz azul, para o córtex cerebral do B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) linha transgénica 18Gfng / J faz com que os neurónios piramidais que expressam channelrodopsina-2 para despolarizar e sofrem a acção potenciais 9,10. Como consequência da activação de células piramidais, interneurónios locais são activados, e a mudança de potencial é propagada para neurónios para além do local de estimulação 10. Realizar a cirurgia em condições estéreis em adesão a diretrizes regulamentares aplicáveis: autoclave instrumentos cirúrgicos e softpacks (campo cirúrgico, compressas de gaze); quente talão esterilizar todos tolerantes ao calor dispositivos metálicos implantados (cânulas, parafusos e fios)para 30 seg; Desinfetar calor intolerantes dispositivos implantáveis (cabo de fibra óptica conector, plástico), com um mergulho de 10 segundos em etanol; sopro etanol-mergulhados itens seco pela aplicação de ar comprimido.
2. Colocação de anestesia, Estereotáxica e Liquidação da Caveira
Use o IMPAC 6 integrado multi Paciente sistema (Vet Equip Inc) para anestesiar o rato. Utilizar 5% de oxigénio Isoflurane/95% para indução e 3% de oxigénio Isoflurane/97% para manutenção durante a cirurgia. Colocar o animal sobre uma manta de circulação de água-ajustado para 37 ° C. Não é necessário controlar a temperatura do corpo, se a manta é mantida a esta temperatura.
3. Preparando o crânio para Implantação
Preparar o local da incisão com todas as peles de barbear a partir do topo do crânio. A área depilada deve se estender lateralmente de orelha a orelha e ântero-posterior dos olhos até a parte posterior do crânio. Desinfectar a pele exposta com três CONSECUTIVOSCotonetes de e de betadine seguido por etanol. Fazer uma incisão mediana na parte superior do crânio, de entre os olhos para a parte posterior do crânio. Limpar o crânio com peróxido de hidrogénio e solução salina estéril (NaCl a 0,9%). Controlar o sangramento com uma ferramenta de cauterização. Localizar e marcar bregma e lambda para determinar coordenadas estereotáxica. Coordenadas estereotáxicas para configurações de eléctrodos / optogenética estímulo que temos utilizado são apresentados na Tabela 1, e mostrado esquematicamente na Figura 1A.
4. Preparação dos locais de implantação no crânio
Use uma broca dental de alta velocidade com um pouco de rebarbas 0,5 milímetros bola para estabelecer cada local de implante no crânio. Chanfrar a margem externa de cada furo com um 0,7 milímetros bola bit rebarba para facilitar a inserção do parafuso.
5. Inserção e Proteção de cânulas, EMG Leads Leads e EEG
Insira os parafusos de EEG (0,8 milímetros de comprimento, com 2 cm de 3 não revestidos0 calibre de cobre estanhado-ônibus fio pré-soldada à cabeça do parafuso) nos furos e conduzi-los com uma chave de fenda entalhada a mão revoluções aproximadamente 4-5 para obter a profundidade desejada. Segurar cânulas guia no lugar com um suporte de cânula estereotáxico e depois fixá-las no crânio e âncoras com cimento acrílico. Cada cânula guia deve conter uma cânula manequim / estilete (Plastics One, parte # C312 DC \ 1) desde o momento da cirurgia para o tempo de experimentação (10-14 dias), para manter a desobstrução.
6. Fechando Sítio Cirúrgico
Uma vez EEGs e cânulas guia estão posicionados no crânio, bond-los com cimento acrílico dental (Lang Dental - Ortho-Jet cimento). Depois de conjuntos de cimento, posicionar o conector de plástico (Pinnacle parte Tecnologia # 8402) acima do monte de cimento seco. Soldar as extremidades dos fios condutores provenientes de EEG para os contactos do conector de plástico. Cubra o fio leva em cimento. Em seguida, desenhe os fios EMG através do músculo da nucas deslizando-as para dentro do tambor de uma agulha 21ga perfurado através do músculo. Amarre um nó cirurgião dupla de náilon 5-0 em torno desses fios apenas distal para onde eles saem do músculo. Suture junto a pele que foi recolhido para acessar o tecido muscular com o único cirurgião nós interrompidos, usando um corte reverso P-3 agulha e náilon 5-0.
7. Analgesia pós-operatória e recuperação
Administrar a buprenorfina como analgésico (0,1 mg / kg, subcutânea) e flunixin meglumine (0,1 mg / kg, subcutânea), como um anti-inflamatório, imediatamente após a cirurgia, e diariamente nos dias 1-2 após a cirurgia. Permitir que os animais se recuperar em condições de habitação padrão de colônia por pelo menos sete dias antes da experimentação. Com nenhum cuidado adicional para além da habitação colónia padrão, cânulas pode ser esperado para permanecer patente por pelo menos duas semanas, com os estiletes indwelling garantidos no lugar. Sensores de EEG e EMG pode também ser esperado para reterfuncionalidade para esta duração.
2. Geração de Pulsos Temporário Luz
1. Programação de MC unidade de estímulo
Ligue a unidade MC-estímulo (Multi-Channel Systems) através de uma conexão USB a um computador desktop. Use a planilha como MC Estímulo-interface de usuário para programar a unidade de estímulo MC. Digite o TTL desejado (transistor-transistor logic) de tensão para o período em diante, as durações de estímulo e fora períodos, o número de ciclos por segundo desejados, eo número total de ciclos repetidos para a sessão de estímulo inteiro. Para mais detalhes, consulte MC-estímulo manual técnico:
3. Fabricação / Montagem de Fibra Óptica PrEFCs para entrega Luz para o córtex cerebral
- Suprimentos e equipamentos necessários são encontrados em: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
- Corte e polimento de cabos de fibra óptica. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
4. Assembleia de Roedor sistema de estimulação optogenética
1. Interface do MC-Estímulo Unidade e Laser
Uma vez que a unidade MC-estímulo é programado, execute-o como um gerador de sinal independente de um binário de 5 V ON / OFF de sinal. Ligue a unidade MC estímulo para a unidade de potência TTL habilitado do laser com conectores BNC.
2. Produzir Laser saída via cabo de fibra óptica
Utilizar o mostrador digital e com ligação de saída de potência variável da unidade de potência do laser para manually ajustar a potência de saída do laser. Ligue a unidade de potência do laser para o laser através de um cabo de fita. Ligue o FC fêmea (ponteira do conector) do adaptador de fibra do laser para o conector macho FC no cabo de fibra óptica (a 3 m de comprimento, 200 um de diâmetro de fibra de vidro revestido de condução de luz refletindo acrilato de revestimento de polímero).
3. Transmitindo a Laser para o Animal: comutador rotativo
Conectar o cabo de fibra óptica de origem (3 m de comprimento), e o cabo de fibra óptica de entrega (45 cm de comprimento) de extremidades opostas do conjunto óptico rotativo que encerra duas lentes de colimação (lentes dóricas). A junta de fibra óptica rotativo serve como um comutador: enquanto o animal se move sobre a sua gaiola, a junta rotativa roda para impedir a ruptura dos cabos de fibra óptica. Use braçadeiras plásticas para fixar o comutador de um metal ficar colocado por cima do compartimento cilíndrico em que o animal está alojado.
4. Colocar Entrega de fibra ópticaCabo Direto
Contenha o mouse usando uma mão para prender o mouse sob uma palma em concha. Orientar a cabeça do meio entre o experimentador eo dedo indicador. Remova a cânula simulado a partir da cânula guia colocado para a cânula de fibra óptica. Desmarque a cânula guia de detritos usando uma agulha estéril 25ga. Insira o cabo de fibra óptica com a mão e prendê-lo ao cânula guia de fibra óptica com uma tampa de rosca de rosca recuperado de uma cânula manequim. Controlar a profundidade de inserção do cabo de fibra óptica no cérebro por um nó de sutura ligada no cabo de fibra óptica a uma distância fixa a partir da extremidade plana clivada. Todo o aparelho experimental é apresentado na Figura 1B.
5. Medição de EEG-definida do sono e da concentração de lactato durante a estimulação optogenética
1. Pré-calibragem do sensor Lactato
Pré-calibração do sensor de lactato é realizada com um in vitrokit (Pinnacle parte Tecnologia # 7000-K1-T). O sensor é equilibrada em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4), em seguida, expostos a três concentrações de L-lactato de forma gradual, por protocolos do fabricante.
2. Inserção do sensor de lactato e cabo EEG
Inserir o sensor pré-calibrado no crânio montado cânula guia de lactato de forma idêntica ao procedimento de inserção do cabo de fibra óptica (secção 4.4). Ligue o sensor de lactato para o pré-amplificador do 8400 Pinnacle biossensor com conectores bipolares ficha. Anexe este pré-amplificador para o conector de 8 pinos no Headmount cirurgicamente implantado.
3. Estabelecer optogenética intensidade do estímulo
Antes de coletar dados, use o botão de controle de laser intensidade para ajustar a intensidade do estímulo optogenética. A amplitude da resposta de EEG irá variar entre animais, devido a factores que ainda não foram estudadas sistematicamente, uma d deve ser verificada por inspecção visual no início da estimulação. Na prática, uma intensidade de 80-120 μWatts tipicamente produzir um aumento na amplitude do EEG de aproximadamente 50% na frequência de estimulação. Post-hoc de análise rápida de Fourier Transform (ver secção 5.5) é necessário quantificar a magnitude absoluta da resposta.
4. Coleta de Dados
Coletar dados usando o Pinnacle 8400 sistema: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .
5. Processamento de Dados com Neuroscore
Classificar dormir estados por inspeção visual dos dados de EEG e EMG com a interface Neuroscore (DataSciences, Internacional: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) ou a interface Sirenia (Pinnacle Tecnologia:f = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" target = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Dados do processo em 10 segundos épocas como sono-vigília, o movimento não-rápido dos olhos, ou sono do movimento rápido dos olhos baseada em EEG e EMG. Salve dados como planilhas do Microsoft Excel para análise e testes adicionais estatística.
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Representative Results
Como mostrado na Figura 2, um mouse equipado para optogenética estimulação e lactato / EEG / EMG dados foram submetidos à coleta de transições espontâneas sono / vigília do estado enquanto EEG, EMG e concentração de lactato cerebral foram monitorados continuamente. Corrente para o sensor de lactato aumentou durante os períodos de baixa amplitude do EEG e diminuiu durante os períodos de alta amplitude EEG. Como mostrado na Figura 3, ambos os canais de EEG são sensíveis a estímulos optogenética entregues no córtex frontal.
Figura 1. Uma representação) esquemática dos eletrodos cirurgicamente implantados EEG, sensor de lactato ea cânula para estimulação optogenética. B) Representação esquemática de todo o sistema experimental. Uma ligação, uma EEG. 2 chumbo, EEG 2. Gnd, parafuso de terra EEG. Ref, parafuso referência EEG.tp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/4328/4328fig1large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 2. Exemplo demonstra que a recolha de dados do animal e transferida para fora do sono, enquanto instrumentado para gravações utilizando a configuração do estímulo biossensor / optogenética visto na figura 1A. Estimulação optogenética não foi aplicada durante o intervalo mostrado aqui. Wake (W) e os dois subtipos de sono, o sono movimento rápido dos olhos (R) e não-rápido movimento dos olhos do sono (N) é definido com base no electroencefalograma (EEG) e o eletromiograma (EMG). Alta amplitude EMG acompanhado por baixa amplitude EEG define esteira. Baixa amplitude EMG acompanhado por baixa amplitude EEG define sono do movimento rápido dos olhos. Baixa amplitude EMG acompanhada por alta amplitude do EEG define non-rápido movimento dos olhos de sono. Lactatobiossensor corrente sobe como uma função da amplitude do EEG baixo (isto é., tanto durante a vigília e sono do movimento rápido dos olhos) e cai como uma função da amplitude do EEG de alta (isto é., durante o sono sem movimento rápido dos olhos).
Figura 3. Dados representativos a partir de animais sujeitos a estimulação optogenética a 1 Hz (A) ou 10 Hz (B) usando a configuração de estímulo biossensor / optogenética visto na figura 1A. Traços representam 60 seg gravações. A temporização de um intervalo de 30 segundos de estimulação está indicada no topo de cada painel. para ver figura maior .
| Estimulação frontal Relativa a Bregma (mm) | |||
| Formiga / Post | Lat | D / V | |
| EEG1 | 2,2 | 1,6 | - |
| EEG2 | 2,2 | -1,6 | - |
| Referência | -3,5 | -1,5 | - |
| Terreno | -3,5 | 1,5 | - |
| Cânula de lactato | 1,0 | 1,6 | -0,5 |
| Optogenética Cânula | 1,0 | -1,6 | -0,5 |
Tabela 1. Estereotáxica coordenadas de dispositivos implantados cirurgicamente.
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Discussion
Os métodos aqui apresentados permitem medir a relação entre o sono e as alterações na concentração do lactato cérebro intermediário glicolítico numa escala de tempo não era possível anteriormente. Animais sofrem transições espontâneas entre vigília, NREMS e REMS. Além disso, somos capazes de aplicar estímulos optogenética enquanto que os animais submetidos a estas transições. Os dados recolhidos até à data demonstram que tanto espontânea e induzida por ondas de impacto sobre a leitura de um biossensor baseado oxidase de lactato.
Pode-se construir sistemas experimentais semelhantes aos descritos aqui com equipamento e software a partir de outras fontes. As fontes alternativas de sistemas polissonográficos adequados para roedores incluem dados Sciences International 11, e Embla 12. Software para a classificação estado de sono está disponível a partir Somnologica 12, 13 e sono Registe Icelus 14. Biossensores amperométricos para medição de lactatoEstão disponíveis a partir de Quanteon 15. Para nosso conhecimento, Pinnacle Tecnologia oferece o único sistema em que biossensores, EEG e EMG pode ser medido em simultâneo com uma interface de software.
Nós medimos mudanças tanto na concentração de lactato e distal EEG para o local da estimulação optogenética. Efeitos da estimulação optogenética em tais locais distais confirma que optogenetically induzidos potenciais alterações são propagadas para além do local da estimulação. Pode-se medir estes parâmetros directamente dentro da área de córtex exposto à luz, mas a sua medição em outra parte assegura que as respostas são devidas a propagação das ondas, ao contrário de uma resposta artifactual do biossensor para a exposição à luz (como documentado 16). Optogenetically induzidas 1-Hz ondas são distintos de ondas lentas do sono em que eles não são sincronizados por subcorticais neurónios projectam. Como tal, elas não ocorrem na estereotipados relações temporais com outros relacionados com o sonofenómenos, tais como veios e complexos K-17. Se a estimulação optogenética imita outros efeitos naturais ondas lentas (como alterações na força sináptica 18 ou mudanças na atividade homeostáticos onda EEG lento 11) é incerto. Os métodos descritos aqui poderia ser usado para abordar esta questão em estudos futuros.
Os animais são amarrados por fios de ambos os transportadores biopotenciais de animal para computador e do cabo de fibra óptica que transmite a luz azul para o córtex cerebral. Ambos os sistemas sem fio EEG / bioanalyte gravação (http://pinnaclet.com/biosensor-recording-sys/fixed-frequency.html) e dispositivos wireless estimulação optogenética 19 foram relatados. No entanto, os dois não foram integrados em um único sistema a trabalhar para o nosso conhecimento. Apesar de o sistema de retenção associado com um cabo de amarrar, animais são frequentemente vistas em movimento em torno das suas gaiolas, e a quantidade de tempo gasto no sono é típico dos ratos estudados similar situações experimentais. Sensores compatíveis com este sistema estão disponíveis para a medição de outros bioanalytes, incluindo glucose e de glutamato. O sistema é, portanto, susceptíveis de serem úteis em outras situações em que o comportamento experimentais, as concentrações de EEG e bioanalyte são analisados.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Pesquisa financiada pelo Departamento de Defesa (Defense Advanced Research Projects Agency, Prêmio Faculdade Young, Grant Número N66001-09-1-2117) e NINDS (R15NS070734).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. | |||
References
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