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Neuroscience

क्षुधावर्धक साहचर्य में घ्राण सीखने doi: 10.3791/4334 Published: February 18, 2013

Summary

ड्रोसोफिला लार्वा स्वाद इनाम के साथ सहयोगी गंध उत्तेजनाओं करने में सक्षम हैं. यहाँ हम एक सरल व्यवहार प्रतिमान कि क्षुधावर्धक साहचर्य घ्राण सीखने के विश्लेषण की अनुमति देता का वर्णन.

Protocol

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1. तैयारी

  1. डिग्री सेल्सियस और 60% -80% / 10 14 प्रकाश / अंधेरे चक्र में नमी ड्रोसोफिला लार्वा जंगली प्रकार 25 में उठाए गए हैं. हमेशा 20 महिलाओं में 10 पुरुषों के साथ एक शीशी (6 सेमी ऊंचाई और 2.5 सेमी व्यास) कि मानक मक्खी भोजन के बारे में 6 मिलीलीटर शामिल में डाल रहे हैं लार्वा की सही उम्र को नियंत्रित करने के लिए. मक्खियों के लिए 12 घंटे के लिए अंडे देना करने के लिए अनुमति दी जाती है और दूसरे दिन एक नई शीशी स्थानांतरित कर रहे हैं. लार्वा अंडे बिछाने के बाद 5-6 दिनों के खिला 3 Rd instar मंच तक पहुँचने अगर 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाया है और अब व्यवहार के प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, एक करने के लिए केवल लार्वा है कि भोजन में अभी भी शीशी की ओर से लार्वा नहीं कर रहे हैं और सुनिश्चित करने के लिए है. इन लार्वा पहले से ही "भटक 3 Rd instar मंच" तक पहुँच चुके हैं - शीघ्र ही प्यूपीकरण पहले और उनके उपयोग के परिणामों की व्याख्या पेचीदा.
  2. 2.5% agarose पेट्री डिश (अन्य प्रयोगशालाओं भी प्रयोग भर में 1% की अगर सांद्रता का उपयोग करते हैं, कैसे की तैयारीकभी कम सांद्रता खिला 3 Rd instar लार्वा सब्सट्रेट में खुदाई करने के लिए) की अनुमति दे सकता है: 100 मिलीलीटर DDH 2 ओ में 2.5 छ agarose भंग एक माइक्रोवेव में समाधान गर्मी जब तक यह उबलने लगता है. ध्यान समाधान को उत्तेजित करना है और इसे वापस रख माइक्रोवेव में जब तक सभी agarose भंग कर रहा है. पेट्री ऐसी है कि पेट्री डिश के नीचे पूरी तरह से कवर किया जाता है और agarose समाधान एक चिकनी सतह रूपों व्यंजन में गर्म agarose समाधान डालो. समाधान के लिए कमरे के तापमान को नीचे शांत और lids बंद. Lids तुरंत नहीं बंद करने के लिए, क्योंकि यह पानी के संघनन के लिए lids अनुमति होगी.
  3. 2M fructose पेट्री डिश की तैयारी: 100 मिलीलीटर DDH 2 ओ (फिर से, 1% अगर एकाग्रता का उपयोग संभव है, लेकिन यह 3 Rd instar लार्वा सब्सट्रेट में खुदाई करने के लिए खिला अनुमति दे सकता है) में 2.5 g agarose भंग है. एक माइक्रोवेव में समाधान गर्मी जब तक यह उबलने लगता है. ध्यान समाधान को उत्तेजित करना है और यह माइक्रो में वापस डालसभी agarose जब तक लहर भंग कर रहा है. ध्यान से गर्म समाधान में fructose के 35 ग्राम जोड़ने के लिए, धीरे धीरे मिश्रण को उत्तेजित करना है जब तक कि चीनी उबलते मंदता से बचने के लिए भंग कर रहा है. पेट्री व्यंजन है कि इस तरह के नीचे पूरी तरह से कवर किया जाता है और fructose-agarose समाधान एक चिकनी सतह रूपों में गर्म समाधान fructose agarose डालो. समाधान के लिए कमरे के तापमान को नीचे शांत और lids बंद. Lids तुरंत नहीं बंद करने के लिए, क्योंकि यह पानी के संघनन के लिए lids अनुमति होगी.
  4. 1-octanol (अक्टूबर) गंध कंटेनरों की तैयारी: एक Teflon गंध कंटेनर बनाया कस्टम में शुद्ध अक्टूबर के 10 μl भरें और यह एक ढक्कन कि गंध से वाष्पीकरण के लिए अनुमति देने के लिए कई छोटे छेद के साथ बंद हुआ. कंटेनरों का एक विस्तृत विवरण Gerber और Stocker 2007 में दिया जाता है. अक्टूबर के लिए तीन गंध कंटेनर तैयार. गंध कंटेनरों डाला रसायनों के वाष्पीकरण के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन से बचने के लिए है कि लार्वा उन्हें सीधे संपर्क कर सकते हैं. इस प्रकार, विशेष रूप से यहाँ वर्णित प्रयोगोंस्वाद साइड इफेक्ट perturbing बिना लार्वा में घ्राण सीखने पता.
  5. Amylacetate गंध (AM) कंटेनरों की तैयारी: पतला 1:50 AM पैराफिन तेल में. एक कस्टम बनाया Teflon गंध कंटेनर में कमजोर पड़ने की 10 μl भरें और यह एक ढक्कन कि गंध के वाष्पीकरण के लिए अनुमति देने के लिए कई छोटे छेद के साथ बंद हुआ. AM के लिए तीन गंध कंटेनर तैयार. कमजोर पड़ने व्यावहारिक कारणों के लिए महत्वपूर्ण है, अर्थात् करने के लिए एक दूसरे पर गंध है कि दो odors के बीच रिश्तेदार वरीयता में परिवर्तन सीखने निर्भर मुखौटा हो सकता है के लिए एक मजबूत वरीयता से बचने के लिए. दोनों odors के लिए बराबर आकर्षण के लिए प्रयोगशाला में प्रयोग से पहले भोले जानवरों के साथ बाद में वर्णित परीक्षण (2.5) को लागू करने के द्वारा पुष्टि की आवश्यकता हो सकती है. मूल्यों यहाँ प्रस्तुत है कि हाल ही में हमारे 9,15,16 प्रयोगशाला द्वारा reproduced थे Gerber प्रयोगशाला के कई प्रकाशनों के आधार पर कर रहे हैं.
  6. पेट्री डिश के लेबल: व्यवहार प्रयोगों इससे पहले सभी पेट्री डिश कोडित है. कि इसका मतलब है किपेट्री डिश युक्त fructose उदाहरण के लिए एक "एक्स" या एक 'ए' और agarose केवल एक "वाई" या एक "बी" के साथ पेट्री डिश के साथ चिह्नित किया है. इस कोड experimenter के बाद ही सभी डेटा दर्ज किया गया है पता चल जाना चाहिए. प्रयोगों प्रदर्शन करके यह "अंधा" इस प्रकार है कि प्रयोगकर्ता की अपेक्षाओं को लार्वा के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं संभव नहीं है. हम केवल वातानुकूलित (CS1 या CS2) उत्तेजनाओं कि या तो जब एक fructose पेट्री (+) पकवान या गैर पुरस्कृत पर प्रस्तुत जब एक ही agarose पर प्रस्तुत पुरस्कृत कर रहे हैं के रूप में odors के बारे में बात करेंगे निम्नलिखित में व्यापक पाठकों के लिए एक समझ कम पेट्री डिश (-).

2. चीनी इनाम प्रशिक्षण और टेस्ट

  1. 30 खिला एक भोजन शीशी से 3 Rd instar लार्वा ले लीजिए. उन्हें पहली बार एक पेट्री डिश है कि नल के पानी की कुछ बूँदें शामिल करने के लिए स्थानांतरण और ध्यान से उन्हें एक ब्रश के साथ आगे और पीछे की ओर ले जाने के. उन्हें एक दूसरे पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण भी है कि नल के पानी की कुछ बूँदें हैंआतंकवाद की जांच करने के लिए कि कोई भोजन पेस्ट लार्वा के bodywall पर रहता है, अन्यथा लार्वा प्रयोग के दौरान खाना गंध का अनुभव करने में सक्षम होगा. यह संभावना सीखने और परीक्षण की स्थिति में उनके प्रदर्शन की प्रक्रिया अस्पष्ट होगा.
  2. प्रशिक्षण: एक क्षुधावर्धक चीनी क्यू निम्नलिखित शासन के साथ सहयोगी odors लार्वा को प्रशिक्षित करने के लिए लागू किया जाता है. एक "X" के रूप में चिह्नित की बाईं और दाईं ओर पर एक अक्टूबर गंध कंटेनर रखो - इस प्रकार, fructose इनाम (+) पेट्री डिश युक्त ("अंधा" प्रयोग के लिए, विवरण देखते हैं 1.6). पेट्री डिश के बीच पर 30 खिला 3 Rd instar लार्वा के समूह रखो, ढक्कन बंद और 5 मिनट के लिए इंतजार करते हुए जानवरों अक्टूबर को उजागर कर रहे हैं. सुनिश्चित करें कि लार्वा पानी की बूंद के अंदर फंस नहीं कर रहे हैं और यह की सतह के तनाव को दूर कर सकते हैं. पेट्री डिश पर कि लार्वा करके आसानी से स्थानांतरित कर सकते हैं और घ्राण और / या स्वाद उत्तेजनाओं का अनुभव.
  3. प्रशिक्षण: एक सिक्त ब्रश के साथ पेट्री डिश से लार्वा निकालें और हस्तांतरणइस प्रकार, agarose केवल (-) पेट्री डिश युक्त एक दूसरे पेट्री डिश है कि एक "वाई" के साथ लेबल है पर हूँ और एक AM गंध अपने बाएँ और दाएँ पक्ष पर स्थित कंटेनर है. ढक्कन बंद करें और 5 मिनट के लिए इंतजार करते हुए जानवरों AM को उजागर कर रहे हैं.
  4. प्रशिक्षण: 2.2 दोहराएँ) और 2.3) में दो बार है कि इस तरह के सभी 30 लार्वा अनुभव तीन प्रशिक्षण चक्र: / CS1 (+) - CS2 (/ -); CS1 / (+) - CS2 (/ -); CS1 / (+) - / CS2 (-). इस प्रयोग में CS1 अक्टूबर और AM CS2 कोड का प्रतिनिधित्व करता है.
  5. टेस्ट: AM जगह एक और एक agarose केवल पेट्री डिश का विरोध साइटों पर एक अक्टूबर गंध कंटेनर. प्रशिक्षित जानवरों को परीक्षण पेट्री डिश के बीच में स्थानांतरित. ढक्कन बंद और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. इसके बाद बाईं ओर, परीक्षण पेट्री डिश के बीच और सही पक्ष पर लार्वा की संख्या गिनती.
  6. 2.5) 2.1 चरणों) 30 खिला 3 Rd instar लार्वा के एक दूसरे समूह के साथ लेकिन दोहराएँ AM और अक्टूबर की है कि इस तरह के जानवरों को निम्नलिखित प्रशिक्षण प्राप्त प्रयोगात्मक भूमिका स्वैप: CS2/ (+) - CS1 / (-), / CS2 (+) - CS1 / (-), / CS2 (+) - CS1 / (-). इस प्रयोग में CS1 अक्टूबर और AM CS2 कोड का प्रतिनिधित्व करता है.
  7. प्रशिक्षण के लिए संभव व्यवस्था. ऊपर हम एक प्रशिक्षण है कि या तो / अक्टूबर (+) के तीन प्रशिक्षण परीक्षणों के मौजूद मौजूद AM / (-) या भी तीन एएम / (+) प्रशिक्षण परीक्षणों के पारस्परिक समूह में अक्टूबर / (-). हालांकि प्रशिक्षण के दौरान अनुक्रम निर्भर प्रभाव से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है पूरा प्रयोग के निम्नलिखित repetitions में उत्तेजनाओं के अनुक्रम भिन्न. CS1 या CS2 और 1 या 2 प्रस्तुत थाली में भी इनाम प्रस्तुति क्रम अलग करके, प्रशिक्षण परीक्षण के लिए चार अलग - अलग दृश्यों संभव हैं:
पहले समूह / CS1 (+) - CS2 / (-) पारस्परिक समूह / CS2 (+) - CS1 / (-)
CS1 / (-) - / CS2 (+) CS2 / (-) - सीएस1 / (+)
/ CS2 (+) - CS2 / (-) / CS1 (+) - CS2 / (-)
CS2 / (-) - CS1 / (+) CS1 / (-) - / CS2 (+)

आसपास के वातावरण में प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं के व्यवस्थित प्रभाव को रोकने के लिए, एक कि अक्टूबर छोड़ दिया पर प्रस्तुत किया है और सही करने के लिए इस तरह के मामलों की एक आधा में परीक्षण प्रदर्शन करना चाहिए. चाहिए मामलों के दूसरे आधे में छोड़ दिया और सही पर अक्टूबर को प्रस्तुत किया.

3. टास्क प्रासंगिक संवेदी मोटर संकायों के लिए टेस्ट

ऊपर वर्णित प्रयोगों के डिजाइन जंगली प्रकार में अपने दम पर 3 Rd instar लार्वा खिला गंध चीनी सीखने का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है. हालांकि, दैनिक प्रयोगशाला जीवन शोधकर्ताओं में आम तौर पर दो या अधिक लार्वा के विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों का उपयोग की तुलना करने के लिए, अगर घ्राण सीखने के एक सममूल्य पर निर्भर करता हैticular जीन, न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट सेट, एक उत्परिवर्ती स्टॉक, एक विशेष खाद्य आहार, अलग पालन शर्तों, जहरीले रसायनों के विकास के दौरान जोड़ा गया, आदि इस प्रकार, सभी मामलों में जब लार्वा के दो या दो से अधिक प्रयोगात्मक समूहों का परीक्षण कर रहे हैं एक के लिए एक नहीं है अनिवार्य नियंत्रण प्रयोगों के स्थापित करने के लिए परीक्षण करने के लिए, अगर लार्वा के विभिन्न समूहों को उचित संवेदी मोटर acuities दिखाते. यह अनिवार्य हो जाता है, के रूप में संभावित phenotypes जरूरी चीनी के साथ एसोसिएट odors को कम या समाप्त कर दिया क्षमताओं की वजह से नहीं कर रहे हैं. बल्कि, संभावित सीखने दोष odors और / या चीनी के प्रसंस्करण में संवेदी मोटर circuitry के किसी भी कदम पर दोष के आधार पर किया जा सकता है. या दूसरे शब्दों में, अगर एक उत्परिवर्ती लार्वा भावना चीनी करने में सक्षम नहीं है, यह एक चीनी स्मृति नहीं स्थापित कर सकते हैं. लेकिन इस समापन है कि लार्वा नहीं सीख सकते हैं अनुमति नहीं है. विस्तार में निम्नलिखित नियंत्रण प्रयोगों के लिए उचित अक्टूबर AM, और ट्रांसजेनिक लार्वा के fructose प्रसंस्करण के लिए परीक्षण किया जा सकता है.

1. भोले अक्टूबर prefe के लिए टेस्टrence

30 खिला एक भोजन शीशी से 3 Rd instar लार्वा ले लीजिए. उन्हें ध्यान से नल के पानी में 2.1 में वर्णित के रूप में धो लें. एक agarose पेट्री डिश के एक तरफ एक एकल अक्टूबर गंध कंटेनर रखो, पेट्री डिश के बीच पर लार्वा जोड़ने के लिए, ढक्कन बंद करें और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, जैसे है कि लार्वा पेट्री डिश और पूरबी अक्टूबर की ओर क्रॉल कर सकते हैं गंध स्रोत. इसके बाद बाईं ओर बीच में और परीक्षण पेट्री डिश के दाईं ओर पर लार्वा की संख्या गिनती.

2. अनुभवहीन हूँ वरीयता के लिए टेस्ट

30 खिला एक भोजन शीशी से 3 Rd instar लार्वा ले लीजिए. उन्हें ध्यान से नल के पानी में 2.1 में वर्णित के रूप में धो लें. एक agarose पेट्री डिश के एक तरफ एक एकल गंध AM कंटेनर रखो, पेट्री डिश के बीच पर लार्वा जोड़ने के लिए, ढक्कन बंद करें और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, जैसे कि लार्वा पेट्री डिश और पूरबी पर AM ओर क्रॉल कर सकते हैं गंध स्रोत. इसके बाद एल की संख्या गिनतीबाईं ओर, बीच में और परीक्षण पेट्री डिश के सही पक्ष पर, arvae.

3. भोले चीनी वरीयता के लिए टेस्ट

30 खिला एक भोजन शीशी से 3 Rd instar लार्वा ले लीजिए. उन्हें ध्यान से नल के पानी में 2.1 में वर्णित के रूप में धो लें. पेट्री डिश है कि एक आधा और दूसरी छमाही में एक 2M फ्रक्टोज agarose मिश्रण में 2.5% agarose होते हैं तैयार. पेट्री डिश पर लार्वा जोड़ें, ढक्कन बंद करें और 5 मिनट, ऐसी है कि लार्वा पेट्री और fructose युक्त पक्ष की ओर पकवान पूरबी पर क्रॉल कर सकते हैं के लिए इंतजार. इसके बाद बाईं ओर बीच में और परीक्षण पेट्री डिश के दाईं ओर पर लार्वा की संख्या गिनती.

आधा आधा पेट्री डिश की तैयारी: सामान्य agarose प्लेटों की तैयारी के रूप में 1.2 अनुभाग में ऊपर वर्णित है. जब agarose भरा पेट्री डिश नीचे ठंडा कर रहे हैं, ध्यान से एक स्केलपेल के साथ ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ agarose में कटौती. पेट्री डिश से agarose के एक आधे निकालें. एकdd एक गर्म फ्रक्टोज agarose पेट्री डिश के आधा खाली समाधान (तैयार करने के लिए 1.3 देखें). सावधान रहो कि दोनों हिस्सों मैच और एक परिभाषित बढ़त बनाने नहीं है - इस लार्वा पसंद व्यवहार को प्रभावित करता है और एक व्यवहार बल्कि मुश्किल विश्लेषण renders 4.

शाम प्रशिक्षण

परीक्षण के बावजूद अगर ट्रांसजेनिक खिला 3 Rd instar लार्वा लिए अक्टूबर और हवा (3.1), AM और हवा (3.2) और चीनी और शुद्ध (3.3) agarose, परीक्षण प्रयोगों का एक अतिरिक्त सेट के बीच में एक जंगली प्रकार के स्तर पर भेद करने में सक्षम हैं हाल ही में किया गया है (चर्चा के लिए शुरू की Gerber और Stocker, 2007 देखें). इन प्रयोगों के लिए तर्क पीछा कर रहा है. प्रशिक्षण लार्वा के दौरान बड़े पैमाने पर हैंडलिंग और लगातार गंध और चीनी उत्तेजना से गुजरना. इस प्रकार, यह अच्छी तरह से संभव है कि मनाया सीखने phenotype गुमराह कर रहा है (हालांकि भोले गंध और चीनी धारणा परीक्षण एक जंगली प्रकार स्तर पर कर रहे हैं!). वास्तव में, यह संभव है कि ट्रांसजेनिक घ जानवरोंतनाव प्रतिरोध, प्रेरणा, थकान, संवेदी अनुकूलन, प्रासंगिक सीखने, और तृप्ति में परिवर्तन करने के लिए सम्मान के साथ जंगली प्रकार लार्वा से iffer. इस प्रकार, Michels एट अल. (2005) नियंत्रण शुरू की है कि परीक्षण है कि एक दिया उत्परिवर्ती (1) का पता लगाने में सक्षम है एक खाली गंध कंटेनर बनाम AM अगर आप बिल्कुल के रूप में प्रशिक्षण के दौरान लार्वा सिवाय इसके कि आप इनाम न आना और केवल दोनों को बेनकाब का इलाज odors, (2) एक ही शासन के बाद अक्टूबर का पता लगाने, (3) पता लगाने के लिए एक खाली गंध कंटेनर बनाम AM, यदि आप एक तरह से प्रशिक्षण की तरह है, सिवाय इसके कि आप odors को छोड़ देते हैं और केवल इनाम को बेनकाब में लार्वा का इलाज, और (4 ) एक ही regimen के बाद अक्टूबर का पता लगाने के लिए. एक व्यापक चर्चा और तरीकों पर अधिक जानकारी के लिए कृपया Michels एट अल (2005) और Gerber और Stocker (2007) देखें.

4. चीनी इनाम सीखने के लिए डेटा विश्लेषण

  1. चीनी इनाम सीखने प्रोटोकॉल के डेटा का मूल्यांकन करने प्रत्येक दो recipro के लिए एक अक्टूबर वरीयता सूचकांक (PREF अक्टूबर) की गणनाबड़ी सफाई प्रशिक्षित समूहों:
    AM / (-) 1 समूह / अक्टूबर (+) प्राप्त के लिए प्रशिक्षण:
    PREF अक्टूबर (अक्टूबर + /) = (# अक्टूबर पक्ष पर लार्वा # AM तरफ लार्वा के) / # सभी लार्वा छोड़ दिया, सही और मध्य क्षेत्र के भीतर
    : - अक्टूबर (/ -) प्रशिक्षण का दूसरा समूह है कि AM (+) / प्राप्त
    PREF AM AM (+ / अक्टूबर) = (# AM तरफ लार्वा अक्टूबर तरफ लार्वा के #) / # छोड़ दिया, सही और मध्य क्षेत्र के भीतर सभी लार्वा
  1. 4.1 से दो PREF मूल्यों के लिए एक प्रदर्शन सूचकांक (PI)) की गणना. PI गंध और सजा जोखिम, समय और हैंडलिंग के पारित होने के perturbing प्रभाव रद्द करके साहचर्य सीखने का प्रतिनिधित्व करता है:
    PI (PREF अक्टूबर (अक्टूबर + AM /) + PREF (AM + अक्टूबर /)) 2 / =
    इस प्रकार PIs -1 से 1 से लेकर कर सकते हैं. गौरतलब नकारात्मक मूल्यों aversive सीखने का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि काफी सकारात्मक मूल्यों क्षुधावर्धक सीखने का वर्णन. एक पूरा प्रयोग आम तौर पर 10 या उससे अधिक पीआईएस के शामिल हैं. डेटा बॉक्स भूखंडों includin के रूप में कल्पना कर रहे हैंजी एक दिया प्रायोगिक समूह के सभी मूल्यों. मानों की 50% बॉक्स के भीतर स्थित किया जा रहा है, मंझला प्रदर्शन सूचकांक बॉक्स साजिश के भीतर एक बोल्ड लाइन के रूप में संकेत दिया है.

5. टास्क प्रासंगिक संवेदी मोटर संकायों के लिए डेटा विश्लेषण

  1. जब परीक्षण के लिए उचित अक्टूबर गंध प्रसंस्करण के रूप में एक अक्टूबर गंध वरीयता सूचकांक की गणना करने के लिए डेटा का मूल्यांकन:
    गंध PREF अक्टूबर = (# अक्तूबर पक्ष पर लार्वा के दूसरे पक्ष पर लार्वा के) / # छोड़ दिया, सही और मध्य क्षेत्र के भीतर सभी लार्वा
  2. जब परीक्षण के लिए उचित AM गंध धारणा के रूप में एक AM गंध वरीयता सूचकांक की गणना करने के लिए डेटा का मूल्यांकन:
    / # छोड़ दिया, सही और मध्य क्षेत्र के भीतर सभी लार्वा की गंध - PREF = AM (# # दूसरी तरफ लार्वा के AM पक्ष पर लार्वा के)
  3. डेटा का मूल्यांकन करने जब उचित fructose धारणा के लिए परीक्षण के रूप में निम्नानुसार एक fructose वरीयता सूचकांक की गणना:
    दूसरी तरफ लार्वा # - PREF fructose = (# fructose तरफ लार्वा की) / # छोड़ दिया, सही और मध्य क्षेत्र के भीतर सभी लार्वा
  4. दिखावा प्रशिक्षण के लिए विवरण Michels एट अल 2005 में दिए गए हैं.

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Representative Results

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चित्रा 1A लार्वा घ्राण साहचर्य सीखने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के एक सिंहावलोकन से पता चलता है. एक चीनी इनाम लार्वा के साथ एक दो प्रस्तुत odors की जोड़ी पदक मिला नहीं गंध की तुलना में पुरस्कृत गंध की दिशा में एक आकर्षक प्रतिक्रिया व्यक्त करने की क्षमता व्यवहार प्राप्त. लार्वा के दो समूहों हमेशा या तो गंध अक्टूबर या AM साथ reinforcer बाँधना द्वारा प्रशिक्षित किया जाता है. प्रदर्शन सूचकांक (पीआई) आपस में प्रशिक्षित समूहों के बीच वरीयता में अंतर के रूप में साहचर्य समारोह के उपाय.

मामले में साहचर्य समारोह ट्रांसजेनिक लार्वा में विश्लेषण किया है, बुनियादी क्षमता संवेदी मोटर के लिए परीक्षण के लिए आवश्यक हैं. यह उन्हें एक भरा गंध कंटेनर और हवा के बीच या शुद्ध agarose और agarose प्लस एक चीनी के बीच चुनाव की पेशकश के द्वारा किया जाता है. (शाम प्रशिक्षण यहाँ नहीं दिखाया गया है). लार्वा के अंतिम वितरण एक विशिष्ट डाटा शीट में उल्लेख किया है (2 चित्रा) और विज़एक बॉक्स साजिश (चित्रा 3) के रूप में ualized. सकारात्मक परिणाम वरीयता सूचकांक और प्रदर्शन सूचकांक के मामले में भूख बढ़ाने वाला सीखने के लिए एक आकर्षक विकल्प व्यवहार से संकेत मिलता है. नकारात्मक मान इंडेक्स की गणना वरीयता के लिए एक aversive चुनाव व्यवहार से संकेत मिलता है और aversive प्रदर्शन सूचकांक के मामले में सीखने.

चित्रा 1
चित्रा 1 व्यवहार के लार्वा साहचर्य घ्राण सीखने, भोले घ्राण वरीयताओं और भोले स्वाद वरीयताओं को मापने के प्रयोगों की योजना.

  1. 30 ड्रोसोफिला खिला 3 Rd instar लार्वा एक agarose पेट्री डिश है कि 2M fructose के एक चीनी इनाम पर पाँच मिनट के लिए रखा जाता है. एक ही समय में पहली बार एक गंध Teflon कंटेनर में प्रदान की जाती है(अक्टूबर). इस प्रकार लार्वा 1 प्रशिक्षण चरण में एक सकारात्मक सुदृढीकरण के साथ एक गंध प्रोत्साहन संबद्ध कर सकते हैं. अगला, लार्वा, reinforcer बिना, लेकिन फिर 5 मिनट के लिए 2 गंध (AM) के साथ एक दूसरे agarose पेट्री डिश के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. प्रशिक्षण तीन बार दोहराया है. अंत में, परीक्षण की स्थिति में लार्वा की गंध वरीयता एक agarose पेट्री डिश पर गैर पुरस्कृत गंध के खिलाफ पुरस्कृत गंध के लिए मापा जाता है. यह पहली प्राथमिकता इंडेक्स (PREF) की गणना की अनुमति देता है. लार्वा के एक दूसरे समूह इसी तरह आपस में रास्ते में प्रशिक्षित किया जाता है. यहाँ, एक दूसरी वरीयता सूचकांक (PREF) की गणना की जा सकती है. अंत में एक प्रदर्शन सूचकांक (PI) दोनों वरीयता इंडेक्स औसत से गणना की है. आगे परीक्षणों के अनुक्रम के बारे में जानकारी के लिए भी 2.7 देखते हैं.
  2. भोले गंध वरीयता का विश्लेषण करने के लिए, एक गंध या तो अक्टूबर या AM साथ भरा कंटेनर एक शुद्ध agarose पेट्री डिश के एक तरफ रख दिया गया है. 30 खिला 3 Rd instar लार्वा पीएलएपेट्री डिश के बीच में ced और 5 मिनट के बाद पेट्री डिश पर लार्वा के वितरण में गिना जाता है. प्राप्त आंकड़ों से एक घ्राण वरीयता सूचकांक (PREF) तो गणना की है.
  3. भोले स्वाद वरीयता 2M fructose का विश्लेषण करने के लिए एक पेट्री डिश है कि अपने दूसरे पक्ष पर शुद्ध agarose शामिल एक छमाही में भर जाता है. 30 खिला 3 Rd instar लार्वा पेट्री डिश के बीच में रखा जाता है और 5 मिनट के बाद पेट्री डिश पर लार्वा के वितरण में गिना जाता है. प्राप्त आंकड़ों से एक स्वाद पसंद सूचकांक (PREF) तो गणना की है.

चित्रा 2
चित्रा 2 पंजीयन और प्रसंस्करण) चीनी इनाम सीखने के लिए प्राप्त डेटा के लिए एक कच्चे डाटा शीट का उदाहरण., बी) भोलेगंध वरीयताओं को और सी) भोले स्वाद वरीयताओं. सभी प्रयोगों के लिए बाईं ओर लार्वा के बीच में और पेट्री डिश का सही पक्ष पर, संख्या का उल्लेख कर रहे हैं. इस जानकारी वरीयता सूचकांक के बाहर (PREF) की गणना कर रहे हैं. लारवल सीखने प्रदर्शन (पीआई) सूचकांक दो आपस में प्रशिक्षित समूहों की वरीयता computating से पाने के रूप में दर्शाया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा उदाहरण 3 डेटा दृश्य) चीनी इनाम सीखने, बी) भोले गंध वरीयताओं और सी) भोले स्वाद वरीयताओं के लिए प्राप्त की. Boxplots डेटा के रूप में प्रतिनिधित्व: औसत (बॉक्स के भीतर बोल्ड लाइन) बॉक्स, सभी डेटा बिंदुओं की 50% इंगित करता है जबकि ऊपरी और निचले गलमुच्छा अन्य 25% का प्रतिनिधित्व करता है. इसलिए outliers बिना न्यूनतम और अधिकतम मानों गलमुच्छा सीमाओं से संकेत कर रहे हैं. Outliers छोटे हलकों के रूप में चित्रित कर रहे हैं वे किसी भी बिंदु से अधिक 1.5 गुना 1 और 3 quartiles से अन्तःचतुर्थक श्रेणी के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. एकल डेटा बिंदुओं के सांख्यिकीय विश्लेषण Wilcoxon हस्ताक्षर किए रैंक परीक्षण के साथ किया जाता है, जबकि Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण दो डेटा समूहों की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. महत्व स्तर पी के लिए एनएस> 0.05 * <0.05 पी के लिए, ** पी के लिए <.01 या पी के लिए *** 0.001 <रूप में संकेत कर रहे हैं. एक प्रयोग का नमूना आकार: N = 15.

ए) में सीखने के प्रयोगों के लिए हमेशा पारस्परिक प्रयोगों के दो वरीयता सूचकांक (PREF) अंतिम प्रदर्शन सूचकांक (पीआई) की गणना करने के लिए लिया जाता है. प्रदर्शन सूचकांक (पीआई) तदनुसार बॉक्स भूखंडों के रूप में चित्रित कर रहे हैं.


चित्रा 4 GAL4 लाइनों जिनमें से प्रत्येक का लार्वा के मस्तिष्क के भीतर कोशिकाओं का एक विशिष्ट सेट लेबल का उदाहरण. हमेशा पूर्ण लार्वा मस्तिष्क के ललाट दृश्य के z-अनुमानों दिखाए जाते हैं. न्यूरॉन्स के विशिष्ट सेट पूरे लार्वा सीएनएस कि anti-FasII/anti-ChAT doublestaining (मैजंटा) द्वारा visualized है विरोधी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (हरा) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं.) NP225 दूसरा आदेश घ्राण न्यूरॉन्स के एक सेट, प्रक्षेपण बुलाया लेबल (तीर) न्यूरॉन्स और विकास वयस्क दृश्य प्रणाली (arrowhead) बी.) NP2426 1 घ्राण रिले स्टेशन पर घ्राण interneurons (तीर) का एक सेट के निशान, antennal पालि सी कहा जाता है.) GR66a विशेष रूप से स्वाद संवेदी न्यूरॉन्स कि एक सेट लेबल परिधीय स्वाद संवेदी अंगों से subeosophageal नाड़ीग्रन्थि परियोजना (तीर) डी) NP3128 न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के कई सेट लेबल. तीर antennal पालि की घ्राण interneurons arrowhead बी के समान निशान डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स का एक सेट है कि एक neuropil क्षेत्र पर परियोजना मशरूम शरीर बुलाया पर प्रकाश डाला गया ई.) H24 के निशान मशरूम शरीर Kenyon (तीर) कोशिकाओं, न्यूरॉन्स कि जहां दिखाया का एक सेट लार्वा घ्राण सीखने के लिए आवश्यक हो सकता है.) एफ NP7493 एक अपेक्षाकृत unspecific अभिव्यक्ति पैटर्न का एक उदाहरण है कि विकासशील न्यूरॉन्स (तीर) के कई सेट है कि आगे कायापलट दौरान अंतर मक्खी के मस्तिष्क फार्म भी शामिल है. स्केल सलाखों = 50 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 5
चित्रा 5 अवलोकन डी में साहचर्य सीखने का अध्ययन करने के सफल प्रयास सारांशrosophila लार्वा. घ्राण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्तेजनाओं प्रकाश एक वातानुकूलित या इनाम या सजा (असुविधाजनक प्रोत्साहन) के साथ जुड़े होने की प्रेरणा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. पुरस्कृत उत्तेजनाओं चीनी और नमक की कम मात्रा में शामिल हैं, को दंडित उत्तेजनाओं नमक की उच्च सांद्रता, कुनैन, बिजली के झटके, गर्मी, कंपन के माध्यम से यांत्रिक उत्तेजना (चर्चा) और 11,12,17-24 प्रकाश शामिल हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

यूएएस GAL4 / हमारी प्रयोगशाला में अक्सर इस्तेमाल किया constructs
संक्षिप्तीकरण प्रोटीन समारोह साहित्य
विज़ुअलाइज़ेशन
:: यूएएस mCD8 GFP हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन membराणे मार्कर ली एट अल, 1999
यूएएस-n SYB :: GFP हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन presynaptic मार्कर इतो एट अल., 1998
यूएएस Dscam17.1 :: GFP हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन postsynaptic मार्कर वैंग एट अल, 2004
:: यूएएस एनएलएस GFP हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेल शरीर मार्कर Robertson एट अल, 2003
Neuronal संकेत के साथ हस्तक्षेप
यूएएस छुपाया सिर पेचीदगी दोषपूर्ण apoptosis लाती झोउ एट अल, 1997
यूएएस - RPR लावक apoptosis लाती झोउ एट अल, 1997
यूएएस - शि टीएस नकारात्मक प्रमुख dynamin ब्लॉकों vesiclई रीसाइक्लिंग Kitamoto, 2001
यूएएस Kir.2.1 :: EGFP अंदर की ओर कश्मीर + चैनल सुधार कोई झिल्ली विध्रुवण Baines एट अल, 2001
यूएएस - TRPA1 कटियन चैनल तापमान निर्भर सक्रियण Rosenzweig एट अल, 2005
यूएएस - ChR2 Channelrhodopsin प्रकाश निर्भर सक्रियण SCHROLL एट अल, 2006.

तालिका 1 यूएएस effector अक्सर प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया constructs neuronal शरीर रचना कल्पना और synaptic प्रसारण 25-33 में हेरफेर.

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Discussion

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ड्रोसोफिला लार्वा में वर्णित सेटअप एक comparably प्राथमिक मस्तिष्क के भीतर साहचर्य घ्राण सीखने की जांच के लिए अनुमति देता है. दृष्टिकोण सरल, सस्ता, एक प्रयोगशाला में स्थापित करने के लिए आसान है और उच्च तकनीक 9 उपकरण की आवश्यकता नहीं है. हम प्रयोग, क्षुधावर्धक साहचर्य fructose 11 इनाम द्वारा प्रबलित सीखने का अध्ययन का एक संस्करण प्रस्तुत करते हैं. वर्णित सेटअप parametrical अध्ययन है कि व्यापक प्रशिक्षण परीक्षणों की संख्या में बदलाव, एकल परख बनाम जन परख, अवधारण समय, प्रयुक्त odors और गंध सांद्रता और 9,15,34,35 लिंग की जांच की एक श्रृंखला पर आधारित है. इस प्रकार, दर्शाया व्यवहार सेटअप ड्रोसोफिला में उच्च मस्तिष्क कार्यों के अध्ययन के लिए एक असाधारण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण में इस जानकारी को एकीकृत. अंत में, अपनी सरल सेटअप किसी भी घुलने के क़ाबिल पदार्थ के प्रभाव पुरस्कृत या दंडित करने को आसानी से इस परख के साथ परीक्षण किया जा सकता है पर आधारित है.

"ve_content> इसके अलावा, हाल ही में प्रतिमान के कई वेरिएंट प्रकाशित किए गए थे कि 23,36 लार्वा (Gerber एट अल (2004) में स्थापित किया गया था.) में साहचर्य दृश्य सीखने की जांच की अनुमति है, और बिजली के झटके, प्रकाश, गर्मी, कुनैन, या कंपन भी सफलतापूर्वक साहचर्य घ्राण 9,17,19-21,37-40 सीखने के लिए aversive reinforcers के रूप में लागू किया है. इस प्रकार, प्रयोगात्मक setups के एक व्यापक सेट ड्रोसोफिला लार्वा में सीखने और स्मृति के व्यवहार, neuronal और आणविक आधार का विश्लेषण करने के लिए मौजूद है ( चित्रा 5) 13,14,41,42 यहाँ, हम गंध fructose पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित परख और अपेक्षाकृत उच्च प्रदर्शन सूचकांक है कि प्राप्त किया जा सकता है की मजबूती की वजह से सीखने. aversive वेरिएंट की विशेष रूप से कुछ केवल छोटे व्यवहार करने के लिए नेतृत्व विधि के कुछ आवेदन जानवरों है कि लार्वा लंबी अवधि के लिए अध्ययन करना के विकास के मुद्दों के अलावा, हद तक परिवर्तन यह सीमाबल्कि असंभव स्मृति.

लार्वा मस्तिष्क अपनी संपूर्णता में 10,000 के बारे में केवल न्यूरॉन्स के होते हैं. इस प्रकार अपनी सरल रिश्तेदार संगठन (संख्या के मामले में) के कारण यह अच्छी तरह से आनुवंशिक हस्तक्षेप है, जो बारी में सीखने और स्मृति की आणविक और neuronal आधार पर उन्नत अध्ययन के लिए अनुमति देता है के लिए सुलभ है. विशेष रूप से GAL4/UAS प्रणालियों और अपने हाल के संशोधन न्यूरॉन्स की परिभाषित सेट के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं और spatio-अस्थायी तरीके 7,10 (4 चित्रा) में भी एकल कक्षों के लिए. इसके द्वारा effector लाइनों की एक व्यापक सेट न्यूरॉन्स की इन परिभाषित सेट (4 चित्रा) 25,43, या वैकल्पिक रूप से कल्पना करने के लिए अपने neuronal निर्गम (1 टेबल) में हेरफेर करने की संभावना प्रदान करता है. ज्यादातर अक्सर effector जीन लागू कर रहे हैं कि सेल autonomously कोशिका मृत्यु को उत्पन्न करने के लिए या से neuronal संचरण 29,30,33 को बाधित कर सकते हैं. अधिक हाल ही प्रौद्योगिकियों विकसित किए गए है कि अलप्रकाश या तापमान (1 टेबल) 31,32,44 द्वारा संचालित न्यूरॉन्स के एक नियंत्रित कृत्रिम सक्रियण के लिए कम है.

सारांश में, आनुवंशिक हस्तक्षेप और यहाँ वर्णित व्यवहार प्रयोगों के परिष्कृत तरीके के संयोजन ड्रोसोफिला लार्वा के प्राथमिक मस्तिष्क में सीखने और स्मृति के neuronal, आणविक और व्यवहार के आधार uncovering की अनुमति देते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम विशेष रूप से उनके प्रयोगात्मक सेटअप और पांडुलिपि पर टिप्पणी पर तकनीकी निर्देश के लिए Gerber प्रयोगशाला के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. हम भी मक्खी और जंगली प्रकार केंटन स्टॉक की देखभाल और रखरखाव के लिए Lyubov Pankevych धन्यवाद. यह काम DFG अनुदान TH1584/1-1, एसएनएफ 31003A_132812 अनुदान / 1 और Konstanz के विश्वविद्यालय के Zukunftskolleg (AST के लिए सभी) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fructose Sigma 47740 57-48-7
NaCl Fluka 71350 7647-14-5
Agarose Sigma A5093 9012-36-6
1-octanol Sigma 12012 111-87-5
Amylacetate Sigma 46022 628-63-7
Paraffin oil Sigma 18512 8012-95-1

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क्षुधावर्धक साहचर्य में घ्राण सीखने<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा
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Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).More

Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).

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