Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

发射使用粉虱的植物病毒

doi: 10.3791/4332 Published: November 8, 2013

Summary

提高我们的理解和我们的能力来管理许多昆虫传播植物病毒需要使用的向量。昆虫传播植物病毒是一种营养层相互作用,因此需要操纵的昆虫病毒和植物。向量必须大量饲养和操作,在这样一种方式,以保证的高速率传输到试验植物。的基本饲养和操纵粉虱,

Abstract

粉虱, 半翅目:粉虱,烟粉虱 ,一个复杂的形态indistinquishable的5种,是许多植物病毒载体。这些粉虱传播植物的病毒(Carlavirus菜豆金色花叶病毒,Crinivirus,Ipomovirus,Torradovirus)的几个属新兴经济重要的粮食和纤维作物(审阅9,10,16)的重要病原体,包括几百种。这些病毒不复制,但在他们的矢量移动容易从工厂到工厂通过各种手段(2,6,7,9,10,11,17审阅)成人粉虱。对于大多数粉虱取食这些病毒收购和接种需要,而对于其他人只需要探测。许多这些病毒是不能或不能容易地以其他方式传送。因此,维护病毒培养,生物和分子鉴定(鉴定寄主范围和症状)3,132,12,生态,需要被发送到该病毒实验主机使用粉虱向量。此外,开发新的管理方式,如评估新的化学品1415日 ,新的文化方法1,4,19,或抗病品种的选择和发展的7,8,18,需要使用粉虱病毒的传播。粉虱传播植物病毒的抗病品种的选择和发展育种计划的使用尤其具有挑战性有效电阻的选择和筛选采用大量的植物,有必要为100%的接种的植物,以便找到具有抗性基因的少数基因型。这些研究使用大量带毒粉虱,通常每年数次。

在这里可以产生数百或数千白粉虱维修成人粉虱的植物,每星期,一年四季,没有其他植物病毒的污染。必须引入粉虱菌落每星期免费粉虱和病毒的植物。粉虱文化必须保持烟粉虱的病原体,寄生虫,寄​​生蜂,可以降低烟粉虱种群和/或减少病毒的传输效率。描述的方式产生的菌落,可以快速缩放以增加或减少人口数量根据需要,可以进行调整,以容纳进给的喜好的粉虱基于病毒的植物宿主中。

有两种基本类型的的粉虱菌落,可以保持:nonviruliferous和带毒粉虱集落。该nonviruliferous集落是由饲养无病毒植物的烟粉虱,粉虱,可用于发送来自不同文化的病毒可以每周可用的。带毒粉虱殖民地,由病毒感染的植物饲养粉虱,允许每周可用性粉虱爱滋病病毒感染者,从而省略病毒传播过程中的一个步骤。

Protocol

1。白粉虱殖民地维护

  1. 环境条件:白粉虱的殖民地应保持受控生长室。相对湿度,温度,光周期,光强度的控制是必不可少的,以获得最佳的集落生长( 图1)。温度28℃,相对湿度30-50%,和一个14小时的光照将产生一个殖民地,从卵到成虫羽化18天(这个时间随植物宿主)发展。阻止昆虫和植物病原真菌的生长,相对湿度应保持在70%以下。必须减少化肥和浇水,阻止真菌病原体和积盐。应该是相当高的光强度为殖民地。 VHO荧光灯灯泡产生足够数量的树冠高度约800-1000英尺烛光是足够的大多数植物( 棉花,菜豆,利马豆,番茄)。清洁是必不可少的烟粉虱的殖民地,以保持最佳的饲养条件。
  2. 殖民地笼应保持对植物粉虱在笼子里,而不是在生长室。笼可以通过各种材料构成,但必须允许通风,易于访问能力,以防止烟粉虱逸出或浸润,并有足够的尺寸,以保持足够的植物产生所需粉虱人口。与的纱加铝筛选(强度)以及防粉虱筛选(见表特定设备及用品),已取得了良好的效果。
  3. 殖民地植物制剂:种植物的选择是一个重要的考虑因素时,开始粉虱殖民地。工厂应能够支持高虫口没有倒塌。选择为一个nonviruliferous集落的植物应该是一个非寄主的病毒或病毒的目的是要被发送的菌落中,以避免污染,如果维持比鲁利的生苗殖民地,它必须是该病毒的宿主。植物应较快地增长,以支持在18天内被引入到殖民地,但出现了新的成人不会这么快就长大了四个星期内笼。矮人,灌木,或庭院型植物品种的建议,因为他们往往​​会产生一个类似的叶面积高的品种,但无茎伸长。
  4. 这是非常重要的殖民地后植物在温室粉虱和其他昆虫在笼子里排除。使用植物,粉虱,蓟马,螨出没,他们进入前殖民地可以导致菌落崩溃。被感染的植物也有可能被感染虫媒病毒会干扰病毒传播研究。

2。白粉虱殖民地建立

  1. 开始第一次使用清洁粉虱 - 植物病毒,其他昆虫和昆虫病原体的一个殖民地。这些可以得到从合作者或从外地。如果实地收集,粉虱应至少8周饲养的植物病毒的非寄主植物上,植物症状的情况下检查,以确保它们是植物病毒。
  2. 第1周:第一笼植物引进清洁粉虱。粉虱可以引入吸已知的数字,或从另一个源植物上的殖民地的需求取决于粉虱轻轻晃动。在第1周,粉虱产卵植物叶片表面的底部。用于产卵,产卵的平均数量由女性粉虱寄主植物有问题的成年人数的基础上每出现一个近似的人口规模可以预见。
  3. 第2周:开始另一个笼子,通过引入新的寄主植物的烟粉虱产卵。第1周开始在笼中的植物,将有蛋,和一些未成熟粉虱覆盖的叶子( 图2)的底面。一些1周期间推出的成人粉虱仍然活着。
  4. 第3周:开始第三个笼子,通过引入新的植物的烟粉虱产卵。在第1周开始在笼子里的植物将有不成熟以及许多新兴的新成人粉虱在成人粉虱人口应该有一个非常明显的增加。第2周开始在笼中的植物,将有多个卵和未成熟粉虱覆盖的叶子的底面。
  5. 第4周:开始的第四个笼子,通过引入新的植物的烟粉虱产卵。第1周开始,在笼子里的植物将有大约一个星期后出现的许多成人粉虱。在笼子里的植物,在第2周开始,将有许多新的成人粉虱新兴市场和粉虱人口应该有一个非常明显的增加。第3周开始在笼中的植物,将有覆盖的叶子的底面许多鸡蛋和未成熟的粉虱。
  6. 每周前4后凌晨KS:每个星期,开始一个新的笼子通过引入成人粉虱从第四个最古老笼(笼1周开始),到新的植物,在一个新的,干净的笼子。老笼应该除掉,并废弃工厂。这些粉虱是约1周后出现。在带毒殖民地的情况下,这些粉虱传播病毒到新的植物,以及产卵粉虱的下一代。
  7. 计划传输实验使用粉虱将会出现在第三周的笼子。如果需要更多粉虱,植物数量可以增加,可以添加更多的粉虱周1笼增加粉虱人口。

3。测试植物接种方法

  1. 为了保证高传输速率:1)必须处理粉虱尽量轻柔,以防止损坏的昆虫,这将降低传输速率; 2)必须有足够的叶面积粉虱企业所得税她的探头或饲料。采集时间的增加或增加收购寄主植物的数量可能会增加低利率的传染性测试植物因收购或接种访问期间拥挤。
  2. 以下是收集粉虱。粉虱实验目的所需的精确的数字采集和运动的程序。要移动大量的烟粉虱,例如抗性筛选是必要的,它是只需要轻轻摇晃的粉虱出没的植物在试验植物或病毒感染的收购主机(以及后来的测试厂)。是撼动过许多地方的植物,以减少聚集效应。
  3. 新出现的成人粉虱(1-3天出苗后)非常活跃,经常喂因此往往给予最高传输速率4。大龄粉虱仍然发送,但在较低的频率。多粉虱每个测试厂(解放军15-40元NT)应该用于高速率的传输,因为每株1粉虱的比例往往导致不可接受的低传输速率3,4。需要取决于病毒和物种的采集和测试工厂。
  4. 组装吸入装置和收集瓶。 ( 图3)
  5. 用一只手按住一个黄色的塑料卡,里面包含要收集的烟粉虱的殖民地笼。轻轻拍打植物,鼓励成年粉虱飞。粉虱将被吸引到了一张黄牌,并从工厂飞到卡在那里他们可以收集使用吸引器和一个非常温和的气息。不要吸烟粉虱取食植物。他们的钢丝为嵌入在植物,同时投喂所以拉他们关闭工厂将打破他们的口针,使他们无法获取或传播病毒( 图4)。
  6. 收集约20只成年粉虱成一个单一的科尔CTION小瓶昆虫反复的愿望( 图5),以尽量减少物理伤害。
  7. 要改变收集瓶,轻轻拍打小瓶粉虱在坚硬的表面和瓶盖封口膜,而迷失方向的自攻螺丝。
  8. 将一个新的收集瓶中吸气,重复,直到收集所需粉虱数量。粉虱可以保持几个小时,在室温下将收集瓶。
  9. 收购粉虱被放置在一个感染病毒的植物,并允许48-72小时,在受感染的植物为食。收购期间长于72小时,一般不增加传输速率。对于那些在非持久性或半持久性的方式,1小时,几个小时,分别发送的病毒,是足够的采集访问期间( 表1)。最好的结果是当粉虱免费访问植物在笼子里,限制到一个单一的植物或昆虫多个工厂。然而,一些实验需要采集在这种情况下,剪辑笼可用于从特定的叶片。使用剪辑笼当它是重要的叶子的底面以容纳粉虱取食选择。此外,拥挤在剪辑笼烟粉虱,可以降低传输速率 - 可接受的传输速率已经达到女10粉虱每片段笼直径2.5厘米。
  10. 接种准备一个笼子适当接种的大小,将试验植物在里面。如果只有一个工厂要接种考虑一个单株笼。如果考虑一个小的PVC帧/欧根纱袋笼或铝笼( 图6),一个以上的工厂要接种。用于接种的笼子的大小应稍大一些的大小(s)被接种的植物。粉虱时获得更高的传输速率保持着密切植物冠层,并没有给出一个很大的自由空间。
  11. 采集主机粉虱的集合取决于实验的需要。如果需要小的数字,吸烟粉虱如上所述。将收集瓶粉虱内笼附近的植物和取下盖子( 图7)。打开的小瓶和释放粉虱或反转,轻轻拍打的小瓶释放粉虱。如果需要大量简单的移动采集植物与粉虱成的笼子里,测试厂位于轻轻摇晃关闭收购粉虱寄主植物。对于这两种类型的介绍,一定要分发整个植物的烟粉虱,,减少聚集和确保一个统一的接种。
  12. 允许粉虱探测或饲料为适当的时间后,再次依赖于病毒的寄主植物( 表1)在一定程度上。
  13. 粉虱检查至少一次,以确保期间接种访问期间,粉虱探测或打开笼子,每个工厂翻身一些树叶喂养。
  14. 对于较长的接种访问期间,轻轻扰乱植物(使用竹签或同等学历),刷顶部的植物,,再分配对植物和鼓励粉虱。烟粉虱的再分配有助于确保更高的传输速率打击总粉虱的自然倾向。
  15. 终止接种访问期间结束杀死粉虱批准的化学品。应用两种杀虫剂,一前一后:接触杀虫剂,迅速 ​​终止成年粉虱和内吸性杀虫剂,终止任何粉虱的发展在接下来的几个星期,那些错过了接触杀虫剂( 图8)。一接触杀虫剂杀虫肥皂和全身的杀虫剂,如吡虫啉,吡蚜酮等已被用于具有良好的成功。

Representative Results

这些粉虱细胞集落的建立和维护,以及操纵传输植物病毒的方法已经成功地使用在许多的研究4,11,12,14,以及许多其它的没有引用。使用这些方法坚持传播的病毒,我们经常获得所需100%的传输率选择阻力,干扰传输能力(和评估的抗性诱导化合物)13,14,17,18筛选杀虫剂( 图9)。这里描述的程序,并已被改编到许多地方在公共和私人研究设施。

传输类型 收购访问期间(小时) 接种访问期间(小时) 楼盘。
非永久性 1 2-24 10
半持久性 6-24 8-24 10,16
一贯 48-72 48-72 3,6,8,9

表1的估计时间,可用于病毒的传播,生产率高,与不同类型的关系,他们的载体烟粉虱复合种时间估计的基础上公布的最低所需的时间为80〜100%的传输,并在某些情况下,改性占潜伏期和粉虱种群,病毒和寄主植物之间的差异。

图1
图1。带毒粉虱殖民地的一个例子,这个增长空间包含笼感染与双生病毒和INFE的植物STED带毒粉虱。

图2
图2。左:幼体阶段,白粉虱, 烟粉虱 MEAM分支意义上的巴罗6约1周后出现右:成人白粉虱,许多植物病毒的有效载体。

图3
图3。采集装置的类型,可用于收集植物病毒传播的烟粉虱。

图4
图4。左:黄色的塑料卡用于显示粉虱准备收集到收集粉虱成人,右:收集粉虱从一个黄色的塑料卡。粉虱可以看到卡上的小白色/灰色斑点。

图5
图5。粉虱所收集的愿望(20小瓶)从殖民地的准备无论是收购或接种。

图6
图6。上左:单厂笼用于收购或接种要么。右上:较大的PVC管和透明硬纱制成的笼子。较低:铝/屏幕和蝉翼纱的笼在温室白粉虱的殖民地用于含有植物。

32fig7.jpg“/>
图7。粉虱被转移到一个单一的植物接种(或收购)。

图8
图8。内吸性杀虫剂淋终止粉虱接种访问期间除了。

图9
图9所示。场厂正在评估所有的植物番茄黄化曲叶病毒接种5周龄苗,然后移植到现场进行评估。在前景中的植物是抗性种质线,在后台很容易的植物种质系。

Discussion

这里描述的方法被开发过了一段二十年是基于许多粉虱传播,行为和生物学的研究提供的基本信息。由于有很多出版物,这份手稿是指主要的评论,并选定几个特定出版物说明用于开发这项技术的数据类型。这是非常重要的,在此过程中,烟粉虱轻轻地处理自腿和天线打破可以导致异常行为和降低传输率。真空和其他机械抽吸装置收集从未产生了良好的效果。成功的另一个要考虑的是,用于获得100%的传输试验植物的烟粉虱的数量,必须确定每个组合的植物宿主和病毒。这个最佳比例只需要建立一次。已获得了最好的结果,使用年轻成人粉虱(过去1-3天出现),因为他们克香港专业教育学院的最高传输速率。老年人可以使用,但将需要大量粉虱,以弥补其传播率减少。女性被称为传输率高于男性,因为他们养活更多的往往比男性。然而,它通常是不值得的时间用于传输两性分开。此过程可以在许多方面进行修改,以满足研究者的资源和需要。

多种病毒工作时,最好是保持病毒的非寄主植物上烟粉虱饲养的单个菌落。这些粉虱可以收集病毒感染的植物放在收购和收购后,可以移动粉虱再次测试厂。用于殖民地的植物生长在大棚在笼子里,以防止引进粉虱可能与其他病毒感染它们。这些植物的螨类,蓟马,和其他植物病虫害的侵扰,可以妥协的health的殖民地,并导致它的崩溃。最后的殖民地植物浇水护理有许多工作要做。这些植物喂养这么多的烟粉虱和低于正常光照条件下的极端压力。如果植物甚至overwatered一次,根腐菌在无土混合泥炭介绍可以成为一个问题。预处理中的植物用杀真菌剂淋可以消除的一些问题。

虽然烟粉虱传播植物病毒可能会非常耗时,需要宝贵的资源(如生长室),它是必不可少的一些病毒的传播,我们没有其他的传播途径。抗病毒的筛选设备,它也是一种有价值的手段,因为它使用相同类型的传输将有望在该领域的植物抵抗。更多的人工传输手段的使用并不总是产生最好的结果种质评价维鲁抗S-。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Item Company Catalogue No. Comments (optional)
Whitefly proof screening Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel --- BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen
Whitefly proof screening Hummert International (www.hummert.com) 27-4050-1 - 27-4062-1 BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen
Whitefly Collection Devices BioQuip 1135A Can also be made using eye droppers, flexible plastic tubing, plastic vacuum adaptors, and cheesecloth
Collection vials BioQuip 8909 Vials used depend on which aspirator is used.
Yellow plastic cards any company --- Any bright yellow plastic card will work, can be purchased in many places.
Whitefly Cages --- --- These are not commercially available and must be constructed. 60 cm x 60 cm x 60 cm cages work well for us. Our preference is for those constructed of aluminum window screening, nylon organdy, vinyl plastic, with a structure created using aluminum window frames. Doors are attached using piano hinges and sealed with weather stripping; tops of the cages are vinyl plastic. Cages can also be made of 1) plexiglass glued together on the edges with ventilation provided by screened openings cut on the side pieces; 2) large bags of nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening with internal supports provided by PVC pipes and fittings cut to desired lengths and assembled inside the bags, 3) wood frames and nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antignus, Y., Mor, N., Ben Joseph, R., Lapidot, M., Cohen, S. UV absorbing plastic sheets protect crops from insect pests and from virus diseases vectored by insects. Environ. Entomol. 25, 919-924 (1996).
  2. Cohen, S. Epidemiology of whitefly-transmitted viruses. Whiteflies: Their Bionomics, Pest Status and Management. Gerling, D. Intercept. 211-225 (1990).
  3. Cohen, S., Antignus, Y. Tomato yellow leaf curl virus, a whitefly-borne geminivirus of tomatoes. Adv. Dis. Vector Res. 10, 259-288 (1994).
  4. Csizinszky, A., Schuster, D. J., Polston, J. E. Effect of UV-reflective mulches on tomato yields and on the silverleaf whitefly. HortSci. 34, 911-914 (1999).
  5. De Barro, P. J., Liu, S. -S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: A statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
  6. Duffus, J. E. Whitefly-borne viruses. Bemisia: 1995 Taxonomy, Biology, Damage, Control and Management. Gerling, D., Mayer, R. Intercept Limited. United Kingdom. 255-288 (1996).
  7. Lapidot, M. Screening for TYLCV-resistant plants using whitefly-mediated inoculation. Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease. Czosnek, H. 329-342 (2007).
  8. Lapidot, M., Friedmann, M. Breeding for resistance to whitefly-transmitted geminviruses. Ann. Appl. Biol. 140, 109-117 (2002).
  9. Lapidot, M., Polston, J. E. Biology and epidemiology of Bemisia-vectored viruses. Bemisia: Bionomics and Management of a Global Pest. Stansly, P. A., Naranjo, S. E. Springer. 227-231 (2010).
  10. Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annu. Rev. Phytopathol. 49, 219-248 (2011).
  11. Ng, J. C. K., Falk, B. W. Virus-vector interactions mediating nonpersistent and semipersistent transmission of plant viruses. Ann. Rev. Phytopathol. 44, 212-21 (2006).
  12. Polston, J. E., Cohen, L., Sherwood, T. A., Ben-Joseph, R., Lapidot, M. Capsicum species: Symptomless hosts and reservoirs of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Phytopathology. 96, 447-452 (2006).
  13. Polston, J. E., Hiebert, E., McGovern, R. J., Stansly, P. A., Schuster, D. J. Host range of Tomato mottle virus, a new geminivirus infecting tomato in Florida. Plant Dis. 77, 1181-1184 (1993).
  14. Polston, J. E., Sherwood, T. A. Pymetrozine interferes with transmission of Tomato yellow leaf curl virus by the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae. Phytoparasitica. 31, 490-498 (2003).
  15. Schuster, D. J., Thompson, S., Ortega, L. D., Polston, J. E. Laboratory evaluation of products to reduce settling of sweetpotato whitefly adults. J. Econ. Ento. 102, 1482-1489 (2009).
  16. Virus Taxonomy, Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. King, A. M. Q., Adams, M. J., Carstons, E. B., Lefkowitz, E. J. Elvesvier, Academic Press. (2012).
  17. Wintermantel, W. M. Transmission efficiency and epidemiology of Criniviruses. Bemisia: Bionomics and Management of a Global Pest. Stansly, P. A., Naranjo, S. E. Springer. 319-332 (2010).
  18. Yang, Y., Sherwood, T. A., Patte, C. P., Hiebert, E., Polston, J. E. Use of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) Rep gene sequences to engineer TYLCV resistance in tomato. Phytopathology. 94, 490-496 (2004).
  19. Zehnder, G. W., Yao, C., Murphy, J. F., Sikora, E. R., Kloepper, J. W., Schuster, D. J., Polston, J. E. Microbe-Induced Resistance Against Pathogens and Herbivores: Evidence of Effectiveness in Agriculture. Induced Plant Defenses Against Pathogens. APS Press. St. Paul, MN. 335-355 (1999).
发射使用粉虱的植物病毒
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polston, J. E., Capobianco, H. Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies. J. Vis. Exp. (81), e4332, doi:10.3791/4332 (2013).More

Polston, J. E., Capobianco, H. Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies. J. Vis. Exp. (81), e4332, doi:10.3791/4332 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter