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Biology

Transmissão de vírus de plantas Usando Whiteflies

doi: 10.3791/4332 Published: November 8, 2013

Summary

Melhorar a nossa compreensão e nossa capacidade de gerir muitos dos vírus de plantas a insetos transmitidas requer o uso do vetor. Insecto de transmissão de vírus de plantas é uma interacção tritrófica, e como tal requer a manipulação de insetos, vírus e vegetais. Vectores deve ser criado em grandes números e manipulado de tal forma que para assegurar altas taxas de transmissão para as plantas de teste. As noções básicas de criação e manipulação de mosca-branca,

Abstract

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, um complexo de espécies morfologicamente indistinquishable 5, são vetores de muitos vírus de plantas. Vários gêneros destes vírus de plantas mosca-transmissíveis (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) incluem várias centenas de espécies de patógenos emergentes e economicamente significativas de importantes culturas alimentares e de fibra (revisado por 9,10,16). Estes vírus não se replicam no seu vector, mas, no entanto, são facilmente movido de planta para planta por mosca adulta por diversos meios (revisto por 2,6,7,9,10,11,17). Para a maioria desses vírus alimentação mosca branca é necessária para a aquisição e inoculação, enquanto que para outros é necessário apenas sondagem. Muitos desses vírus são incapazes ou não pode ser facilmente transmitida por outros meios. Portanto, a manutenção de culturas de vírus biológicos e caracterização molecular (identificação de gama de hospedeiros e sintomas) 3,13, Ecologia 2,12, exigem que os vírus ser transmitidos para hospedeiros experimentais utilizando o vector mosca branca. Além disso, o desenvolvimento de novas abordagens para a gestão, tais como a avaliação de novos produtos químicos ou compostos 14 15, novas abordagens culturais 1,4,19, ou a selecção e o desenvolvimento de cultivares resistentes 7,8,18, requer o uso de moscas-brancas para transmissão do vírus. O uso de transmissão de vírus de plantas mosca branca para a seleção e desenvolvimento de cultivares resistentes em programas de melhoramento é particularmente difícil 7. Selecção e rastreio eficaz para a resistência emprega um grande número de plantas e há uma necessidade de 100% das plantas a serem inoculadas, a fim de encontrar os genótipos que alguns possuem genes de resistência. Estes estudos utilizam um grande número de moscas brancas virulíferos, muitas vezes, várias vezes por ano.

Manutenção mosca branca descrita aqui pode gerar centenas ou milharesadultos de mosca branca em plantas de cada semana, durante todo o ano, sem a contaminação de outros vírus de plantas. Plantas livres de ambas as moscas brancas e vírus devem ser produzidos para introduzir na colônia mosca branca a cada semana. Mosca branca culturas devem ser mantidas livres de patógenos mosca-branca, parasitas e parasitóides que podem reduzir as populações de mosca-branca e / ou reduzir a eficiência de transmissão do vírus. As colónias produzidas do modo descrito pode ser dimensionada para rapidamente aumentar ou diminuir o número da população, conforme necessário, e pode ser ajustado para acomodar as preferências alimentares da mosca branca com base na planta hospedeira do vírus.

Existem dois tipos básicos de colônias de mosca branca que podem ser mantidas: uma nonviruliferous e uma colônia mosca virulíferos. A colónia nonviruliferous é composto de moscas-brancas mantidas em plantas sem vírus e permite a disponibilidade semanal de moscas-brancas, que podem ser usados ​​para transmitir os vírus a partir de culturas diferentes. A colônia mosca virulíferos,composto de moscas-brancas mantidas em plantas infectadas por vírus, permite a disponibilidade semanal de moscas-brancas que tenham adquirido o vírus omitindo, assim, um passo no processo de transmissão de vírus.

Protocol

1. Mosca branca manutenção da colônia

  1. Condições ambientais: colônias de mosca branca deve ser mantido em sala de crescimento controlado. Controlo de humidade relativa, a temperatura, fotoperíodo, e a intensidade da luz são essenciais para o crescimento óptimo de colónias (Figura 1). A temperatura de 28 ° C, 30-50% de umidade relativa e fotoperíodo de 14 h trará uma colônia que se desenvolve desde o ovo até a emergência dos adultos em 18 dias (este tempo varia de acordo com a planta hospedeira). Humidade relativa deve ser mantida abaixo de 70% para evitar o crescimento de insectos e fungos patogénicos de plantas. Doses de fertilizantes e rega deve ser reduzida para desencorajar fungos e acúmulo de sal. A intensidade da luz para a colónia deve ser bastante elevada. VHO lâmpadas fluorescentes usadas em número suficiente para gerar cerca de 800-1.000 velas pé na altura do dossel são adequados para a maioria das plantas (ou seja, de algodão., Feijão comum, feijão-fava, tomate). A limpeza é essencialuma colônia da mosca-branca para manter as condições ideais de criação.
  2. Gaiolas Colony: Whiteflies deve ser mantida em plantas em gaiolas, em vez de grátis na sala de crescimento. As gaiolas podem ser construídas com diversos materiais, mas deve permitir: a ventilação, a facilidade de acesso, a capacidade para impedir a fuga ou mosca branca da infiltração, e de tamanho suficiente para manter as plantas suficientes para gerar a população de mosca branca for necessário. Bons resultados têm sido obtidos com organza mais rastreio de alumínio (para a força), bem como à prova de rastreio mosca branca (ver tabela de equipamento e material específico).
  3. Colônia Planta Preparação: As espécies de plantas selecionadas é uma consideração importante quando se inicia uma colônia mosca branca. A planta deve ser capaz de suportar uma população de alto inseto sem entrar em colapso. A fábrica escolhida para uma colónia nonviruliferous deve ser um não hospedeiras do vírus ou vírus que se destinam a ser transmitidas para evitar a contaminação da colónia e se manter um virulicolónia ferous, deve ser hospedeiro do vírus. As plantas devem crescer rapidamente para apoiar a emergência de novos adultos dentro de 18 dias após terem sido introduzidos na colônia, mas não tão rapidamente como para superar as gaiolas dentro de quatro semanas. Anão, arbusto, ou do tipo pátio cultivares vegetais são recomendados, pois muitas vezes produzir uma área foliar semelhante a cultivares mais altos, mas sem o alongamento do colmo.
  4. É muito importante para as plantas traseiras para a colônia em estufas em gaiolas que excluem mosca branca e outros insetos. Uso de plantas que estão infestados com moscas brancas, tripes e ácaros antes de entrar na colônia pode causar a colônia em colapso. Plantas infestadas também têm o potencial de ser infectado com vírus por insetos que irá interferir com os estudos de transmissão de vírus.

2. Mosca branca Estabelecimento Colony

  1. Iniciar uma colônia pela primeira vez usando whiteflies limpas - mais livre de vírus de plantas, outros insetos e patógenos de insetos. Estes podem ser obtidosde colaboradores ou no campo. Se o campo coletados, whiteflies devem ser criados durante pelo menos 8 semanas em plantas não hospedeiras do vírus da planta, e verificar se há ausência de sintomas de plantas para ter certeza de que eles estão livres de vírus de plantas.
  2. Semana 1: Introduzir a mosca branca limpa para o primeiro compartimento de plantas. Moscas brancas pode ser introduzido por aspiração de números conhecidos ou agitando a mosca branca de outra planta fonte, dependendo das exigências para a colónia. Durante uma semana, moscas-brancas, que são ovos no lado inferior da superfície das folhas da planta. Um tamanho aproximado da população pode ser previsto para cada emergência com base no número de adultos utilizados para colocar ovos eo número médio de ovos postos pela mosca fêmea na planta hospedeira em questão.
  3. Semana 2: Comece outra gaiola, introduzindo whiteflies a novas plantas hospedeiras para botar ovos. As plantas na gaiola iniciados na semana 1 terá ovos, imaturos e alguns whiteflies cobrindo a parte inferior das folhas (Figura 2). Algunswhiteflies adultos introduzidos durante uma semana ainda estarão vivos.
  4. Semana 3: Comece uma terceira gaiola, introduzindo whiteflies às novas instalações para botar ovos. As plantas na gaiola iniciado na semana 1 terá imaturos, bem como muitas novas moscas brancas adultas emergentes e deve haver um aumento bastante perceptível na população adulta mosca branca. As plantas na gaiola iniciados na semana 2 terá muitos ovos e moscas brancas imaturas que cobrem a parte inferior das folhas.
  5. Semana 4: Comece quarto gaiola, introduzindo whiteflies às novas instalações para botar ovos. As plantas na gaiola iniciados na semana 1 terá muitas moscas brancas adultas, que são aproximadamente, uma semana pós-emergência. As plantas na gaiola iniciados na semana 2 terá muitas novas moscas brancas adultas emergentes e deve haver um aumento bastante perceptível na população de mosca-branca. As plantas na gaiola iniciados durante a semana de 3 terá muitos ovos e moscas brancas imaturas que cobrem a parte inferior das folhas.
  6. Weekly após o primeiro 4 weeKS: A cada semana, começar uma nova gaiola, introduzindo os whiteflies adultos a partir do quarto gaiola mais antiga (a gaiola começou na 1 ª semana) para novas usinas em uma nova gaiola, limpo. A velha gaiola deve ser removida e suas plantas descartadas. Estas moscas brancas são de cerca de 1 semana de pós-emergência. No caso da colónia viróticas, estas moscas brancas vai transmitir o vírus para as plantas novas, assim como põem ovos para a próxima geração de moscas-brancas.
  7. Experimentos de transmissão planeja usar o whiteflies que surgirão na gaiola da terceira semana. Se forem necessários mais moscas-brancas, números de plantas pode ser aumentada e mais moscas brancas podem ser adicionadas para a gaiola 1 semana para aumentar a população de mosca branca.

3. Método para inoculação de plantas de teste

  1. Para garantir altas taxas de transmissão: 1) Whiteflies devem ser tratados o mais suavemente possível, para evitar danos ao inseto que irá reduzir as taxas de transmissão, 2) Deve haver área foliar adequada disponível para whiteflies a EITela sonda ou feed. Um aumento no tempo de aquisição ou um aumento do número de plantas hospedeiras de aquisição pode aumentar taxas baixas de infecciosidade em plantas de ensaio, devido à aglomeração quer na aquisição ou o período de acesso à inoculação.
  2. Coleção de Whiteflies. Segue-se um procedimento para a coleta e movimentação de números precisos de whiteflies necessários para fins experimentais. Para movimentar um grande número de moscas-brancas, como é necessário para o rastreio de resistência, por exemplo, só é necessário agitar suavemente as plantas infestadas de mosca branca sobre as plantas de ensaio ou os hospedeiros de aquisição infectadas por vírus (e mais tarde as plantas em ensaio). Certifique-se de agitar as plantas ao longo de muitos locais para minimizar os efeitos de agregação.
  3. Recentemente surgiu whiteflies adultos (1-3 dias após a emergência) são altamente ativo e alimentar muitas vezes por isso tendem a dar as mais altas taxas de transmissão de 4. Whiteflies mais velhos continuam a transmitir, mas com uma frequência menor. Vários whiteflies por planta teste (15-40 por plant) deve ser usado para elevadas taxas de transmissão, desde uma relação de uma infestação por planta muitas vezes resulta em baixas taxas de transmissão de 3,4 inaceitavelmente. O número necessário dependerá do vírus e as espécies de aquisição e plantas de teste.
  4. Montar dispositivos de aspiração e frascos de coleta. (Figura 3)
  5. Com uma mão, segure um cartão amarelo de plástico dentro da gaiola de colônia que contém os whiteflies a ser coletado. Bata levemente as plantas para incentivar os whiteflies adultos a voar. Whiteflies serão atraídos para o cartão amarelo e vai voar a partir da planta para o cartão onde podem ser coletados por meio de um aspirador e um sopro muito suave. Nunca aspirar whiteflies que se alimentam de plantas. Os estiletes estão embutidos na planta, enquanto a alimentação para puxá-los fora das plantas vai quebrar seus estiletes e tornando-os incapazes, quer adquirir ou transmitir o vírus (Figura 4).
  6. Coletar cerca de 20 whiteflies adultos em um único colleç ã o frasco para minimizar os danos físicos aos insectos a partir de aspirações repetidas (Figura 5).
  7. Para alterar o frasco de coleta, bata suavemente o frasco sobre uma superfície dura e tampa com Parafilm enquanto as moscas brancas estão desorientados com a batida.
  8. Coloque uma nova coleta em frasco aspirador e repetir até que o número de moscas brancas necessários são coletados. Moscas brancas podem permanecer nos frascos de recolha, à temperatura ambiente durante várias horas.
  9. Aquisição. Whiteflies são colocados sobre uma planta infectada de vírus e permitida a alimentação nas plantas infectadas durante 48-72 horas. Períodos de aquisição de mais de 72 horas, geralmente, não aumentar as taxas de transmissão. Para os vírus transmitidos de uma forma não persistente ou semipersistent, 1 hora e várias horas, respectivamente, são suficientes períodos de acesso de aquisição (Tabela 1). Os melhores resultados são obtidos quando whiteflies têm acesso livre às plantas em gaiolas que confinam os insetos para uma única planta ouvárias plantas. No entanto, algumas experiências requerem aquisição de folhas específicos em que as gaiolas grampo caso podem ser utilizados. Quando usando gaiolas grampo é importante para acomodar as preferências de alimentação mosca branca para a parte inferior das folhas. Além disso, a aglomeração de moscas brancas em gaiolas clipe pode reduzir as taxas de transmissão - as taxas aceitáveis ​​de transmissão foram obtidos por meio de 10 whiteflies femininos por clip gaiola de 2,5 cm de diâmetro.
  10. Inoculação. Prepara-se uma gaiola apropriada para o tamanho da inoculação e colocar as plantas de teste no interior. Se apenas uma planta deve ser inoculado considerar uma única gaiola planta. Se mais de uma planta deve ser inoculado considerar um pequeno quadro / organza saco gaiola PVC ou uma gaiola de alumínio (Figura 6). O tamanho da gaiola utilizada para inoculação deve ser ligeiramente maior do tamanho da planta (s) a ser inoculado. Maiores taxas de transmissão são obtidos quando whiteflies são mantidos perto da copa da planta e não ter dado um monte de espaço livre.
  11. Recolha de moscas-brancas a partir de hospedeiros de aquisição depende as necessidades da experiência. Se forem necessárias pequenas quantidades, aspirar a mosca branca, como descrito acima. Colocar os frascos de recolha de moscas-brancas no interior da gaiola próxima das plantas e remover a tampa (Figura 7). Abra o frasco e liberar as moscas brancas ou inverter e bater levemente o frasco para libertar as moscas brancas. Se for necessário um grande número simplesmente mover as plantas de aquisição de mosca branca nas gaiolas onde as plantas de teste estão localizados e agitar suavemente as moscas brancas fora da planta hospedeira aquisição. Para ambos os tipos de apresentação, certifique-se de distribuir os whiteflies através das plantas para minimizar a agregação e garantir uma inoculação uniforme.
  12. Permitir que as moscas-brancas para sondar ou alimentar para a quantidade de tempo adequado, novamente dependente do vírus e, em certa medida, a planta hospedeira (Tabela 1).
  13. Verifique as whiteflies pelo menos uma vez durante o período de acesso à inoculação para assegurar que são moscas brancassondagem ou alimentação através da abertura da gaiola e virar algumas folhas em cada planta.
  14. Para os períodos de acesso à inoculação mais, perturbar as plantas delicadamente (usando uma vara de bambu ou equivalente) para escovar os topos das plantas e incentivar os whiteflies redistribuir nas plantas. Redistribuição de whiteflies ajuda a garantir uma taxa de transmissão mais elevada por contrariar a tendência natural da mosca branca para agregar.
  15. Rescisão. O período de acesso à inoculação terminou por matar as moscas brancas com produtos químicos aprovados. Aplicar duas inseticidas um após o outro: um inseticida de contato para encerrar rapidamente whiteflies de adultos e um inseticida sistêmico de rescindir quaisquer whiteflies que se desenvolvem nas semanas seguintes e os perdeu pelo inseticida de contato (Figura 8). Um inseticida de contato como sabão inseticida e inseticidas sistêmicos, como imidacloprid ou pimetrozine têm sido utilizados, com sucesso.

Representative Results

Estes métodos para a criação de mosca-branca das colónias e manutenção, bem como manipulação para transmitir vírus de plantas têm sido utilizados com sucesso em vários estudos 4,11,12,14, bem como muitas outras que não citados. Usando estes métodos com os vírus persistentemente transmitidos, temos obtidos rotineiramente as taxas desejadas de transmissão de 100% para a selecção para a resistência, o rastreio insecticidas à sua capacidade para interferir com a transmissão (e avaliação de compostos indutores de resistência) 13,14,17,18 ( Figura 9). Os procedimentos descritos aqui podem e têm sido ser adaptado a muitos locais em instalações públicas e privadas de pesquisa.

Tipo de Transmissão Aquisição Período de Acesso (hora) Inoculação Período de Acesso (hora) Ref.
Nonpersistent 1 2-24 10
Semipersistent 6-24 8-24 10, 16
Persistente 48-72 48-72 3, 6, 8, 9

Tabela 1. Vezes estimados que podem ser usados ​​para produzir elevadas taxas de transmissão de vírus, com diferentes tipos de relações com as suas espécies vector Bemisia tabaci complexos. Vezes estimados baseiam publicados tempos mínimos necessários para a transmissão de 80-100% e, em alguns casos modificado para explicar os períodos latentes e as diferenças entre as populações de mosca-branca, vírus e plantas hospedeiras.

Figura 1
Figura 1. Um exemplo de uma colônia mosca virulíferos. Esta sala de crescimento contém gaiolas de plantas infectadas com a begomovírus e inferioridadested com virulíferos whiteflies.

Figura 2
Figura 2. Esquerda: estágios imaturos da mosca branca, Bemisia tabaci MEAM clade sensu De Barro 6 de aproximadamente 1 semana pós-emergência e Direito: um adulto da mosca-branca, um vetor eficaz de muitos vírus de plantas.

Figura 3
Figura 3. Os tipos de dispositivos de recolha, que pode ser usado para recolher a mosca branca para a transmissão de vírus de plantas.

Figura 4
Figura 4. Esquerda: cartão de plástico amarelo usado para coletar adultos de mosca-branca mostrando whiteflies pronto para a coleta . Direita: Coleta whiteflies de um cartão de plástico amarelo. Moscas brancas pode ser visto no cartão, como pequenos pontos brancos / cinza.

Figura 5
Figura 5. Whiteflies colhidas através de punção (20 em um frasco) da colônia pronto para qualquer aquisição ou inoculação.

Figura 6
Figura 6. Superior Esquerdo:. Gaiolas única usina utilizados tanto para aquisição ou inoculação superior direito: gaiolas maiores feitos de tubos de pvc e organza. Inferior: alumínio / tela e organdi gaiolas em uma estufa com plantas destinadas à colônia mosca branca.

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Figura 7. Whiteflies ser transferido para uma única usina para a inoculação (ou aquisição).

Figura 8
Figura 8. A adição de um inseticida sistêmico encharcar de encerrar o período de acesso à inoculação da mosca-branca.

Figura 9
Figura 9. Plantas de campo sob avaliação para resistência ao Tomato yellow leaf curl virus. Todas as plantas foram inoculadas em 5 semanas de idade mudas e depois transplantadas para o campo para avaliação. Plantas em primeiro plano são uma linha de germoplasma resistente, plantas no fundo são a linha de germoplasma suscetíveis.

Discussion

Os métodos aqui descritos foram desenvolvidos ao longo de um período de duas décadas e são baseadas na informação básica é fornecida por diversos estudos de transmissão de mosca branca, o comportamento ea biologia. Uma vez que existem muitas publicações, este manuscrito refere-se principalmente a revisões e algumas publicações específicas selecionadas para ilustrar o tipo de dados usados ​​para desenvolver esta técnica. É muito importante neste processo que as moscas-brancas são manuseados com cuidado uma vez que quebra das pernas e antenas pode levar a comportamentos anormais e menores taxas de transmissão. Arrecadação com aspiradores e outros dispositivos de sucção mecânica nunca produziu bons resultados. Outra consideração para o sucesso é que o número de moscas-brancas utilizadas para a obtenção de 100% de transmissão para as plantas de teste, tem de ser determinado para cada combinação de hospedeiro e vírus de plantas. Esta proporção ideal só precisa ser estabelecida uma vez. Os melhores resultados foram obtidos utilizando a mosca branca adultos jovens (1-3 dias após a emergência), uma vez que ótive as maiores taxas de transmissão. Os adultos mais velhos podem ser usados, mas um maior número de moscas brancas serão necessários para compensar as suas taxas reduzidas de transmissão. As fêmeas são conhecidos por transmitir a taxas mais elevadas do que os homens, já que eles se alimentam mais vezes do que os machos. No entanto, geralmente não vale a pena o tempo para separar os sexos para a transmissão. Este procedimento pode ser modificada de diversas maneiras de acordo com os recursos e as necessidades do pesquisador.

Quando se trabalha com vários vírus, é melhor manter uma única colônia de whiteflies criados em plantas não hospedeiras do vírus. Estas moscas brancas podem ser recolhidos colocados em plantas infectadas por virus para a aquisição e, em seguida, após a aquisição das moscas brancas pode ser movido de novo para as plantas de teste. As plantas para a colónia devem ser cultivados em estufas em jaulas para impedir a introdução de moscas-brancas, que podem infectar os com um outro vírus. Infestação destas plantas com ácaros, tripes e outras pragas de plantas pode comprometer a haúde da colônia e fazer com que ele entre em colapso. Finalmente rega das plantas colônia tem que ser feito com cuidado. Estas plantas estão sujeitas a stress extremo pela alimentação de tantas moscas brancas e as mais baixas do que as condições normais de luz. Raiz podre fungos que são introduzidos na turfa nas misturas sem solo pode se tornar um problema se as plantas são overwatered sequer uma vez. O pré-tratamento das plantas com um fungicida encharcar pode eliminar alguns dos problemas.

Enquanto a transmissão mosca branca de vírus de plantas pode ser demorado e requerer recursos valiosos (tais como salas de crescimento) é essencial para a transmissão de alguns vírus para o qual não temos outro meio de transmissão. É também um meio valioso para plantas de rastreio de resistência a vírus, uma vez que utiliza o mesmo tipo de transmissão do que as plantas no campo será esperado para resistir. A utilização de meios mais artificiais de transmissão nem sempre produzir os melhores resultados nas avaliações de germoplasma para virus-resistência.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Item Company Catalogue No. Comments (optional)
Whitefly proof screening Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel --- BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen
Whitefly proof screening Hummert International (www.hummert.com) 27-4050-1 - 27-4062-1 BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen
Whitefly Collection Devices BioQuip 1135A Can also be made using eye droppers, flexible plastic tubing, plastic vacuum adaptors, and cheesecloth
Collection vials BioQuip 8909 Vials used depend on which aspirator is used.
Yellow plastic cards any company --- Any bright yellow plastic card will work, can be purchased in many places.
Whitefly Cages --- --- These are not commercially available and must be constructed. 60 cm x 60 cm x 60 cm cages work well for us. Our preference is for those constructed of aluminum window screening, nylon organdy, vinyl plastic, with a structure created using aluminum window frames. Doors are attached using piano hinges and sealed with weather stripping; tops of the cages are vinyl plastic. Cages can also be made of 1) plexiglass glued together on the edges with ventilation provided by screened openings cut on the side pieces; 2) large bags of nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening with internal supports provided by PVC pipes and fittings cut to desired lengths and assembled inside the bags, 3) wood frames and nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening.

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References

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