Summary
Migliorare la nostra comprensione e la nostra capacità di gestire molti dei virus delle piante insetto-trasmesse richiede l'uso del vettore. Trasmissione insetto di virus vegetali è una interazione tritrofico, e come tale richiede la manipolazione di insetti, virus, e vegetali. Vettori devono essere allevati in gran numero e manipolati in modo tale da assicurare alti tassi di trasmissione di piante test. Le basi di allevamento e di manipolare la mosca bianca,
Abstract
Aleurodidi, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, un complesso di specie morfologicamente indistinquishable 5, sono vettori di molti virus vegetali. Diversi generi di questi virus vegetali mosche bianche-trasmesse (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) comprendono diverse centinaia di specie di patogeni emergenti e economicamente significativi di importanti alimenti e piante tessili (recensito da 9,10,16). Questi virus non si replicano nel loro vettore, ma comunque sono spostati facilmente da pianta a pianta dalla mosca bianca adulta con vari mezzi (recensito da 2,6,7,9,10,11,17). Per la maggior parte di questi virus che alimentano mosche bianche è necessario per l'acquisizione e l'inoculazione, mentre per gli altri è richiesto solo di sondaggio. Molti di questi virus sono in grado o non può essere facilmente trasmessi con altri mezzi. Pertanto la manutenzione delle colture di virus, biologici e caratterizzazione molecolare (identificazione del campo ospite e sintomi) 3,13, Ecologia 2,12, richiede che i virus trasmessi agli host sperimentali utilizzando il vettore di mosca bianca. Inoltre lo sviluppo di nuovi approcci alla gestione, come ad esempio la valutazione di nuove sostanze chimiche o composti 14 15, nuovi approcci culturali 1,4,19, o la selezione e lo sviluppo di cultivar resistenti 7,8,18, richiede l'uso di aleurodidi per trasmissione del virus. L'uso di trasmissione mosche bianche di virus vegetali per la selezione e lo sviluppo di cultivar resistenti in programmi di riproduzione è particolarmente impegnativo 7. Selezione efficace e screening per la resistenza impiega un elevato numero di piante e vi è una necessità per il 100% delle piante da inoculate per trovare i pochi genotipi che possiedono geni di resistenza. Questi studi utilizzano un numero elevato di viruliferous mosche bianche, spesso più volte all'anno.
Manutenzione Whitefly descritto qui in grado di generare centinaia o migliaiadelle mosche bianche adulti sulle piante ogni settimana, tutto l'anno, senza la contaminazione di altri virus delle piante. Piante gratuitamente sia aleurodidi e virus devono essere prodotti di introdurre nella colonia di mosche bianche ogni settimana. Whitefly culture devono essere tenuti liberi di mosche bianche patogeni, parassiti e parassitoidi che possono ridurre le popolazioni mosche bianche e / o ridurre l'efficienza di trasmissione del virus. Colonie prodotte nella maniera descritta possono essere scalati rapidamente per aumentare o diminuire numeri della popolazione come necessario, e possono essere variate secondo le preferenze di alimentazione della whitefly basata sull'host pianta del virus.
Ci sono due tipi fondamentali di colonie di mosche bianche che possono essere mantenuti: un nonviruliferous e una mosca bianca viruliferous colonia. La colonia nonviruliferous è composta da mosche bianche allevati su piante virus e permette la disponibilità settimanale di mosche bianche che possono essere utilizzati per trasmettere i virus provenienti da diverse culture. Il viruliferous mosche bianche colonia,composto da mosche bianche allevati su piante infettate da virus, permette la disponibilità settimanale di mosche bianche che hanno acquisito il virus omettendo in tal modo un passo nel processo di trasmissione del virus.
Protocol
1. Mosche bianche Manutenzione Colony
- Condizioni ambientali: mosche bianche colonie devono essere mantenuti in una stanza crescita controllata. Controllo di umidità relativa, temperatura, fotoperiodo, e l'intensità della luce sono essenziali per la crescita di colonie ottimale (Figura 1). Una temperatura di 28 ° C, 30-50% di umidità relativa, ed un 14 hr fotoperiodo produrrà una colonia che si sviluppa da uovo ad emergere adulto in 18 giorni (questo tempo varia con la pianta ospite). L'umidità relativa deve essere mantenuta al di sotto del 70% per scoraggiare la crescita di insetti e piante patogeni fungini. Tassi di fertilizzanti e di acqua devono essere ridotti per scoraggiare patogeni fungini e l'accumulo di sale. L'intensità della luce per la colonia dovrebbe essere piuttosto elevato. Lampadine fluorescenti VHO utilizzati in numero sufficiente per generare circa 800-1.000 candele ft all'altezza baldacchino sono adeguate per la maggior parte delle piante (per esempio. Cotone, fagiolo, fagiolo di Lima, pomodoro). La pulizia è essenziale peruna colonia di mosche bianche di mantenere condizioni di allevamento ottimali.
- Gabbie Colony: Aleurodidi devono essere mantenuti su piante in gabbie, anziché gratuito in camera di crescita. Le gabbie possono essere costruite in vari materiali, ma devono permettere: la ventilazione, la facilità di accesso, capacità di evitare la fuga mosche bianche o infiltrazione, e di dimensioni sufficienti a mantenere abbastanza piante per generare la popolazione di mosche bianche necessario. Buoni risultati sono stati ottenuti con organza, più controlli su alluminio (per forza) così come uno screening mosche bianche a prova (vedere la tabella di attrezzature e forniture specifiche).
- Colony impianto di preparazione: Le specie di piante selezionate è una considerazione importante quando si inizia una colonia di mosche bianche. L'impianto dovrebbe essere in grado di sostenere una popolazione ad alto insetto senza crollare. La pianta scelta per una colonia nonviruliferous dovrebbe essere un nonhost per il virus o virus che sono destinati ad essere trasmessi per evitare contaminazioni nella colonia e se il mantenimento di un virulicolonia ferous, deve essere ospite del virus. Le piante devono crescere abbastanza rapidamente per sostenere emergere di nuovi adulti entro 18 giorni di essere introdotto alla colonia ma non così rapidamente a superare le gabbie entro quattro settimane. Nano, cespuglio, o cultivar vegetali patio tipo sono raccomandati in quanto spesso producono una superficie fogliare simile a cultivar più alti, ma senza l'allungamento dello stelo.
- È molto importante per le piante posteriori per la colonia in serre in gabbie che escludono whiteflies e altri insetti. L'uso di piante che sono infestati da aleurodidi, tripidi, acari o prima che entrino nella colonia può causare la colonia al collasso. Piante infestate hanno anche il potenziale per essere infettati con virus trasmesse dagli insetti, che interferiscono con gli studi di trasmissione del virus.
2. Mosche bianche Colony Istituzione
- Avviare una colonia per la prima volta utilizzando mosche bianche pulite - quelli gratuiti di virus vegetali, altri insetti, insetti e agenti patogeni. Questi possono essere ottenutida collaboratori o dal campo. Se il campo di raccolta, mosche bianche dovrebbero essere allevati per almeno 8 settimane su piante nonhost del virus delle piante, e verificare l'assenza di sintomi di piante per essere sicuri che siano privi di virus vegetali.
- Settimana 1: Introdurre mosche bianche pulite per la prima gabbia di piante. Mosche bianche possono essere introdotti mediante aspirazione di numeri noti o con una leggera agitazione mosche bianche di un'altra pianta fonte secondo le richieste della colonia. Durante la settimana 1, mosche bianche sono le uova sulla parte inferiore della superficie delle foglie delle piante. Una dimensione approssimativa popolazione può essere previsto per ogni emersione in base al numero di adulti utilizzati per deporre le uova e il numero medio di uova deposte dalla whitefly femminile sulla pianta ospite in questione.
- Settimana 2: Inizia un'altra gabbia con l'introduzione di mosche bianche a nuove piante ospiti per deporre le uova. Le piante nella gabbia iniziate in settimana 1 avranno uova, e alcune mosche bianche immature che coprono pagina inferiore delle foglie (Figura 2). Alcunialeurodidi adulti introdotte durante settimana 1 saranno ancora in vita.
- Settimana 3: Iniziare una terza gabbia con l'introduzione di mosche bianche di nuovi impianti per deporre le uova. Le piante nella gabbia iniziato nel 1 settimana dovranno immaturo, così come molti nuovi aleurodidi adulti emergenti e ci dovrebbe essere un aumento molto evidente negli adulti mosche bianche popolazione. Le piante nella gabbia iniziate in settimana 2 avranno molte uova e mosche bianche immature che coprono la pagina inferiore delle foglie.
- Settimana 4: Iniziare una quarta gabbia con l'introduzione di mosche bianche di nuovi impianti per deporre le uova. Le piante nella gabbia iniziate in settimana 1 avranno molte mosche bianche adulte che sono circa una settimana dopo emersione. Le piante nella gabbia iniziate in settimana 2 avrà molte nuove mosche bianche adulte emergenti e ci dovrebbe essere un aumento molto notevole nella popolazione mosche bianche. Le piante nella gabbia iniziate durante la settimana 3 avranno molte uova e mosche bianche immature che coprono la pagina inferiore delle foglie.
- Settimanale dopo il primo 4 weeks: Ogni settimana, inizia una nuova gabbia introducendo i whiteflies adulti dal quarto più antico gabbia (la gabbia iniziata in settimana 1) sui nuovi impianti in una nuova, gabbia pulita. La vecchia gabbia dovrebbe essere rimosso e le sue piante scartato. Queste mosche bianche sono circa 1 settimana di post-emergenza. Nel caso della colonia viruliferous, queste mosche bianche dovranno trasmettere il virus ai nuovi impianti, nonché le uova laici per la prossima generazione di mosche bianche.
- Esperimenti di trasmissione prevede di utilizzare le mosche bianche che emergeranno nella gabbia della terza settimana. Se sono necessarie più mosche bianche, numeri di piante possono essere aumentati e più mosche bianche possono essere aggiunti alla settimana 1 gabbia per aumentare popolazione mosche bianche.
3. Metodo per l'inoculazione di piante di prova
- Per assicurare elevate velocità di trasmissione: 1) Aleurodidi deve essere maneggiato più delicatamente possibile per evitare di danneggiare l'insetto che consentirà di ridurre le velocità di trasmissione, 2) deve ricevere una sufficiente superficie fogliare disponibile per aleurodidi per IETla sua sonda o di un mangime. Un aumento del tempo di acquisizione o di un aumento del numero di piante ospiti di acquisizione può aumentare bassi tassi di infettività in piante di prova dovuto all'addensamento nella acquisizione o periodo di accesso inoculazione.
- Raccolta di Aleurodidi. Che segue è una procedura per la raccolta e la circolazione di numero preciso degli aleurodidi necessari a fini sperimentali. Per spostare un gran numero di mosche bianche, come è necessario per lo screening di resistenza, ad esempio, è sufficiente scuotere delicatamente le piante infestate da mosche bianche sopra le piante di prova o gli host di acquisizione infettate da virus (e in seguito le piantine). Assicurati di scuotere le piante per molti luoghi di ridurre al minimo gli effetti di aggregazione.
- Di recente è emerso mosche bianche adulte (1-3 giorni dopo la nascita) sono molto attivi e si alimentano in modo spesso tendono a dare le velocità di trasmissione più alti 4. Aleurodidi più vecchi ancora trasmettono, ma ad una frequenza inferiore. Molteplici aleurodidi per pianta di prova (15-40 per plant) deve essere utilizzato per gli alti tassi di trasmissione da un rapporto di 1 mosca bianca per pianta provoca spesso inaccettabili tassi di trasmissione bassi 3,4. Il numero necessario dipenderà dal virus e la specie di acquisizione e di impianti di prova.
- Montare i dispositivi di aspirazione e fiale di raccolta. (Figura 3)
- Con una mano, tenere una scheda di plastica di colore giallo all'interno della gabbia di colonia che contiene le mosche bianche da raccogliere. Battere delicatamente le piante per incoraggiare le mosche bianche adulte a volare. Mosche bianche saranno attratti dal cartellino giallo e voleranno dalla pianta alla carta, dove possono essere raccolti utilizzando un aspiratore e un respiro molto delicato. Non aspirare mosche bianche che si nutrono di piante. I loro stiletti sono incorporati nello stabilimento, mentre l'alimentazione così li tirare fuori le piante si romperanno i loro stiletti e rendendoli incapaci di entrambi acquisire o trasmettere virus (Figura 4).
- Raccogliere circa 20 mosche bianche adulte in un unico colleflaconcino ction per minimizzare i danni fisici agli insetti da aspirazioni ripetute (Figura 5).
- Per cambiare il flacone di raccolta, toccare delicatamente il flaconcino su una superficie dura e tappo con Parafilm mentre le mosche bianche sono disorientati dalla intercettazioni.
- Mettere una nuova raccogliere fiala sulla aspiratore e ripetere fino a quando il numero di mosche bianche necessari sono raccolti. Mosche bianche possono rimanere nelle fiale di raccolta a temperatura ambiente per diverse ore.
- Di acquisizione. Aleurodidi sono posti su una pianta infetta da virus e permesso di nutrirsi delle piante infette per 48-72 ore. Periodi di acquisizione più lunghi di 72 ore generalmente non aumentano le velocità di trasmissione. Per i virus trasmessi in modo non permanente o semipersistent, 1 ora e diverse ore, rispettivamente, sono sufficienti periodi di accesso di acquisizione (Tabella 1). I migliori risultati si ottengono quando whiteflies sono date libero accesso alle piante in gabbie che confinano gli insetti ad un singolo impianto oapiù impianti. Tuttavia alcuni esperimenti richiedono l'acquisizione di foglie specifici in cui possono essere usati Case gabbie di clip. Quando si utilizzano gabbie di clip, è importante accogliere la preferenza alimentazione mosca bianca per pagina inferiore delle foglie. Inoltre, affollamento di mosche bianche in gabbie di clip può ridurre i tassi di trasmissione - tassi accettabili di trasmissione sono stati raggiunti utilizzando 10 mosche bianche femminili per clip gabbia di 2,5 cm di diametro.
- Inoculazione. Preparare una gabbia adatta al formato del inoculazione e posizionare le piantine dentro. Se solo una pianta è da inoculare considerare una singola gabbia di pianta. Se più di un impianto deve essere inoculato in considerazione una piccola struttura in PVC / sacchetto di organza gabbia o una gabbia di alluminio (Figura 6). Le dimensioni della gabbia utilizzata per l'inoculazione dovrebbe essere leggermente più grande della dimensione della pianta (s) da inoculare. Velocità di trasmissione più elevate si ottengono quando mosche bianche sono tenuti vicino alla cupola della pianta e non dato un sacco di spazio libero.
- Raccolta delle mosche bianche da host di acquisizione dipende dalle esigenze dell'esperimento. Se sono necessari piccoli numeri, aspirare whiteflies come descritto sopra. Porre i flaconi di raccolta del whiteflies all'interno della gabbia pressi delle piante e rimuovere il coperchio (Figura 7). Aprire il flacone e rilasciare le mosche bianche o invertire e picchiettare delicatamente il flacone per liberare le mosche bianche. Se sono richieste grandi numeri è sufficiente spostare le piante di acquisizione con mosche bianche nelle gabbie in cui sono ubicati gli impianti di prova e agitare delicatamente le mosche bianche al largo della pianta ospite acquisizione. Per entrambi i tipi di introduzione, assicurarsi di distribuire le mosche bianche attraverso le piante per ridurre al minimo l'aggregazione e assicurare un inoculo uniforme.
- Lasciare le mosche bianche per sondare o mangimi per la giusta quantità di tempo, ancora una volta dipende dal virus e in qualche misura la pianta ospite (Tabella 1).
- Controllare le mosche bianche, almeno una volta durante il periodo di accesso inoculazione per assicurare che le mosche bianche sonoprobing o alimentando aprendo la gabbia e girando sopra alcune foglie su ogni pianta.
- Per i periodi più lunghi di accesso inoculazione, disturbare le piante delicatamente (con un bastone di bambù o equivalente) per spazzolare le cime delle piante e incoraggiare le mosche bianche di ridistribuire sulle piante. La ridistribuzione delle mosche bianche aiuta a garantire una velocità di trasmissione superiore di contrastare la tendenza naturale di mosche bianche di aggregare.
- Terminazione. Il periodo di accesso inoculazione è finita uccidendo le mosche bianche con sostanze chimiche approvate. Applicare due insetticidi uno dopo l'altro: un insetticida da contatto di porre fine rapidamente aleurodidi adulto e un insetticida sistemico di interrompere eventuali mosche bianche che si sviluppano nelle seguenti settimane e quelli perdere per l'insetticida di contatto (Figura 8). Un insetticida di contatto come il sapone insetticida e insetticidi sistemici come imidacloprid o pimetrozina sono stati utilizzati con buon successo.
Representative Results
Questi metodi per whitefly stabilimento colonie e manutenzione, così come la manipolazione di trasmettere virus vegetali sono stati utilizzati con successo in una serie di studi 4,11,12,14 così come molti altri non citati. Usando questi metodi con virus persistentemente trasmessi, abbiamo ottenuto ordinariamente i tassi desiderati di trasmissione del 100% per la selezione per la resistenza, lo screening insetticidi per la loro capacità di interferire con la trasmissione (e valutazione di composti che inducono resistenza) 13,14,17,18 ( Figura 9). Le procedure qui descritte possono essere e sono stati adattati alle molte posizioni in strutture di ricerca pubbliche e private.
| Tipo di trasmissione | Acquisizione Periodo di accesso (ora) | Inoculazione Periodo di accesso (ora) | Rif. |
| Non permanente | 1 2-24 | 10 | |
| Semipersistent | 6-24 | 8-24 | 10, 16 |
| Persistente | 48-72 | 48-72 | 3, 6, 8, 9 |
Tabella 1. Tempi stimati che possono essere utilizzati per produrre alti tassi di trasmissione di virus con diversi tipi di relazioni con i loro vettori Bemisia tabaci specie complesse. Tempi stimati sono basati su tempi minimi pubblicati richiesti per la trasmissione 80-100% e modificato in alcuni casi per tenere conto di periodi di latenza e le differenze tra le popolazioni di mosche bianche, virus e piante ospiti.
Figura 1. Un esempio di una mosca bianca viruliferous colonia. Questa stanza contiene le gabbie di crescita delle piante infettate con un begomovirus e infested con viruliferous mosche bianche.
Figura 2. A sinistra: immaturi fasi della mosca bianca, Bemisia tabaci MEAM clade sensu De Barro 6 circa 1 settimana di post-emergenza e di destra: un adulto mosca bianca, un vettore efficace di molti virus delle piante.
Figura 3. Tipi di dispositivi di raccolta che possono essere utilizzati per raccogliere whiteflies per la trasmissione virus vegetale.
Figura 4. A sinistra: carta di plastica giallo utilizzato per raccogliere gli adulti mosche bianche che mostrano mosche bianche pronte per la raccolta . Destra: Raccolta mosche bianche da una carta di plastica giallo. Mosche bianche può essere visto sulla carta, come piccole macchie bianche / grigio.
Figura 5. Whiteflies raccolti da aspirazione (20 in una fiala) dalla colonia sia pronta per acquisizione o inoculazione.
Figura 6. In alto a sinistra:. Gabbie singole piante utilizzate a fini sia di acquisto o di inoculazione In alto a destra: gabbie più grandi realizzati in tubo pvc e organza. Inferiore: alluminio / schermo e gabbie di organza in una serra piante contenenti destinati ad una colonia mosca bianca.
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Figura 7. Mosche bianche vengono trasferiti a un unico impianto per inoculazione (o acquisizione).
Figura 8. L'aggiunta di un insetticida sistemico inzuppare per terminare il periodo di accesso inoculazione mosche bianche.
Figura 9. Piante di campo in fase di valutazione per la resistenza a leaf curl virus giallo del pomodoro. Tutte le piante sono state inoculate in 5 settimane vecchie piantine e poi trapiantato al campo per la valutazione. Piante in primo piano sono una linea di germoplasma resistente, piante sullo sfondo sono linea germoplasma sensibili.
Discussion
I metodi qui descritti sono stati sviluppati per un periodo di due decenni e sono basate sulle informazioni di base fornita da molti studi di trasmissione whitefly, comportamento e biologia. Poiché ci sono molte pubblicazioni, questo manoscritto si riferisce principalmente a recensioni e ad alcune pubblicazioni specifiche selezionate per illustrare il tipo di dati utilizzati per sviluppare questa tecnica. È molto importante in questa procedura che i whiteflies sono gestite dolcemente poiché rottura delle gambe e antenne può portare a comportamenti anomali e tassi inferiori di trasmissione. Raccolta con aspiratori e altri dispositivi meccanici di aspirazione non ha mai prodotto buoni risultati. Un'altra considerazione per il successo è che il numero di whiteflies utilizzati per ottenere il 100% di trasmissione a piante di prova, deve essere determinata per ciascuna combinazione di pianta ospite e virus. Questo rapporto ottimale deve soltanto essere stabilita una volta. I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando whiteflies giovani adulti (1-3 giorni emergere passato) poiché g piùive più alti tassi di trasmissione. Gli anziani possono essere utilizzati, ma saranno necessari un maggior numero di mosche bianche per compensare i loro tassi di cambio ridotti. Le femmine sono noti per la trasmissione a tassi più elevati rispetto ai maschi, in quanto si nutrono più spesso rispetto ai maschi. Tuttavia non è di solito vale la pena il tempo di separare i sessi per la trasmissione. Questa procedura può essere modificato in molti modi per soddisfare le risorse e le esigenze del ricercatore.
Quando si lavora con molti virus è meglio mantenere una singola colonia di mosche bianche allevati su piante nonhost del virus. Queste mosche bianche possono essere raccolti posto su piante infettate da virus per l'acquisizione e poi, dopo l'acquisizione delle mosche bianche possono essere spostati di nuovo per le piantine. Le piante destinate alla colonia dovrebbero essere coltivate in serre in gabbie per evitare l'introduzione di mosche bianche che li possa infettare con un altro virus. Infestazione di queste piante con acari, tripidi, e altri parassiti vegetali può compromettere l'health della colonia e causare il crollo. Infine l'irrigazione delle piante colonia deve essere fatto con cura. Queste piante sono soggette a stress estremo dalla somministrazione di tante whiteflies e le condizioni di luce normali inferiori. Radice marciume funghi che vengono introdotti sul torba nelle miscele fuori suolo può diventare un problema se le piante vengono overwatered ancora una volta. Pretrattamento delle piante con un fungicida drench può eliminare alcuni dei problemi.
Mentre la trasmissione mosche bianche dei virus delle piante può richiedere molto tempo e richiedono risorse importanti (come le camere di crescita) è essenziale per la trasmissione di alcuni virus per il quale non abbiamo altri mezzi di trasmissione. E 'anche un modo utile di impianti di vagliatura per la resistenza ai virus, in quanto utilizza lo stesso tipo di trasmissione che le piante in campo dovranno resistere. L'uso di mezzi più artificiali di trasmissione non sempre dato i migliori risultati nelle valutazioni di germoplasma per Virus-resistenza.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Item | Company | Catalogue No. | Comments (optional) |
| Whitefly proof screening | Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel | --- | BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen |
| Whitefly proof screening | Hummert International (www.hummert.com) | 27-4050-1 - 27-4062-1 | BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen |
| Whitefly Collection Devices | BioQuip | 1135A | Can also be made using eye droppers, flexible plastic tubing, plastic vacuum adaptors, and cheesecloth |
| Collection vials | BioQuip | 8909 | Vials used depend on which aspirator is used. |
| Yellow plastic cards | any company | --- | Any bright yellow plastic card will work, can be purchased in many places. |
| Whitefly Cages | --- | --- | These are not commercially available and must be constructed. 60 cm x 60 cm x 60 cm cages work well for us. Our preference is for those constructed of aluminum window screening, nylon organdy, vinyl plastic, with a structure created using aluminum window frames. Doors are attached using piano hinges and sealed with weather stripping; tops of the cages are vinyl plastic. Cages can also be made of 1) plexiglass glued together on the edges with ventilation provided by screened openings cut on the side pieces; 2) large bags of nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening with internal supports provided by PVC pipes and fittings cut to desired lengths and assembled inside the bags, 3) wood frames and nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening. |
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