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Neuroscience

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Published: December 19, 2012 doi: 10.3791/4328

Summary

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Abstract

Aunque el cerebro representa menos del 5% del cuerpo en masa, utiliza aproximadamente un cuarto de la glucosa utilizada por el cuerpo en reposo 1. La función del sueño no REM (NREMS), la mayor parte de sueño por el tiempo, es incierto. Sin embargo, una característica sobresaliente de NREMS es una reducción significativa en la tasa de utilización de la glucosa cerebral relativo a la vigilia 2-4. Esta y otras conclusiones han dado lugar a la creencia generalizada de que el sueño tiene una función relacionada con el metabolismo cerebral. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la reducción del metabolismo cerebral de la glucosa durante NREMS aún no se han dilucidado.

Un fenómeno asociado con NREMS que podrían afectar la tasa metabólica cerebral es la aparición de ondas lentas, oscilaciones en frecuencias de menos de 4 Hz, en el electroencefalograma 5,6. Estas ondas lentas detectadas en el nivel de la superficie del cráneo o cortical cerebral reflejar laoscilaciones de las neuronas subyacentes entre un estado despolariza / arriba y un estado hiperpolarizado / abajo 7. Durante el estado de abajo, las células no se someten a los potenciales de acción para los intervalos de hasta varios milisegundos cien. Restauración de los gradientes de concentración iónica posteriores a los potenciales de acción representa una carga significativa metabólico de la célula 8; ausencia de potenciales de acción durante los estados asociados a abajo NREMS pueden contribuir al metabolismo reducido en relación a despertar.

Dos retos técnicos que había que abordar para que esta relación hipotética a probar. En primer lugar, era necesario para medir el metabolismo glicolítico cerebral con una resolución temporal reflectante de la dinámica de la cerebral EEG (es decir, más de segundos en lugar de minutos). Para ello, se midió la concentración de lactato, el producto de la glicolisis aerobia, y por lo tanto, una lectura de la tasa de metabolismo de la glucosa en el cerebro de los ratones. El lactato fuemedido usando un sensor basado en lactato oxidasa tiempo real incorporado en la corteza frontal. El mecanismo de detección consta de un electrodo de platino-iridio, rodeado por una capa de moléculas de lactato oxidasa. Metabolismo de lactato por la lactato oxidasa produce peróxido de hidrógeno, que produce una corriente en el electrodo de platino-iridio. Así, un aumento gradual de la glucólisis cerebral proporciona un aumento en la concentración de sustrato para la lactato oxidasa, que a continuación se refleja en corriente aumentó en el electrodo sensor. Era necesario adicionalmente para medir estas variables, mientras que la manipulación de la excitabilidad de la corteza cerebral, a fin de aislar esta variable a partir de otras facetas de NREMS.

Hemos ideado un sistema experimental para la medición simultánea de la actividad neuronal a través de la elecetroencephalogram, medición de flujo glucolítico a través de un biosensor de lactato, y la manipulación de la actividad cerebral neuronal cortical través de la activación de optogenético PyraMIDAL neuronas. Hemos utilizado este sistema para documentar la relación entre el sueño relacionado con formas de onda electroencefalográfica y la dinámica de momento a momento de la concentración de lactato en la corteza cerebral. El protocolo puede ser útil para cualquier individuo interesado en estudiar, comportarse libremente en roedores, la relación entre la actividad neuronal medida a nivel electroencefalográfico y la energética celular en el cerebro.

Protocol

1. Preparación quirúrgica de Animales

1. Los sujetos experimentales

Utilice ratones de la B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J línea transgénica 9; tensión JAX # 7612) o los otros ratones que expresan el azul crepuscular canal catiónico, canalrodopsina-2, en las neuronas corticales cerebrales. La aplicación de luz azul a la corteza cerebral de la B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J línea transgénica provoca que las neuronas piramidales que expresan canalrodopsina-2 para despolarizar y se someten a los potenciales de acción 9,10. Como consecuencia de la activación de células piramidales, interneuronas locales se activan, y el cambio en el potencial se propaga a las neuronas más allá del sitio de estimulación 10. Realizar cirugía en condiciones estériles en la adhesión a las directrices reguladoras aplicables: autoclave herramientas quirúrgicas y softpacks (campo quirúrgico, gasas); caliente cordón esterilizar todos tolerantes al calor implantados dispositivos metálicos (cánulas, tornillos y cables)por 30-segundos; Desinfectar calor intolerantes a los productos implantables (cable de fibra óptica conector de plástico) con un dip de 10 segundos en etanol; golpe de cruce de etanol artículos seca mediante la aplicación de aire comprimido.

2. Anestesia, colocación estereotáxica y Liquidación de cráneo

Utilice el IMPAC 6 Integrada Paciente Multi (Vet Equip Inc) sistema para anestesiar el ratón. Utilice un 5% Isoflurane/95% de oxígeno para la inducción y el oxígeno del 3% Isoflurane/97% para el mantenimiento durante la cirugía. Colocar el animal sobre una manta de circulación de agua ajustado a 37 º C. No es necesario controlar la temperatura del cuerpo si la manta se mantiene a esta temperatura.

3. Preparación de la Calavera de Implantación

Prepare el sitio de la incisión por el afeitado todo piel de la parte superior del cráneo. El área de afeitado debe extenderse lateralmente de oreja a oreja y antero-posterior de los ojos con el extremo posterior del cráneo. Desinfecte la piel expuesta con tres CONSECUTIVOSe hisopos de Betadine seguido por etanol. Hacer una incisión medial en la parte superior del cráneo, de entre los ojos a la parte posterior del cráneo. Limpiar el cráneo con peróxido de hidrógeno y solución salina estéril (0,9% NaCl). Controlar la hemorragia con una herramienta de cauterización. Localizar y marcar bregma y lambda para determinar las coordenadas estereotáxica. Las coordenadas estereotáxicas para las configuraciones de los electrodos de estímulo / optogenético que hemos utilizados se presentan en la Tabla 1 y se muestra esquemáticamente en la Figura 1A.

4. Preparación de los lugares de implantación en el cráneo

Use un taladro dental de alta velocidad con una bola de 0,5 mm bit fresa para establecer cada sitio de implantación en el cráneo. Bisele el borde externo de cada hoyo con una bola de 0,7 mm poco fresa para facilitar la inserción del tornillo.

5. Inserción y fijación de cánulas, EMG conduce y conduce EEG

Inserte los tornillos de EEG (0,8 mm de longitud, con 2 cm de 3 sin recubrimiento0-medidor de cobre estañado autobús alambre pre-soldado a la cabeza del tornillo) en los orificios y los llevan en una mano con un destornillador ranurado revoluciones aproximadamente 4-5 para obtener la profundidad deseada. Mantenga cánulas guía en su lugar con un soporte de cánula estereotáxico y luego péguelas en el cráneo y anclajes con cemento acrílico. Cada cánula guía debe contener un maniquí de cánula / estilete (Plastics One, parte # C312 DC \ 1) desde el momento de la cirugía para el tiempo de experimentación (10-14 días) para mantener la permeabilidad.

6. Cierre del sitio quirúrgico

Una vez que los EEG y cánulas de guía se coloca en el cráneo, unirlos juntos con cemento acrílico dental (Dental Lang - Ortho-Jet cemento). Después de fraguar el cemento, colocar el conector de plástico (parte Pinnacle Tecnología # 8402) por encima del montículo de cemento seco. Soldar los extremos de los cables procedentes de derivaciones de EEG para los contactos del conector de plástico. Encajar los conectores del cable en el cemento. A continuación, dibuje los cables de EMG a través del músculo nucals deslizándolas en el barril de una aguja 21gA perforado a través del músculo. Ate un nudo de cirujano doble sutura de nylon 5-0 alrededor de estos cables justo distal a donde sale el músculo. Sutura de nuevo juntos de la piel que se retrae para acceder al tejido muscular con un solo cirujano nudos interrumpidas, con un retroceso de corte P-3 y 5-0 aguja de sutura de nylon.

7. Analgesia postoperatoria y recuperación

Administrar buprenorfina como analgésico (0,1 mg / kg, subcutánea) y flunixina meglumina (0,1 mg / kg, subcutánea) como un anti-inflamatorio inmediatamente después de la cirugía, y diariamente en los días 1-2 después de la cirugía. Deje que los animales puedan recuperarse en condiciones estándar de colonias de vivienda durante al menos siete días antes de la experimentación. Con ninguna atención adicional más allá de la vivienda de colonias estándar, las cánulas se puede esperar que permanecen patente durante al menos dos semanas, con los estiletes permanentes asegurado en su lugar. Sensores EEG y EMG también se puede esperar que retenerfuncionalidad de esta duración.

2. Generación de Pulsos de luz temporizado

1. Programación de la Unidad de Estímulo MC

Conecte la unidad MC-estímulo (Multi-Channel Systems) a través de una conexión USB a una computadora de escritorio. Utilice la hoja de cálculo similar a la interfaz de usuario MC-Estímulo para programar la unidad de Estímulo MC. Introduce el deseado TTL (lógica transistor-transistor) de tensión para el periodo en adelante, las duraciones de estímulo y fuera de períodos, el número de ciclos por segundo deseados, y el número total de ciclos repetidos para la sesión de estímulo entero. Para más detalles, véase el MC-Estímulo manual técnico:

3. Fabricación / Montaje de Fibra Óptica Probes para la prestación de Luz a la corteza cerebral

  1. Suministros y equipos necesarios se encuentran en: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
  2. Corte y pulido de los cables de fibra óptica. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. Asamblea del Sistema de Estimulación roedores optogenético

1. Interfaz de unidad MC-Estímulo y Laser

Una vez que la unidad MC-estímulo está programado, correr como un generador de señal independiente de un sistema binario de 5 voltios ON / OFF de la señal. Conecte la unidad MC-Estímulo a la unidad de potencia TTL enabled del láser con conectores BNC.

2. Producción de la salida láser a través de cable de fibra óptica

Utilice la pantalla digital y el dial variable de la potencia de salida de la unidad de potencia del láser en el manualLy ajustar la potencia de salida del láser. Conectar la unidad de potencia del láser en el láser a través de un cable de cinta. Conectar el conector hembra FC (férula de conector) adaptador de fibra del láser para el conector macho de FC en el cable de conexión de fibra óptica (una longitud de 3 m, 200 m de diámetro de fibra de vidrio recubierto de conducción en la luz que refleja acrilato de revestimiento de polímero).

3. Transmitir el láser para el animal: Conmutador giratorio

Conectar el cable de fibra óptica originario (3 m de longitud) y el cable de fibra óptica de entrega (45 cm de longitud) a los extremos opuestos de la junta óptica giratoria que encierra dos lentes (lentes de colimación dóricas). La fibra óptica de la junta rotativa sirve como un conmutador: como el animal se mueve alrededor de su jaula, la junta giratoria gira para evitar la rotura de los cables de fibra óptica. Use lazos de cable de plástico para fijar el conmutador, a un soporte metálico colocado por encima de la jaula cilíndrica en la que se aloja el animal.

4. Colocación de Entrega de fibra ópticaCable de Enfrentamientos

Prohibir al ratón con una sola mano a la clavija del ratón debajo de una palma ahuecada. Oriente la cabeza entre medio del experimentador y el dedo índice. Extraer la cánula de maniquí de la cánula guía colocada por la cánula de fibra óptica. Desactive la cánula guía de escombros con una aguja estéril 25GA. Inserte el cable de fibra óptica a mano y fijarlo a la cánula de fibra óptica de guía con una tapa roscada rescatado de una cánula maniquí. Controlar la profundidad de inserción del cable de fibra óptica en el cerebro mediante un nudo de sutura atada en el cable de fibra óptica a una distancia fija desde el extremo plano-troceados. El aparato experimental entera se muestra en la Figura 1B.

5. Medición del EEG del sueño definido y la concentración de lactato durante la estimulación optogenético

1. Precalibración del sensor de lactato

Pre-calibración del sensor de lactato se realiza con un in vitrokit (parte Pinnacle Tecnología # 7000-K1-T). El sensor se equilibra en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), luego se expuso a tres concentraciones de L-lactato de manera escalonada por los protocolos del fabricante.

2. La inserción del sensor de lactato y el cable EEG

Insertar el sensor de pre-calibrada en el cráneo montado en la cánula guía de lactato de una manera idéntica a la fibra óptica procedimiento de inserción de cable (sección 4,4). Conecte el sensor de lactato al preamplificador del Pinnacle 8.400 biosensor con conectores bipolares. Conecte este preamplificador en el conector de 8-pin en el headmount implantado quirúrgicamente.

3. El establecimiento de la intensidad del estímulo optogenético

Antes de recoger los datos, usar la intensidad del láser mando de control para ajustar la intensidad del estímulo optogenético. La amplitud de la respuesta del EEG varía en los animales, debido a factores que no se han estudiado de forma sistemática, una d debe ser verificada mediante inspección visual en el inicio de la estimulación. En la práctica, una intensidad de 80-120 μWatts típicamente producirá un incremento en la amplitud EEG de aproximadamente 50% en la frecuencia de estimulación. Post-hoc rápido análisis de Fourier de transformación (ver sección 5.5) es necesario cuantificar la magnitud absoluta de la respuesta.

4. Recopilación de datos

Recopilar datos utilizando el sistema Pinnacle 8400: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .

5. Procesamiento de Datos con Neuroscore

Clasificar los estados de suspensión por inspección visual de los datos de EEG y EMG con la interfaz Neuroscore (DataSciences, International: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) o la interfaz de Sirenia (Pinnacle Technology:f = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" target = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Los datos de proceso en diez segundos épocas como consecuencia, no rápido movimiento de los ojos de sueño, o sueño de movimientos oculares rápidos basados ​​en el EEG y EMG. Guardar datos en hojas de cálculo Microsoft Excel para análisis adicional y pruebas estadísticas.

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Representative Results

Como se muestra en la Figura 2, un ratón que disponga para la estimulación optogenético y lactato / EEG / EMG colección de datos se sometieron espontáneas de sueño / vigilia transiciones de estado mientras EEG, EMG y la concentración de lactato cerebral fueron monitoreados continuamente. Actual en el sensor de lactato se incrementó durante los períodos de baja amplitud EEG y disminuyó durante los períodos de alta amplitud EEG. Como se muestra en la Figura 3, ambos canales de la EEG son sensibles a los estímulos optogenético entregados en la corteza frontal.

Figura 1
Figura 1. A) Representación esquemática de los electrodos implantados quirúrgicamente EEG, sensor de lactato y cánula para la estimulación optogenético. B) Representación esquemática del sistema experimental. 1, plomo EEG 1. 2, el plomo EEG 2. GND, tornillo de tierra EEG. Ref, tornillo referencia EEG.tp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/4328/4328fig1large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.

Figura 2
Figura 2. Ejemplo de recopilación de datos demuestra que el animal la transición en y fuera del sueño mientras instrumentado para grabaciones utilizando la configuración del estímulo biosensor / optogenético ve en la Figura 1A. Estimulación optogenético no se aplicó durante el intervalo que se muestra aquí. Wake (W) y los dos subtipos de sueño, el sueño de movimientos oculares rápidos (R) y no rápido del sueño de movimientos oculares (N) se definen con base en el electroencefalograma (EEG) y el electromiograma (EMG). Mayor amplitud EMG acompañado de amplitud EEG bajo define la estela. Bajo EMG amplitud acompañada de baja amplitud EEG define el sueño de movimientos oculares rápidos. Bajo EMG amplitud acompañada de gran amplitud EEG define no rápido movimiento de los ojos de sueño. Lactatobiosensores corriente aumenta como una función de la amplitud baja del EEG (es decir., tanto durante la vigilia y el sueño de movimientos oculares rápidos) y cae como una función de la amplitud de alta EEG (es decir., durante el sueño no rápido movimiento de los ojos).

Figura 3
Figura 3. Los datos representativos de los animales sometidos a la estimulación optogenético a 1 Hz (A) o Hz 10 (B) utilizando la configuración del estímulo biosensor / optogenético ve en la Figura 1A. Las huellas representan 60-seg grabaciones. El momento de un intervalo de 30 segundos de estimulación se indica en la parte superior de cada panel. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Frontal-estimulación relativa a Bregma (mm)
Ant / Post Latitud D / V
EEG1 2.2 1.6 -
EEG2 2.2 -1,6 -
Referencia -3,5 -1,5 -
Suelo -3,5 1,5 -
Cánula de lactato 1.0 1.6 -0,5
Optogenético Cánula 1.0 -1,6 -0,5

Tabla 1. Estereotáxica coordenadas de dispositivos implantados quirúrgicamente.

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Discussion

Los métodos aquí presentados permiten medir la relación entre el sueño y los cambios en la concentración cerebral de la lactato intermediario glicolítico en una escala de tiempo no era posible anteriormente. Los animales experimentan transiciones espontáneas entre vigilia, NREMS y REMS. Además, estamos en condiciones de aplicar estímulos optogenético mientras que los animales se someten a estas transiciones. Los datos recogidos hasta la fecha demuestran que las ondas de impacto tanto espontánea e inducida en la lectura de un lactato oxidasa basado biosensor.

Se podría construir sistemas experimentales similares a la descrita aquí con equipos y software de otras fuentes. Las fuentes alternativas de sistemas adecuados para los roedores polisomnográficos incluyen Data Sciences International 11, 12 y Embla. Software para la clasificación del estado de sueño está disponible en Somnologica 12, 13 y sueño Regístrate Icelus 14. Biosensores amperométricos para la medición de lactatoestán disponibles a partir de Quanteon 15. Para nuestro conocimiento, Pinnacle Technology ofrece el único sistema en el que los biosensores, EEG y EMG se pueden medir simultáneamente con interfaz de software.

Se han medido los cambios tanto en la concentración de lactato y el EEG distal al sitio de la estimulación optogenético. Efectos de la estimulación optogenético en tales sitios distales confirma que optogenetically cambios inducidos potenciales se propagan más allá del sitio de estimulación. Se podría medir estos parámetros directamente en el área de la corteza expuesta a la luz, pero la medición a otra parte asegura que las respuestas se deben a la propagación de la onda, en contraposición a una respuesta artifactual del biosensor a exposición a la luz (como se documenta 16). Optogenetically inducidas por 1-Hz ondas son distintas de las ondas lentas del sueño en que no están sincronizados por subcorticales neuronas que se proyectan. Como tales, no se producen en estereotipados relaciones temporales con otro relacionado con el sueñofenómenos, tales como husillos y complejos K 17. Si la estimulación optogenético imita otros efectos naturales de ondas lentas (tales como cambios en la fuerza sináptica de 18 cambios homeostáticos en la actividad EEG de ondas lentas 11) es incierto. Los métodos descritos aquí se podrían utilizar para abordar esta cuestión en futuros estudios.

Los animales se encadenan por tanto los cables de transporte biopotenciales del animal al ordenador y el cable de fibra óptica que transmite la luz azul en la corteza cerebral. Ambos inalámbricos EEG / bioanalyte sistemas de registro (http://pinnaclet.com/biosensor-recording-sys/fixed-frequency.html) y dispositivos inalámbricos de estimulación optogenético 19 han sido reportados. Sin embargo, los dos no se han integrado en un único sistema de trabajo a nuestro conocimiento. A pesar de la restricción asociada con un cable de anclaje, los animales se observan frecuentemente en movimiento alrededor de sus jaulas, y la cantidad de tiempo gastado dormido es típico de los ratones estudiados en similar situaciones experimentales. Sensores compatibles con este sistema están disponibles para la medición de bioanalytes otros, incluyendo glucosa y glutamato. El sistema es por lo tanto probable que sea útil en otras situaciones experimentales en las que el comportamiento, las concentraciones de EEG y bioanalyte se analizan.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

La investigación financiada por el Departamento de Defensa (Defense Advanced Research Projects Agency, Premio Facultad Young, número de concesión N66001-09-1-2117) y NINDS (R15NS070734).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BASi Mouse Guide Cannula Pinnacle Technology/BASi Inc 7032
Lactate Biosensor Pinnacle Technology 7004
Head Mount Pinnacle Technology 8402
Sleep/Biosensor Recording system Pinnacle Technology 8400-K1-SL 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor
Tethered Mouse in-vitro Calibration kit Pinnacle Technology 7000-K1-T
Fiber Optic Guide Cannula Plastics One C312G 21 Gauge Guide Cannula
Dummy Cannula Plastics One C312DC 21 Gauge Dummy
Diamond Fiber Scribe Thorlabs S90W
Fiber Connector Crimp Tool Thorlabs CT042
Furcation Tubing Thorlabs FT030 03.0 mm
Thorlabs T10S13 Max Dia. 0.012
Furcation Tube Stripper Thorlabs FTS3
Bare Hard Cladding Multimode Fiber Thorlabs BFL37-200 200 μm Core, 0.37 NA
Wire Snips/Kevlar Shears Thorlabs T865
Fiber Optic Epoxy Thorlabs F112
Fiber Stripper Tool Thorlabs
Glass Polishing Plate Thorlabs CTG913
Rubber Polishing Pad Thorlabs NRS913
Eye Loupe Thorlabs JEL10
Kim Wipes Thorlabs KW32
Compressed Air Thorlabs CA3
Polishing Puck Thorlabs D50-xx
Fiber Inspection scope Thorlabs CL-200
Polishing Films Thorlabs LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P
FC/PC connector end Thorlabs 30126G2-240 240 μm Bore, SS Ferrule
MC Stimulus Unit Multi-Channel Systems STG-4002
MC Stimulus Software Multi-Channel Systems MC-Stimulus V 2.1.5
Blue Laser CrystaLaser CL473-050-0
Laser Power supply CrystaLaser CL2005
Fiber Optic Rotary Joint Doric Lenses FRJ-v4
Table 2. Supplies and equipment.

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References

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Clegern, W. C., Moore, M. E.,More

Clegern, W. C., Moore, M. E., Schmidt, M. A., Wisor, J. Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (70), e4328, doi:10.3791/4328 (2012).

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