Summary
Nous décrivons ici une méthode pour l'activation et l'expansion des cellules NKT de gros populations de cellules T en utilisant des cellules présentant l'antigène artificielles (VAMP). L'utilisation de CD1d basée aAPC offre une méthode normalisée pour générer des nombres élevés de cellules NKT fonctionnelles.
Abstract
Natural Killer T (NKT), les cellules sont un sous-ensemble unique de cellules T qui affichent des marqueurs caractéristiques des deux tueuses naturelles (cellules NK) et les cellules T 1. Contrairement aux cellules T classiques, les cellules NKT reconnaissent l'antigène lipide dans le contexte de molécules CD1 2. Les cellules NKT expriment un réarrangement de la chaîne invariante TCRα: Vα14Jα18 chez la souris et chez l'homme Vα24Jα18, qui est associée avec des chaînes Vß de faible diversité 3-6, et sont appelés canoniques ou invariant NKT (i NKT) des cellules. Semblables à des cellules T conventionnelles, les cellules NKT se développer à partir CD4-CD8-thymiques des cellules T précurseurs à la suite de la signalisation appropriée par CD1d 7. La possibilité d'utiliser des cellules NKT à des fins thérapeutiques a considérablement augmenté la capacité de stimuler et d'accroître l'homme cellules NKT avec α-galactosylcéramide (α-GalCer) et une variété de cytokines 8. Fait important, ces cellules ont conservé leur origine phenotype, des cytokines sécrétées, et affichée fonction cytotoxique contre des lignées cellulaires tumorales. Ainsi, ex vivo des cellules NKT étendues restent fonctionnels et peuvent être utilisés pour une immunothérapie adoptive. Cependant, à base de cellules NKT-immunothérapie a été limitée par l'utilisation de cellules autologues présentant l'antigène et de la quantité et de la qualité de ces cellules stimulatrices peuvent varier considérablement. DC dérivées de monocytes de patients atteints de cancer ont été signalés à exprimer des niveaux réduits de molécules de co-stimulation et produisent des cytokines inflammatoires moins 9,10. En fait, DC murines plutôt que d'APC autologues ont été utilisés pour tester la fonction des cellules NKT de patients atteints de LMC 11. Cependant, ce système ne peut être utilisé pour des tests in vitro depuis les cellules NKT ne peut pas être étendu par murin DC, puis utilisés pour une immunothérapie adoptive. Ainsi, un système normalisé qui s'appuie sur les cellules présentatrice d'antigène artificielle (VAMP) pourrait produire des effets stimulants de DC en évitant les pièges d'allo-ou xénogénique CElls 12, 13. Nous décrivons ici une méthode pour générer CD1d basée aAPC. Depuis l'engagement du récepteur des cellules T (TCR) par CD1d complexes antigène-est une exigence fondamentale de l'activation des cellules NKT, l'antigène: CD1d-Ig complexes de fournir une méthode fiable d'isoler, d'activer et de développer des populations de cellules effectrices NKT.
Protocol
1. Génération de aAPC
- Avant d'ajouter des protéines à des billes, préparer tous les réactifs et tampons: tampon borate 0,1 M, D-1X PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +); (azoture de PBS 1X +5% de sérum AB humain + sodium à 0,02%) de tampon de lavage perle , milieu complet (milieu RPMI 100 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de solution de vitamines non essentiels, 100 mM MEM vitamine solution, 1% de 2-mercaptoéthanol, 10 uM ciprofloxacine, 5% de sérum AB humain); tampon MACS (1 L de PBS gratuit de Ca 2 + et Mg 2 +, 5 g de BSA, et EDTA 2 mmol).
- Rincez 1 ml perles Dynabeads Epoxy M-450 avec 3 ml tampon 0,1 M stérile Borate (acide borique et de l'eau, pH 7,0-7,4) dans un flacon en verre de 5 ml borosilicate clair filetée.
- Dans une autre tube de 1,5 ml, ajouter 100 mg hCD1d-Ig dimère et 20 pg molécules co-stimulatrices (par exemple: anti-CD28mAb) à 1 ml de PBS w / o Ca 2 + ou Mg 2 +. <li> Lieu perle flacon en verre contenant l'aimant et un tampon de borate aspiration à partir de perles. Ajouter le mélange de protéines à partir de l'étape 1.2 de flacon en verre et remettre le capuchon. Mélanger immédiatement en retournant le flacon, le bouchon de couvrir avec du parafilm et placer sur un agitateur et incuber une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, flacon en verre lieu sur l'aimant et retirer mélange de protéines, tout en évitant soigneusement perles. Laver les billes en ajoutant 3 ml de tampon de lavage perle (PBS avec 5% de sérum AB azoture de sodium +0,02%), et l'incubation à 4 ° C sur un agitateur pendant 5 min. Répéter deux fois.
- Billes peuvent être stockées dans ce mélange de lavage bourrelet. Pour faire aAPC fonctionnelle, retirer une petite aliquote et compter les perles à l'aide d'un hématimètre. Vérifiez que les protéines sont chargées de façon stable sur les billes par coloration avec des anticorps (ex. PE-conjugué anti-IgG1 de souris) et de réaliser des analyses de cytométrie en flux.
- Pour charger des perles avec l'antigène, retirez 5 x 10 7 perles, et les ajouter à un petit flacon en verre 1,5 ml, rincer perles avec 1 ml de PBS stérile. Resuspend lavé perles avec 1 ml de PBS stérile et ajouter antigène; exemple: Chargez α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Remarque: Bien, nous n'avons pas détecté de problèmes avec liposolubilité ou formation de micelles, les lipides doivent être manipulés conformément aux recommandations du fabricant. Plus précisément, KRN7000 a été reconstitué dans du DMSO (1mg/ml) pour ces études. KRN7000 et d'autres antigènes glycolipides peuvent également être dissous dans 0,2 mg / ml de PBS contenant 0,5% de Tween-20 (soniquer 2 h. À 37 ° C). IMPORTANT-La aAPC besoin d'être chargé pendant au moins 48-72 heures avant de l'utiliser.
2. Isolement du CD161 + cellules CD3 +
- Recueillir les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Pour une densité Ficoll gradient de séparation centrifugation de lymphocytes d'un buffy coat ou pack leucophérèse, d'abord diluer le sang hépariné avec un volume égal de PBS 1X à température ambiante.
- Ajouter 15 ml de Ficoll (réchauffé à température ambiante) pour tubes de 50 ml coniques. Lentement superposition25 ml de sang dilué le mélange au-dessus de la Ficoll. Centrifuger à 2000 rpm pendant 30 min à température ambiante avec le frein hors tension.
- Retirez délicatement l'interface lymphocytaire (anneau blanc entre les médias et le Ficoll) avec une pipette Pasteur et transférer dans un nouveau tube de 50 ml conique.
- Laver les cellules en remplissant le tube de 50 ml avec du PBS et centrifugation à 1500 rpm pendant 5 min. Jeter le surnageant et combiner les tubes d'un seul individu à un seul tube et laver les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à nouveau avec 20 ml de PBS. Comptez ensuite les PBMC et remettre en suspension à une concentration de 5 x 10 7 cellules / ml dans un tampon MACS (1 L de PBS sans Ca 2 + et Mg 2 +, 5 mmol g de BSA et 2 EDTA).
- Afin d'isoler la fraction de cellules T, commencez avec 2 ml de PBMC (10 8 cellules) et ajouter 100 ul de Pan T solution d'enrichissement de cellules à partir du Kit EasySep Human T enrichissement de cellules. Incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter 100 ul de particules magnétiques à la solution et incuber à température ambiante pendant 10 min. Amener le volume final de 2,5 ml de solvant à et placer le tube dans l'aimant violet pendant 5 min. Verser rapidement au large de la fraction CD3 + dans un tube conique de 15 ml.
- Laver les cellules en ajoutant 5 ml de tampon MACS froid, comptez le nombre de cellules viables, et enlever une partie aliquote pour la coloration FACS.
- Pour sélectionner les cellules CD161 +, d'abord remettre les lymphocytes T enrichis en 980 ul de tampon MACS glace froide, ajouter 10 mg de lutte contre CD161 anticorps monoclonal, et incuber au réfrigérateur pendant 10 min.
- Centrifuger les cellules à 1500 rpm à 4 ° C pendant 5 min. Puis reconstituer le culot de cellules dans 800 ul de tampon MACS. Ajouter 200 ul d'anti-souris IgG1 microbilles et incuber la solution pendant 10 min à 4 ° C.
- Au cours de cette étape d'incubation, à équilibrer une colonne LS en ajoutant 3 ml de tampon MACS.
- Ensuite, laver les cellules par centrifugation 1500 rpm à 4 ° C pendant 5 min. Resupasser les cellules dans 3 ml de tampon MACS. Puis ajouter les cellules dans la colonne de séparation LS MACS. Assurez-vous d'éviter de générer des bulles par pipetage lentement. Rincer la colonne en ajoutant 3 ml de tampon MACS. Répéter deux fois.
- Ajouter 3 ml de tampon MACS frais et retirez la colonne de l'aimant. Lieu colonne dans un tube conique de 15 ml. Insérez plongeur et pousser sur le contenu pour obtenir purifiés CD161 + CD3 + cellules. Le comte de cellule NKT fraction enrichie. Vous devriez avoir 2-4 millions de cellules.
3. aAPC médiée par l'expansion des cellules NKT
- Mettre en place une co-culture en ajoutant 10 6 enrichis CD161 + CD3 + cellules T et 10 6 AAPC dans 16 ml de milieu complet (milieu complet + IL-2, 100 U / ml). Plaque de ce mélange en ajoutant 160 ul / puits volume final de 96 puits de culture tissulaire en polystyrène traitées, U-fond de la plaque avec une faible évaporation couvercle. Effectuer échange de milieu tous les jours 7 ème en ajoutant 80 pl de milieu frais.
- Récoltecellules, compter, et effectuer une coloration FACS le jour 12-14.
- Les cellules NKT peuvent être élargis réétalées comme décrit ci-dessus à l'étape 3.1, en particulier remettre en suspension les cellules T 10 6 10 6 élargis et VAMP dans 16 ml de milieu complet. Plaque de ce mélange en ajoutant 160 ul / puits de 96 puits à fond en U plaque. Continuer à rafraîchir milieu de coculture tous les jours 7 ème en ajoutant 80 pl de milieu frais.
- Il est préférable de congeler les cellules NKT supplémentaires après le second tour de l'expansion (1 x 10 6 / cryovial dans 1 ml-5% de DMSO / 95% de FBS.)
4. Test fonctionnel: aAPC médiée par la stimulation des cellules NKT
- Mettre en place 5x10 4 cellules NKT / bien avec 5x10 5 aAPC dans 200 ul volume final (milieu complet) dans 96 puits à fond en U plaque.
- Surnageant de culture cellulaire pour la récolte ELISA après 24-48 heures.
Representative Results
Ici, nous décrivons une méthode pour générer CD1d-Ig base aAPC, faite par couplage covalent de CD1d-Ig et anti-CD28 mAb à des billes magnétiques pour stimuler les cellules NKT comme une méthode normalisée pour la propagation des cellules NKT (figure 1). Tout d'abord, il faut démontrer que les protéines de fusion CD1d-Ig sont stablement immobilisé sur la surface des billes magnétiques. Comme le montre la Figure 2A, CD1d-Ig et d'anticorps anti-CD28 ont été tous les deux exprimés à la surface des billes magnétiques. Pour examiner la capacité de stimulation de l'AAPC, nous co-cultivées hybridomes de cellules NKT avec VAMP nuit, les surnageants de la culture récoltés et mesurés de production d'IL-2 par ELISA. Nous avons constaté que CD1d-Ig base aAPC étaient capables de stimuler les cellules NKT hybridomes à des niveaux égaux ou supérieurs à leurs homologues cellulaires (figure 3, les données non présentées). Fait intéressant, nous avons constaté que nos cellules NKT hybridomes de souris sont stimulés par CD1d humaine basée sur aAPC (Figure 2B), qui fournit une méthode simple pour tester chaque lot de aAPC.
Ensuite, nous avons cherché à démontrer le potentiel de propagation de aAPC, donc des cellules T ont été isolés à partir du sang périphérique. D'abord le CD161 + CD3 + fraction des lymphocytes T a été enrichi par séparation bille magnétique. Ensuite, les cellules T ont été stimulés bimensuel avec α-GalCer chargé aAPC. Surtout, nous avons constaté que même avec une population relativement faible de cellules NKT initial (0,03%), nous avons été en mesure d'étendre les cellules à environ 67% Vα24 + Vβ11 + (figure 3). Nous avons élargi les cellules NKT de l'PBMC de nombreux volontaires sains et des patients atteints de cancer et ont constaté que les α-GalCer chargé aAPC ont pu développer des cellules NKT la population dans les deux groupes. Notamment, le taux d'expansion a été très dépendante des bailleurs de fonds. Comme prévu, le plus élevé de la population initiale de cellules Vα24 +, plus le pourcentage d'expansion. En outre,lors de l'utilisation d'une population de départ de 2 millions de cellules CD161 + cellules T CD3 +, on peut obtenir> 10 7 cellules après deux tours de l'expansion (tableau 1). Environ 80-90% des cellules NKT sont élargis CD4 +, ~ 5% CD8 +, et les autres sont sans doute CD4-CD8-doubles négatifs cellules NKT. Ces cellules NKT étendues peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles comme le montre la Figure 4A-C. Nous avons trouvé que notre expansion ex vivo des cellules NKT continuent de répondre aux α-GalCer stimulation et sont de puissants producteurs d'IL-17A, le TNF-α, l'IFN-γ et. Il est à noter que si la population initiale T cellule d'enrichissement est faible et l'on est incapable d'effectuer la deuxième étape d'enrichissement CD161, l'expansion aAPC médiation peut ne pas donner les résultats escomptés (voir la figure 4D, Donateur 1). Toutefois, si le pourcentage de cellules NKT circulants est supérieure à 0,1%, il faut toujours être en mesure d'obtenir une expansion significativedes cellules NKT i. Collectivement, ces données démontrent que CD1d base-aAPC peut être utilisé efficacement pour développer et stimuler les primaires des cellules NKT.
Figure 1. Schéma de CD1d: Ig à base de VAMP parties extracellulaires de la molécule CD1d sont fusionnés à la région constante d'une chaîne lourde d'immunoglobuline protéine séparés par un lieur acide aminé court. Ces molécules peuvent être facilement chargé avec des antigènes lipidiques, tels que α-GalCer, simplement en les incubant avec un excès de lipide d'intérêt. aAPC ont été faites par couplage CD1d-Ig et anti-CD Abs à des billes magnétiques. Dans ce système, CD1d-Ig est utilisé pour fournir le spécifique d'un antigène apparenté de signal à travers le TCR et anti-CD28 monoclonal fournit le signal de co-stimulation.
Figure 2. . Coloration FACS des protéines de surface sur VAMP VAMP A) ont été testés pour la présence de CD1d: IgG dimère (par coloration avec PE-conjugué anti-IgG1 de souris) ainsi que anticorps anti-CD28 (en utilisant conjugué au FITC anti-souris IgG2a) histogrammes. ouverts indiquent contrôle isotypique; histogrammes pleins représentent les anticorps indiqués. CD1d-Ig Exprimant aAPC peut stimuler la production d'IL-2 par les cellules NKT. B) Le Vα14 + souris NKT cellulaire d'hybridome, DN32.D3, a été co-cultivées avec un milieu, d'un antigène soluble (α-GalCer), déchargé aAPC ou α-GalCer chargé aAPC. Les surnageants de culture ont été récoltés et sandwich ELISA standard a été utilisé pour mesurer la production d'IL-2.
Figure 3. Expansion des cellules NKT par CD1d-Ig cellules couvertes d'antigène artificielles présentant. (A) primaire CD3 + CD161 + cellules doublement positives ont été isolées à partir des PBMC en utilisant la séparation magnétique. Les cellules triées ont été stimulées avec α-GalCer chargé, CD1d-Ig aAPC couché pendant 14 jours. Les cellules ont été colorées pour Vα24 et Vβ11 stimulation aAPC suivante. (B) des cellules humaines primaires NKT lyse d'une lignée de lymphome des cellules B. C1R-CD1d cellules incubées avec des cellules NKT dans les proportions indiquées, en présence ou en l'absence d'antigène, une GalCer-(100 ng / ml) en 96-puits à fond en U des plaques de 20-24 h. Cellules NKT la lyse cellulaire a été évaluée par la norme par 51Cr-release dosage.
Figure 4. Profils de cytokine de cellules NKT-aAPC élargis. 5 / puits) ont été co-cultivées avec α-GalCer soluble, PMA / ionomycine, anti-CD3/28 microbilles, ou α-GalCer chargé aAPC (2 x 10 5 / puits) pendant 48 heures. (A) l'IL-17A, (B) le TNF-α, et (C) l'IFN-γ a été mesuré par production de cytokine ELISA standard. Les données présentées sont la production de cytokines net après déduction des contrôles négatifs (les médias et les perles vides). (D) les cellules T primaires ont été isolées à partir des PBMC en utilisant magnétique de séparation du talon. Les cellules triées ont été stimulées pendant deux semaines avec l'indication a-GalCer chargé-aAPC. Les cellules ont été colorées en utilisant Abs spécifiques pour Vα24 + et + Vβ11 et analysées par cytométrie en flux.
Discussion
aAPC peut être utilisée pour étudier les exigences de base pour l'activation des cellules NKT et il a le potentiel de valeur clinique de l'expansion ex vivo des cellules T NK pour l'immunothérapie adoptive. Mescher et al. Décrit l'un des systèmes à base de talon première, où biotinylé classe I du CMH murin-peptide seul assemblage de chaîne ont été combinées avec des molécules co-stimulatrices B7.1 et B7.2 biotinylés par la streptavidine à la surface de microsphères de latex 14, 15. Cette approche a été utilisée avec succès pour stimuler spécifiques de l'antigène des cellules T provenant de souris transgéniques. En outre, étant donné que cette approche utilise une seule chaîne complexe CMH-peptide à assurer un chargement homogène des molécules du CMH, chaque antigène peptidique objectif, il faudrait une nouvelle transfection d'expression de la chaîne désirée CMH-peptide complexe unique, ce qui limite la portée de ce approche. Surtout, le groupe du Dr Schneck pionnier de la perle base-aAPC, en développant un autre non-cellulaire aAPC perle base, Par couplage HLA-Ig, le signal 1, et anti-CD28, signal 2, sur des billes magnétiques. HLA-Ig, une forme unique multimérique de HLA fusionnée à une immunoglobuline échafaudage moléculaire 16, 17 a été élaboré par son groupe. Par la suite, ils ont développé MHC-Ig base aAPC, qui ont montré sa capacité à élargir le CMV et MART-1 CTL spécifiques 18. Ici, nous avons démontré que CD1d-Ig aAPC base peut être utilisée pour étendre fonctionnelles des cellules NKT. Une étude a utilisé un système similaire pour examiner l'interaction physique avec des cellules NK CD1 19.
Notamment, nous avons conçu une cellule présentatrice d'antigène artificielle qui s'adapte à toutes les exigences que nous trouvons nécessaire pour la prolifération des cellules NKT optimale. La méthode d'expansion aAPC fournit une méthode simple et fiable pour élargir et d'enrichir les cellules NKT. Notre aAPC peuvent être modifiés pour évaluer systématiquement le rôle d'un panel de molécules de co-stimulation potentiels et d'évaluer leur rôle dans la NKT prolifération cellulairetion et de la fonction. Ainsi, aAPC représentent une technologie robuste polyvalent utiles pour induire et l'expansion des cellules NKT. La génération de VAMP prend moins d'une semaine, et est adapté à la production de grandes quantités de perles. Cependant, une étape cruciale dans la génération de la aAPC est de confirmer que CD1d-Ig est stable immobilisé sur la surface des billes et d'évaluer leur fonctionnalité pour assurer la cohérence de lot à lot. Une limite potentielle de ce système est qu'il n'y a pas de mécanisme en place pour éteindre la stimulation, autre que l'enlèvement mécanique des billes. Plus précisément, l'engagement du récepteur des cellules T (TCR) avec l'antigène: complexe CD1d/MHC génèrent habituellement la synapse immunologique de concert avec accessoires / molécules d'adhésion, ce qui peut entraîner l'induction de facteurs inhibiteurs ou de suppression à la fois sur la cellule T et Cellule présentatrice d'antigène. Dans le système aAPC, ces facteurs peuvent être régulée à la hausse par la cellule T, mais le talon ne serait pas exprimer les ligands apparentéspour ces récepteurs.
En outre, les cellules NKT CD4 + ont été montré pour supprimer les réponses anti-tumorales chez la souris et chez l'homme, il est donc possible que l'activation non sélective de toutes les cellules NKT (c.-à-stimulation globale avec α-GalCer) ou l'activation du sous-ensemble erronée pourrait entraîner immunologique indésirable résultats. Par conséquent, il faut phénotypiquement et fonctionnellement caractériser la population aAPC expansé cellules NKT. Comme le montre la figure 4, nous avons constaté que la stimulation avec α-GalCer chargé aAPC exprimant anti-CD28 peut entraîner cellules NKT produisent Th1, Th2, Th17 et des cytokines de type. Des études ont rapporté que les souris défi avec de l'IL-33, une cytokine récemment identifiée, a entraîné une augmentation des niveaux de circulation cytokines inflammatoires telles que l'IL-5 et IL-13. Le traitement des cellules NKT avec de l'IL-33 amélioré leur production de cytokines 20. IL-33 est un ligand spécifique pour ST2 et il a été montré que ST2 soluble can blocs IL-33 de signalisation. Ainsi, à titre d'exemple d'une application future, ST2 aAPC exprimer pourraient être générés et utilisés pour déterminer si l'on pouvait inhiber sélectivement la production de cytokines Th2, tout en induisant la sécrétion de cytokines Th1 par les cellules NKT. Il a également été rapporté que l'injection intraveineuse de Ko exprimant aAPC en C57BL / 6 a entraîné dans les métastases du poumon a diminué de 21 tumeur. Fait important, ces données démontrent que le trafic aAPC dans les poumons et sont capables d'activer des lymphocytes T effecteurs sous-ensembles. Par conséquent, on peut générer plusieurs types de aAPC et d'examiner l'interaction entre les sous-ensembles spécifiques de l'antigène des cellules T. En résumé, ces études démontrent que CD1d-Ig aAPC base peut être utilisé pour remplacer normale APC cellulaire, et ont le potentiel d'améliorer les approches actuelles cliniques de cellules NKT base-immunothérapie adoptive.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Priyanka Subrahmanyam pour des discussions utiles. Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt financier. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'American Cancer Society, le NIH / NCI K01 CA131487, CA162273 R21, R21 CA162277, et P30 immunologie tumorale et programme d'immunothérapie à TJ Webb. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
| EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
| Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
| Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
| Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
| M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
| Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
| RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | ||
| Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
| PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
| PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
| FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
| PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
| PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
| FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
| IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
| Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
| BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |
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