Summary
यहाँ हम थोक टी सेल आबादी से कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं (aAPC) का उपयोग मानव NKT कोशिकाओं को सक्रिय करने और विस्तार के लिए एक विधि का वर्णन है. उपयोग के CD1d आधारित aAPC की कार्यात्मक NKT कोशिकाओं की उच्च संख्या पैदा करने के लिए एक मानक तरीका प्रदान करता है.
Protocol
1. AAPC का सृजन
- मोती प्रोटीन जोड़ने से पहले, सभी अभिकर्मकों और buffers तैयार: 0.1M Borate बफर, D-पीबीएस 1X (कोई Ca 2 + और मिलीग्राम + 2), मनका धो बफर (1X पीबीएस 5% मानव एबी सीरम + 0.02% सोडियम azide) पूरा मध्यम (RPMI मध्यम 100 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 10 मिमी गैर जरूरी विटामिन समाधान, 100 मिमी सदस्य विटामिन समाधान, 1% 2 mercaptoethanol, 10 सुक्ष्ममापी ciprofloxacin, 5% मानव एबी सीरम), एमएसीएस (बफर 1 एल पीबीएस मुक्त 2 Ca + और मिलीग्राम 2 +, 5 ग्राम, बीएसए, और 2 mmol EDTA).
- 3 मिलीलीटर बाँझ एक 5 मिलीलीटर स्पष्ट borosilicate ग्लास लड़ी पिरोया शीशी में 0.1 एम Borate बफर (बोरिक एसिड और पानी, पीएच 7.0-7.4) के साथ 1 मिलीलीटर Dynabeads M-450 Epoxy मोती कुल्ला.
- 1 मिलीलीटर पीबीएस w / ओ 2 Ca + मिलीग्राम 2 +: एक अलग 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, 100 ग्राम hCD1d Ig डिमर और 20 ग्राम costimulatory अणुओं (विरोधी CD28mAb उदाहरण के लिए). <li> प्लेस मनका और मोतियों से Aspirate borate बफर चुंबक पर कांच की शीशी युक्त. 1.2 कदम से कांच की शीशी प्रोटीन मिश्रण जोड़ें और टोपी की जगह. तुरंत inverting शीशी द्वारा मिक्स, parafilm साथ टोपी, और एक रोटेटर पर जगह को कवर किया और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं
- अगले दिन, जगह चुंबक पर कांच की शीशी और प्रोटीन मिश्रण को निकालने के लिए, जबकि ध्यान से मोती से परहेज. 3 मिलीलीटर मनका धोने बफर (पीबीएस के साथ 5% एबी सीरम 0.02% सोडियम azide) जोड़ने, और 5 मिनट के लिए एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा मोती धो लें. दो बार दोहराएँ.
- मोती इस मनका धोने मिश्रण में संग्रहित किया जा सकता है. कार्यात्मक aAPC बनाने के लिए, एक छोटे से अशेष भाजक को हटाने और मोती एक hemacytometer का उपयोग कर गिनती. जाँच करें कि प्रोटीन stably एंटीबॉडी (उदा. पीई संयुग्मित IgG1 विरोधी माउस) के साथ धुंधला और प्रवाह cytometric विश्लेषण करती है प्रदर्शन के द्वारा मोती पर लोड कर रहे हैं.
- प्रतिजन के साथ मोती लोड, 5 x 10 7 मोती निकालने के लिए, और एक छोटे से 1.5 मिलीलीटर कांच की शीशी में जोड़ने, 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ मोती कुल्ला. आर1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ esuspend मोती धोया और प्रतिजन जोड़ने, उदाहरण: (5mg/ml) α-GalCer/KRN7000 साथ लोड. * नोट: हालांकि, हम लिपिड विलेयता या micelle गठन के साथ किसी भी मुद्दे का पता चला है, lipids निर्माता की सिफारिशों के अनुसार संभाला जाना चाहिए. विशेष रूप से, KRN7000 DMSO (1mg/ml) में इन अध्ययनों के लिए पुनर्गठन किया गया. KRN7000 और अन्य glycolipid प्रतिजनों भी 0.2 मिलीग्राम / एमएल पीबीएस 0.5% युक्त में भंग किया जा सकता है Tween-20 (2 घंटा 37 डिग्री सेल्सियस पर sonicate). महत्वपूर्ण aAPC करने के लिए कम से कम 48-72 घंटे के लिए उपयोग करने के लिए पूर्व लोड करने की आवश्यकता है.
2. CD161 + CD3 + कोशिकाओं का अलगाव
- परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMC) ले लीजिए. Ficoll एक buffy कोट या leukopheresis पैक से लिम्फोसाइटों के घनत्व ढाल centrifugation जुदाई के लिए, 1 कमरे के तापमान पर एक 1X पीबीएस के बराबर मात्रा साथ heparinized रक्त पतला.
- Ficoll 15 मिलीलीटर (कमरे के तापमान पर गरम) 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों को जोड़ें. धीरे धीरे उपरिशायीFicoll के शीर्ष पर पतला रक्त मिश्रण के 25 मिलीलीटर. ब्रेक के साथ बंद कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से एक पाश्चर विंदुक के साथ लिम्फोसाइट इंटरफ़ेस (मीडिया और Ficoll के बीच सफेद अंगूठी) को हटाने और एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण.
- ट्यूब भरने पीबीएस के साथ 50 मिलीग्राम और 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं को धो लें. तैरनेवाला त्यागें और एक ही व्यक्ति से ट्यूब एक ट्यूब और परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMC) गठबंधन 20 मिलीलीटर पीबीएस के साथ फिर से धोना. फिर PBMC गिनती और 5 x 10 7 कोशिकाओं / एमएसीएस बफर में मिलीलीटर की एक एकाग्रता में resuspend (1 2 सीए के एल पीबीएस मुक्त + और 2 मिलीग्राम +, 5 ग्राम बीएसए, और 2 mmol EDTA).
- आदेश में टी सेल अंश को अलग करने के लिए, PBMC (10 8 कोशिकाओं) के 2 मिलीलीटर के साथ शुरू और पैन EasySep मानव टी सेल संवर्धन किट से टी कोशिका संवर्धन समाधान के 100 μl जोड़ें. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. समाधान और एक और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते चुंबकीय कणों के 100 μl जोड़ें. विलायक 2.5 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा लाओ और बैंगनी चुंबक में 5 मिनट के लिए ट्यूब जगह. जल्दी से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में + CD3 अंश डालना.
- 5 मिलीलीटर ठंड एमएसीएस बफर जोड़कर कोशिकाओं धो, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गिनती, और FACS धुंधला के लिए एक नि: शेष भाजक हटा.
- 980 μl बर्फ ठंड एमएसीएस बफर में CD161 + कोशिकाओं, 1 resuspend समृद्ध टी कोशिकाओं का चयन करने के लिए, 10 ग्राम विरोधी CD161 mAb जोड़ने के लिए, और 10 मिनट के लिए फ्रिज में सेते हैं.
- 1500 आरपीएम पर कोशिकाओं के 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. तो एमएसीएस बफर के 800 μl में पुनर्गठित सेल गोली. विरोधी माउस IgG1 microbeads के 200 μl जोड़ें और 4 बजे 10 मिनट के लिए समाधान सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- इस ऊष्मायन चरण के दौरान, 3 मिलीग्राम एमएसीएस बफर जोड़कर एक लोकसभा स्तंभ समभार बनाना.
- अगले 4 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए 1,500 rpm centrifuging द्वारा कोशिकाओं को धो लो. Resu3 मिलीग्राम एमएसीएस बफर में कोशिकाओं खर्च करते हैं. फिर रास एमएसीएस को अलग स्तंभ में कोशिकाओं विंदुक. धीरे pipetting द्वारा बुलबुले पैदा करने से बचने के लिए सुनिश्चित करें. एमएसीएस बफर के 3 मिलीलीटर जोड़कर स्तंभ कुल्ला. दो बार दोहराएँ.
- 3 मिलीलीटर ताजा एमएसीएस बफर जोड़ें और चुंबक से स्तंभ हटा दें. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह स्तंभ. सवार डालें और शुद्ध CD161 CD3 + + कोशिकाओं प्राप्त सामग्री को पुश करने के लिए. गणना NKT सेल अंश समृद्ध. आप 2-4000000 कोशिकाओं को होना चाहिए.
3. aAPC की मध्यस्थता NKT सेल विस्तार
- 16 मिलीलीटर पूरा मध्यम (पूरा + मध्यम IL-2, 100 यू / एमएल) में 10 6 समृद्ध CD161 CD3 + + टी कोशिकाओं और 10 6 aAPC जोड़कर सह संस्कृति सेट. इस मिश्रण एक साथ 96 ऊतक संस्कृति का इलाज polystyrene 160 μl / अच्छी तरह से अंतिम मात्रा जोड़ने, कम वाष्पीकरण ढक्कन के साथ यू नीचे प्लेट प्लेट. ताजा माध्यम के 80 μl जोड़कर मध्यम विनिमय हर 7 वें दिन प्रदर्शन.
- फसलकोशिकाओं, गिनती, और 12-14 दिन पर प्रदर्शन FACS धुंधला हो.
- विस्तारित NKT कोशिकाओं replated 3.1 चरण में ऊपर वर्णित के रूप में कर सकते हैं, विशेष रूप से 16 मिलीलीटर पूरा मध्यम में 10 6 विस्तारित टी कोशिकाओं और 10 6 aAPC resuspend. इस मिश्रण μl / अच्छी तरह से एक साथ 96 यू नीचे प्लेट 160 जोड़कर प्लेट. Coculture मध्यम हर 7 वें दिन ताज़ा ताजा माध्यम के 80 μl जोड़कर जारी.
- यह सबसे अच्छा है विस्तार के दूसरे दौर के बाद अतिरिक्त NKT कोशिकाओं (1 6 x10 / मिलीलीटर 1-5% DMSO / 95% FBS में cryovial फ्रीज.)
4. कार्यात्मक टेस्ट: NKT कोशिकाओं की मध्यस्थता की उत्तेजना aAPC
- 5x10 4 NKT कोशिकाओं सेट / 96 अच्छी तरह से थाली U नीचे में 200 μl अंतिम मात्रा (पूरा मध्यम) में अच्छी तरह 5x10 5 aAPC साथ.
- 24-48 घंटे के बाद हार्वेस्ट सेल एलिसा के लिए संस्कृति तैरनेवाला.
Representative Results
के साथ साथ हम CD1d पुलिस महानिरीक्षक आधारित aAPC, चुंबकीय मोती NKT कोशिकाओं (चित्रा 1) के प्रचार के लिए एक मानकीकृत पद्धति के रूप में NKT कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए CD1d पुलिस महानिरीक्षक और विरोधी CD28 एमएबी की सहसंयोजक युग्मन द्वारा किए गए पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. एक प्रदर्शित करना चाहिए कि CD1d पुलिस महानिरीक्षक संलयन प्रोटीन stably चुंबकीय मोतियों की सतह पर स्थिर कर रहे हैं. के रूप में चित्रा 2A, CD1d पुलिस महानिरीक्षक और विरोधी CD28 दिखाया एंटीबॉडी दोनों चुंबकीय मोतियों की सतह पर व्यक्त किया गया. Stimulatory क्षमता की aAPC की जांच करने के लिए, हम aAPC रातोंरात, काटा संस्कृति supernatants और मापा एलिसा द्वारा उत्पादन IL-2 के साथ सह सुसंस्कृत NKT सेल हाइब्रिडोमास. हमने पाया है कि CD1d आईजी आधारित aAPC के बराबर या उनके सेलुलर समकक्षों की तुलना में उच्च स्तर पर NKT सेल हाइब्रिडोमास को प्रोत्साहित (3 चित्रा, नहीं दिखाया डेटा) करने में सक्षम थे. दिलचस्प है, हमने पाया है कि हमारे माउस NKT सेल हाइब्रिडोमास मानव CD1d आधारित aAPC (Fi द्वारा प्रेरित कर रहे हैंgure) 2B, जो aAPC के प्रत्येक बैच के परीक्षण के लिए सरल तरीका प्रदान करता है.
अगला, हम aAPC के प्रचार - प्रसार की क्षमता प्रदर्शित करने की मांग, इस प्रकार मानव टी कोशिकाओं परिधीय रक्त से अलग थे. पहले CD161 CD3 + + टी सेल अंश चुंबकीय मनका जुदाई से समृद्ध किया गया था. फिर, टी कोशिकाओं α-GalCer भरी हुई aAPC के साथ सप्ताह में दो बार से प्रेरित थे. महत्वपूर्ण बात है, हमने पाया है कि एक अपेक्षाकृत कम प्रारंभिक NKT सेल की आबादी (0.03%) के साथ भी, हम ~ 67 Vα24% + Vβ11 + (चित्रा 3) कोशिकाओं का विस्तार करने में सक्षम थे. हम कई स्वस्थ स्वयंसेवकों और कैंसर रोगियों के PBMC से NKT कोशिकाओं का विस्तार किया है और पाया है कि α-GalCer लोड aAPC दोनों समूहों में NKT कोशिकाओं जनसंख्या का विस्तार करने में सक्षम थे. विशेष रूप से, विस्तार दर अत्यधिक दाता निर्भर था. जैसी कि उम्मीद थी उच्च Vα24 + कोशिकाओं की प्रारंभिक आबादी है, अधिक से अधिक विस्तार का प्रतिशत. इसके अलावा,जब 2 मिलियन कोशिकाओं के एक प्रारंभिक जनसंख्या का उपयोग CD161 CD3 + + टी कोशिकाओं, एक विस्तार के दो दौर के बाद (1 टेबल)> 10 7 कोशिकाओं को प्राप्त कर सकते हैं. विस्तारित NKT कोशिकाओं के लगभग 80-90% CD4 +, ~ 5% CD8 +, और शेष संभाव्यतः सीडी 4 CD8 डबल नकारात्मक NKT कोशिकाओं. ये विस्तारित NKT कोशिकाओं कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में 4A - सी चित्रा में दिखाया. हमने पाया है कि हमारे पूर्व vivo का विस्तार NKT कोशिकाओं α-GalCer उत्तेजना के लिए उत्तरदायी रहते और IL-17A, TNF-α, और IFN-γ शक्तिशाली उत्पादकों हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यदि प्रारंभिक की टी कोशिका संवर्धन आबादी कम है और एक 2 CD161 संवर्धन कदम प्रदर्शन करने में असमर्थ है, विस्तार aAPC मध्यस्थता उम्मीद परिणाम (चित्रा 4D, एक दाता देखें) नहीं उपज सकता. हालांकि, अगर परिसंचारी NKT कोशिकाओं का प्रतिशत 0.1% से अधिक है, एक अभी भी एक महत्वपूर्ण विस्तार को प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिएमैं NKT कोशिकाओं की. सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से दिखाना है कि CD1d आधारित aAPC को प्रभावी ढंग से विस्तार करने के लिए और प्राथमिक मानव NKT कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1. योजनाबद्ध आरेख CD1d की: आईजी आधारित aAPCs CD1d अणु के बाह्य भाग एक immunoglobulin भारी श्रृंखला एक छोटी एमिनो एसिड linker द्वारा अलग प्रोटीन की लगातार क्षेत्र में जुड़े हुए हैं. इन अणुओं को आसानी से α GalCer रूप में लिपिड एंटीजन, के साथ लोड किया जा सकता है, बस उन्हें ब्याज के लिपिड की एक अतिरिक्त के साथ incubating द्वारा. aAPC चुंबकीय मोतियों को CD1d पुलिस महानिरीक्षक और विरोधी सीडी Abs युग्मन द्वारा किए गए थे. इस प्रणाली में, CD1d पुलिस महानिरीक्षक TCR और विरोधी CD28 MAB costimulatory संकेत प्रदान करता है के माध्यम से आत्मीय प्रतिजन विशिष्ट संकेत प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 2. आईजीजी डिमर (पीई संयुग्मित विरोधी माउस IgG1 धुंधला के माध्यम से) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विरोधी CD28 एंटीबॉडी (FITC संयुग्मित विरोधी माउस IgG2a का उपयोग करते हुए): सतह प्रोटीन की aAPCs पर FACS धुंधला हो जाना एक) aAPCs CD1d की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया गया . ओपन histograms निर्धारण का नियंत्रण संकेत मिलता है, भरे histograms संकेत एंटीबॉडी का प्रतिनिधित्व करते हैं. NKT कोशिकाओं द्वारा CD1d पुलिस महानिरीक्षक व्यक्त aAPC आईएल -2 उत्पादन को प्रोत्साहित कर सकते हैं. बी) Vα14 + माउस NKT सेल हाइब्रिडोमा, DN32.D3, या तो मध्यम, घुलनशील प्रतिजन (α-GalCer), unloaded aAPC या α-GalCer भरी हुई aAPC साथ cocultured किया गया था. संस्कृति supernatants काटा और मानक सैंडविच एलिसा IL-2 उत्पादन को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
चित्रा 3. NKT कोशिकाओं के CD1d आईजी लेपित कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं द्वारा विस्तार. (ए) प्राथमिक CD3 CD161 + + डबल सकारात्मक कोशिकाओं चुंबकीय जुदाई का उपयोग PBMCs से अलग थे. क्रमबद्ध कोशिकाओं α GalCer लोड, CD1d पुलिस महानिरीक्षक 14 दिनों के लिए लेपित aAPC साथ प्रेरित थे. कोशिकाओं Vα24 और Vβ11 निम्नलिखित aAPC उत्तेजना के लिए दाग थे. (बी) एक बी कोशिका लिंफोमा लाइन के प्राथमिक मानव NKT सेल lysis मध्यस्थता. C1R CD1d प्रतिजन की उपस्थिति या अनुपस्थिति, 96 20-24 घंटे के लिए अच्छी तरह से यू नीचे प्लेटों में एक GalCer (100 एनजी / मिली) में संकेत अनुपात में NKT कोशिकाओं के साथ incubated कोशिकाओं. NKT सेल मध्यस्थता सेल मानक 51Cr रिहाई की परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था.
चित्रा 4. AAPC विस्तार NKT कोशिकाओं के Cytokine प्रोफाइल. 5 अच्छी तरह / 10) α-GalCer घुलनशील / PMA Ionomycin, anti-CD3/28 microbeads, या α-GalCer लोड aAPC के साथ cocultured साथ उत्तेजना के बाद (2 × 10 / अच्छी तरह से 5) 48 घंटे के लिए. (ए) आईएल-17A, (बी) TNF-α, और (सी) IFN-γ उत्पादन मानक cytokine एलिसा द्वारा मापा गया था. दिखाया गया डेटा नकारात्मक नियंत्रण (मीडिया और खाली मोती) को घटाने के बाद शुद्ध cytokine उत्पादन कर रहे हैं. (D) PBMC चुंबकीय मनका जुदाई का उपयोग प्राथमिक टी कोशिकाओं से अलग थे. क्रमबद्ध कोशिकाओं को दो सप्ताह के लिए एक GalCer लोड aAPC संकेत से प्रेरित थे. कोशिकाओं Vα24 लिए विशिष्ट पेट का उपयोग दाग थे और Vβ11 + और प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया.
Discussion
aAPC NKT सेल सक्रियण के लिए बुनियादी आवश्यकताओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह दत्तक immunotherapy के लिए एन.के. टी कोशिकाओं की पूर्व vivo विस्तार के लिए संभावित नैदानिक मूल्य है. पहली मनका आधारित प्रणालियों के Mescher एट अल., Biotinylated murine जहां MHC वर्ग मैं पेप्टाइड एकल श्रृंखला constructs वर्णित किया गया biotinylated costimulatory B7.1 और streptavidin माध्यम B7.2 अणुओं के साथ लाटेकस microspheres 14, 15 की सतह के लिए संयुक्त. यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक ट्रांसजेनिक चूहों से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए किया गया है. इसके अलावा, के बाद से इस दृष्टिकोण MHC अणुओं के समरूप लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए एक एकल श्रृंखला परिसर MHC पेप्टाइड का उपयोग करता है, तो प्रत्येक लक्ष्य पेप्टाइड प्रतिजन वांछित एकल श्रृंखला MHC-पेप्टाइड परिसर की अभिव्यक्ति के लिए एक नई अभिकर्मक की आवश्यकता होती है, इस प्रकार की व्यापकता को सीमित होगा दृष्टिकोण. महत्वपूर्ण बात है, डॉ. Schneck समूह मनका आधारित aAPC एक और गैर सेलुलर मनका आधारित aAPC के विकास का बीड़ा उठाया, चुंबकीय मोतियों पर एचएलए पुलिस महानिरीक्षक, 1 संकेत, और विरोधी CD28, 2 संकेत युग्मन द्वारा बनाई गई है. एचएलए पुलिस महानिरीक्षक, एचएलए का एक अद्वितीय multimeric फार्म एक immunoglobulin आणविक पाड़ 16, 17 के लिए जुड़े हुए उनके समूह द्वारा विकसित किया गया था. बाद में, वे MHC-आईजी आधारित aAPC का विकास किया है, जो प्रभावी ढंग से सीएमवी और मार्ट एक विशिष्ट 18 सीटीएल का विस्तार करने के लिए दिखाया गया है. यहाँ, हम दिखा दिया है कि CD1d पुलिस महानिरीक्षक आधारित aAPC कार्यात्मक NKT कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अध्ययन में एक इसी तरह की प्रणाली का इस्तेमाल किया गया है एन.के. कोशिकाओं की 19 CD1d साथ शारीरिक संपर्क की जांच की.
विशेष रूप से, हम एक कृत्रिम प्रतिजन सेल है जो किसी भी आवश्यकताओं के हम इष्टतम NKT सेल प्रसार के लिए आवश्यक हैं के लिए अनुकूल है डिजाइन किए हैं. aAPC विस्तार विधि विस्तार और समृद्ध मानव NKT कोशिकाओं के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. हमारे aAPC व्यवस्थित संभावित costimulatory अणुओं के एक पैनल की भूमिका का मूल्यांकन और NKT सेल प्रसार पर उनकी भूमिका का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैtion और समारोह. इस प्रकार, aAPC एक मजबूत बहुमुखी NKT कोशिकाओं उत्प्रेरण और विस्तार के लिए उपयोगी प्रौद्योगिकी का प्रतिनिधित्व करते हैं. aAPCs की पीढ़ी के कम से कम एक सप्ताह लेता है और मोतियों की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए उपयुक्त है. हालांकि, aAPC पैदा करने में पुष्टि की है कि पुलिस महानिरीक्षक CD1d stably मोतियों की सतह पर स्थिर है और उनकी कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए बैच के बैच के लिए स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रणाली का एक संभावित सीमा है कि वहाँ जगह में एक तंत्र के लिए रवाना उत्तेजना बारी, मोतियों की यांत्रिक हटाने के अलावा अन्य नहीं है. विशेष रूप से, प्रतिजन के साथ टी सेल रिसेप्टर (TCR) की सगाई: CD1d/MHC जटिल आम तौर पर सहायक / आसंजन अणुओं के साथ मिलकर प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse, है जो दोनों टी सेल और पर निरोधात्मक या दमनकारी कारकों की प्रेरण में परिणाम कर सकते हैं उत्पन्न प्रतिजन सेल पेश. AAPC प्रणाली में, इन कारकों टी सेल द्वारा upregulated किया जा सकता है, लेकिन मनका आत्मीय ligands नहीं व्यक्त करेंगेइन रिसेप्टर्स के लिए.
इसके अलावा, CD4 + NKT कोशिकाओं को चूहों और इंसानों में अर्बुदरोधी प्रतिक्रियाओं को दबाने के लिए दिखाया गया है, इसलिए यह संभव है कि सभी NKT कोशिकाओं (यानी α-GalCer के साथ वैश्विक उत्तेजना) या गलत सबसेट की सक्रियता के nonselective सक्रियण अवांछित प्रतिरक्षाविज्ञानी में परिणाम सकता है परिणाम. नतीजतन, एक phenotypically और कार्यात्मक aAPC विस्तार NKT सेल की आबादी को चिह्नित करना चाहिए. के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है, हमने पाया है कि α-GalCer भरी हुई aAPC के साथ उत्तेजना विरोधी CD28 व्यक्त NKT कोशिकाओं TH1 उत्पादन, Th2, और Th17 प्रकार साइटोकिन्स परिणाम कर सकते हैं. Murine अध्ययनों की रिपोर्ट है कि IL-33, एक हाल ही में पहचाना cytokine, के साथ चुनौती IL-5 और IL-13 के रूप में भड़काऊ साइटोकिन्स परिसंचारी के स्तर में वृद्धि के परिणामस्वरूप. NKT कोशिकाओं के आईएल-33 के साथ इलाज उनके cytokine 20 उत्पादन बढ़ाया. 33 आईएल ST2 के लिए एक विशिष्ट ligand है और यह दिखाया गया है कि घुलनशील ST2 can ब्लॉक IL-33 संकेतन. इस प्रकार, एक भविष्य आवेदन के एक उदाहरण के रूप में, aAPC व्यक्त ST2 और उत्पन्न किया जा सकता है यदि एक निर्धारित करने चुनिंदा Th2 साइटोकिन्स का उत्पादन रोकना जबकि NKT कोशिकाओं द्वारा TH1 cytokine स्राव उत्प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया. यह भी कहा गया है कि चतुर्थ के इंजेक्शन Kb व्यक्त में aAPC C57BL / 6 चूहों कम 21 ट्यूमर के फेफड़ों मेटास्टेसिस में हुई. महत्वपूर्ण बात है, इन आंकड़ों है कि फेफड़ों के लिए यातायात aAPC प्रदर्शन और effector टी सेल सबसेट को सक्रिय करने में सक्षम हैं. इसलिए, एक aAPC के कई प्रकार उत्पन्न करने के लिए और विशिष्ट प्रतिजन टी सेल सबसेट के बीच परस्पर क्रिया की जांच सकता है. संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, इन अध्ययनों दिखाना है कि CD1d आईजी आधारित aAPC सामान्य सेलुलर APC की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है, और NKT सेल immunotherapy आधारित दत्तक के लिए वर्तमान नैदानिक दृष्टिकोण को बढ़ाने की क्षमता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उपयोगी विचार - विमर्श के लिए प्रियंका सुब्रह्मण्यम का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. लेखकों को कोई वित्तीय हित प्रतिस्पर्धा है. इस काम अमेरिकन कैंसर सोसायटी, NIH / NCI CA131487 K01, CA162273 R21, R21, CA162277 और P30 ट्यूमर इम्यूनोलॉजी और Immunotherapy TJ वेब के लिए कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के अधिकारी विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
| EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
| Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
| Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
| Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
| M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
| Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
| RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | ||
| Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
| PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
| PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
| FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
| PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
| PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
| FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
| IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
| Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
| BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |
References
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