Summary
Drosophila larver er i stand til å knytte lukt stimuli med gustatory belønning. Her beskriver vi en enkel atferdsmessige paradigme som tillater analyse av appetitive assosiativ olfactory læring.
Abstract
I det følgende beskriver vi de metodiske detaljer om appetitive assosiativ olfactory læring i Drosophila larver. Oppsettet, i kombinasjon med genetisk forstyrrelse, gir et håndtak å analysere neuronal og molekylære grunnleggende av spesifikt assosiativ læring i en enkel larve hjerne.
Organismer kan bruke tidligere erfaringer til å justere dagens atferd. Slikt erverv av atferdsmessige potensial kan defineres som læring, og de fysiske grunnlaget for disse potensialene som minne spor 1-4. Nevrologer prøve å forstå hvordan disse prosessene er organisert i form av molekylære og neuronal endringer i hjernen ved hjelp av en rekke metoder i modellorganismer som spenner fra insekter til virveldyr 5,6. For slike bestrebelser er det nyttig å bruke modellen systemer som er enkle og eksperimentelt tilgjengelig. Drosophila larve har vist seg å tilfredsstille disse kravene basert påtilgjengeligheten av robuste atferdsmessige analyser, eksistensen av en rekke transgene teknikker og elementær organisering av nervesystemet som består av bare ca 10000 nevroner (riktignok med noen innrømmelser: kognitive begrensninger, få atferdsmessige alternativer og rikdom av erfaring tvilsom) 7-10 .
Drosophila larver kan danne assosiasjoner mellom lukt og appetitive gustatory forsterkning som sukker 11-14. I et standard assay, etablert i laboratoriet av B. Gerber, dyr får en to-lukt gjensidig opplæring: en første gruppe av larver er eksponert til en lukt En sammen med en gustatory reinforcer (sukker belønning) og er deretter utsatt for en lukt B uten forsterkning 9. Samtidig vil en annen gruppe av larver mottar resiprok trening mens opplever lukt A uten armering og deretter blir utsatt for lukt B med armering (sukker belønning). I det følgende begge gruppene er tested for deres preferanse mellom de to lukt. Relativt høyere innstillinger for belønnet lukt gjenspeiler assosiativ læring - presentert som en forestilling indeks (PI). Konklusjonen om assosiative natur ytelsen indeksen er overbevisende, fordi bortsett fra beredskap mellom lukt og tastants, andre parametere, slik som lukt og belønning eksponering, passering av tid og håndtering skiller seg ikke mellom de to gruppene 9.
Protocol
1. Forberedelse
- Drosophila villtype larver er hevet ved 25 ° C og 60% -80% fuktighet i en 14/10 lys / mørke syklus. For kontroll den eksakte alderen larvene alltid 20 hunner settes med 10 hanner inn en ampulle (6 cm høyde og 2,5 cm diameter) som omfatter ca 6 ml standard flue mat. Fluer er lov til å legge egg i 12 timer og overføres til et nytt hetteglass på den andre dagen. 5-6 dager etter egglegging larver nå fôring 3. instar stadium dersom hevet ved 25 ° C og kan nå brukes for de atferdsmessige eksperimentet. Imidlertid må man sørge for å bare ta larver som er fortsatt i mat og ikke larvene fra siden av ampullen. Disse larvene har allerede nådd "vandrende 3. stadium stadium" - kort tid før forpupping - og deres bruk kompliserer tolkningen av resultatene.
- Fremstilling av 2,5% agarose petriskåler (andre laboratorier bruker også agar-konsentrasjoner på 1% gjennom hele forsøket, hvorstadig lavere konsentrasjoner kan tillate mating 3. instar larver å grave i substrat): Oppløs 2,5 g agarose i 100 ml DDH 2 O. Varme opp løsningen i en mikrobølgeovn til det begynner å koke. Nøye agitere løsningen og sette den tilbake i mikrobølgeovnen til alle agarose er oppløst. Hell den varme agarose løsningen inn petriskåler slik at bunnen av petriskåler er helt dekket og agarosen løsningen danner en glatt overflate. La løsningen avkjøles til romtemperatur og lukke lokkene. Ikke umiddelbart lukke lokkene, fordi det ville tillate kondensasjon av vann på lokkene.
- Fremstilling av 2M fructose petriskåler: Oppløs 2,5 g agarose i 100 ml DDH 2 O (igjen, er bruk av 1% agar konsentrasjon mulig, men det kan tillate mating 3. instar larver å grave i substratet). Varme opp løsningen i en mikrobølgeovn til det begynner å koke. Nøye agitere løsningen og sette den tilbake i mikrobølge inntil alt agarose er oppløst. Tilsett forsiktig 35 g fruktose inn i den varme løsningen; langsomt røres til sukkeret er oppløst for å unngå koking retardasjon. Hell den varme fruktose-agarose løsning inn petriskåler slik at bunnen er helt dekket og fruktose-agarose-løsning danner en glatt overflate. La løsningen avkjøles til romtemperatur og lukke lokkene. Ikke umiddelbart lukke lokkene, fordi det ville tillate kondensasjon av vann på lokkene.
- Forberedelse av 1-oktanol (OCT) lukt beholdere: Fyll 10 pl ren oktober til en skreddersydde Teflon lukt container og lukke den med et lokk som har flere små hull for å muliggjøre fordampning av lukt. En detaljert beskrivelse av beholderne er gitt i Gerber og Stocker 2007. Bruk tre lukt beholdere for oktober Lukt beholdere tillater fordampning av de innsatte kjemikalier, men unngå at larvene kan direkte kontakt med dem. Således, de her beskrevne eksperimenter spesifiktta olfactory læring hos larver uten perturbing gustatory bivirkninger.
- Utarbeidelse av amylacetate (AM) lukt beholdere: Fortynn AM 01:50 i parafin olje. Fyll 10 pl av fortynning i en tilpasset gjort Teflon lukt container og lukke den med et lokk som har flere små hull for å muliggjøre fordampning av lukt. Bruk tre lukt beholdere for AM. Fortynningen er viktig av praktiske grunner, nemlig for å unngå en sterk preferanse for en lukt over den andre som kan maskere en lære-avhengige endringer i den relative preferanse mellom de to lukt. Lik attraksjon for både lukt kan trenge å bli bekreftet i laboratoriet før eksperimentet ved å påføre senere beskrevne test (2,5) med naive dyr. Verdiene her presentert er basert på flere publikasjoner av Gerber lab som nylig ble gjengitt av vår lab 9,15,16.
- Merkingen av petriskåler: Før de atferdsmessige eksperimenter alle petriskåler må kodes. Det betyr atfruktose inneholdende petriskåler skal merkes, for eksempel med en "X" eller en "A" og agarose kun petriskåler med en "Y" eller "B". Denne koden skal bli avslørt til eksperimentator bare etter at alle data er registrert. Ved å utføre eksperimenter "blind" det er derfor ikke mulig at forventningene til eksperimentator kan påvirke ytelsen til larvene. For å lette forståelsen for den brede lesere i følgende vil vi bare snakke om lukt som betingede stimuli (CS1 eller CS2) som enten belønnet når presentert på en fruktose petriskål (+) eller ikke-belønnet når de presenteres på en agarose bare petriskål (-).
2. Sukker Reward Opplæring og test
- Samle 30 fôring 3. instar larver fra en mat hetteglass. Overføre dem til en første petriskål som inneholder noen dråper vann og nøye flytte dem fremover og bakover med en pensel. Overføre dem til en andre petriskål som inneholder også noen dråper fra springen water for å kontrollere at ingen mat lim forblir på bodywall av larvene, ellers larver ville være i stand til å oppleve maten lukt under forsøket. Dette vil trolig skjule læringsprosessen og deres prestasjoner i testsituasjon.
- Trening: Å trene larver til førsteamanuensis lukt med en appetitive sukker cue følgende regime er brukt. Sett en OCT lukt container på venstre og høyre side av en "X" merket - og dermed, fruktose belønning inneholder (+) petriskål ("blind" eksperiment, for mer informasjon se 1.6). Plasser gruppen av 30 foring 3. instar larver på midten av petriskålen, lukke lokket og vent i 5 min mens dyrene utsettes for oktober Sørg for at larvene ikke er fanget inne i vanndråpen og kan overvinne overflatespenningen i det. Ved at larvene kan bevege seg fritt på petriskål og oppleve olfactory og / eller gustatory stimuli.
- Opplæring: Ta larvene fra petriskål med en fuktet pensel og overførem ned på et andre Petriskål som er merket med en "Y" - og dermed, agarose bare (-) inneholdende petriskål - og har en AM lukt beholder ligger på sin venstre og høyre side. Lukk lokket og vent i 5 min mens dyrene er utsatt for AM.
- Trening: Gjenta 2,2) og 2,3) to ganger, slik at alle 30 larver experience tre trening sykluser: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). I dette eksperimentet CS1 representerer oktober og CS2-koder for AM.
- Test: Plasser en AM og én oktober lukt container på motstående sider av en agarose bare petriskål. Overfør de trente dyrene til midten av testen petriskål. Lukk lokket og vent i 5 min. Senere telle antall larver på venstre side, den midtre og høyre siden av testen petriskål.
- Gjenta trinn 2.1) til 2,5) med en andre gruppe av 30 foring 3. instar larver men bytte eksperimentelle rollene AM og oktober slik at dyrene får følgende opplæring: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). I dette eksperimentet CS1 representerer oktober og CS2-koder for AM.
- Mulige ordninger for opplæring. Ovenfor har vi presentere en trening som finnes av tre treningsforsøk av enten oktober / (+) - AM / (-) eller i den gjensidige gruppen av også tre trening studier av AM / (+) - oktober / (-). Men for å unngå sekvens avhengige virkninger under trening er det viktig å variere rekkefølgen av stimuli i følgende repetisjoner av hele eksperimentet. Ved å variere CS1 eller CS2 orden og også belønningen presentasjon i den første eller andre presenteres plate, fire forskjellige sekvenser for opplæringen forsøkene er mulig:
| Første gruppe | CS1 / (+) - CS2 / (-) | Gjensidig gruppe | CS2 / (+) - CS1 / (-) |
| CS1 / (-) - CS2 / (+) | CS2 / (-) - CS1 / (+) | ||
| CS2 / (+) - CS2 / (-) | CS1 / (+) - CS2 / (-) | ||
| CS2 / (-) - CS1 / (+) | CS1 / (-) - CS2 / (+) |
Å hindre systematiske effekter av stimuli i det omkringliggende eksperimentelle miljøet, bør man utføre testen i den ene halvdelen av tilfellene slik at oktober er presentert på venstre og AM til høyre. I den andre halvdelen av tilfellene AM bør presenteres på venstre og oktober til høyre.
3. Tester for Task-relevante Sensory-motor fakulteter
Utformingen av de ovenfor beskrevne eksperimenter muliggjør analysere lukt-sukker læring i villtype feeding 3. instar larver på egen hånd. Imidlertid, i daglige lab life forskere vanligvis bruke to eller flere forskjellige eksperimentelle larvegrupper å sammenligne, hvis olfactory læring avhenger linjeticular genet, et bestemt sett av nevroner, en mutant lager, en spesiell mat diett, ulike stell forhold, giftige kjemikalier lagt under utvikling, etc. Derfor, i alle tilfeller når to eller flere eksperimentelle grupper av larver er testet må man gjøre en sett av obligatoriske kontroll eksperimenter for å teste, hvis de ulike gruppene av larver viser riktig sensorisk-motoriske acuities. Dette blir obligatorisk som potensielle fenotyper er ikke nødvendigvis på grunn av redusert eller opphevet evner å knytte lukt med sukker. Snarere kunne potensielle læring defekter være basert på mangler ved ethvert trinn i sensorisk-motorisk kretsene i behandlingen av lukt og / eller sukker. Eller med andre ord, hvis en mutant larve er ikke i stand til å oppfatte sukker, kan det ikke etablere en sukker minne. Men dette betyr ikke at de konkluderer med at larven ikke kan lære. I detalj følgende kontroll eksperimenter må gjøres for å teste for riktig OCT, AM og fruktose behandling av transgene larver.
1. Test for naive oktober preferanse
Samle 30 fôring 3. instar larver fra en mat hetteglass. Vask dem forsiktig i vann fra springen som beskrevet i 2.1. Sette en enkelt oktober lukt container på en side av en agarose Petriskål, legge larvene på midten av petriskålen, lukke lokket og vente på 5 min slik at larvene kan krype på petriskål og orientere mot oktober lukt kilde. Senere telle antall larver på venstre side, i midten, og på høyre side av testen petriskål.
2. Test for naive AM preferanse
Samle 30 fôring 3. instar larver fra en mat hetteglass. Vask dem forsiktig i vann fra springen som beskrevet i 2.1. Sette en enkelt AM lukt container på en side av en agarose Petriskål, legge larvene på midten av petriskålen, lukke lokket og vente på 5 min slik at larvene kan krype på petriskål og orientere mot AM lukt kilde. Senere telle antall larvae på venstre side, i midten, og på høyre side av testen petriskål.
3. Test for naive sukker preferanse
Samle 30 fôring 3. instar larver fra en mat hetteglass. Vask dem forsiktig i vann fra springen som beskrevet i 2.1. Forbered petriskåler som inneholder 2,5% agarose i en halv og en 2M fruktose-agarose blanding i den andre halvparten. Legg larvene på petriskålen, lukke lokket og vente på 5 min slik at larvene kan krype på petriskål og orientere mot fruktose inneholdende side. Senere telle antall larver på venstre side, i midten, og på høyre side av testen petriskål.
Fremstilling av halv-halv petriskåler: Forbered normale agarose plater som beskrevet ovenfor i avsnitt 1.2. Når agarose fylt petriskåler er avkjølt, må du kutte agarose langs den vertikale aksen med en skalpell. Fjern en halvparten av agarose fra petriskålen. Add en varm fruktose-agarose-løsning (for fremstilling se 1.3) til den tomme delen av petriskål. Være forsiktig at begge omganger kamp og ikke danner en definert kant - dette påvirker larve valg atferd og gjør en adferdsanalyse ganske vanskelig 4..
Humbug trening
Til tross for testing dersom transgene fôring 3. instar larver er i stand til å skille på en vill type nivå mellom oktober og luft (3.1), AM og luft (3.2) og sukker og ren agarose (3.3), et ekstra sett med test eksperimenter har nylig vært innført (for diskusjon se Gerber og Stocker, 2007). Begrunnelsen for disse eksperimentene er følgende. Under treningen larvene gjennomgår massiv håndtering og påfølgende lukt og sukker stimulering. Således er det vel mulig at den observerte læring fenotypen er misvisende (selv naiv lukt og sukker persepsjon tester er på et villtype nivå!). Faktisk er det mulig at de transgene dyr differ fra villtype larver med hensyn til stresstoleranse, motivasjon, tretthet, sensorisk tilpasning, kontekstuell læring, og endringer i metthetsfølelse. Dermed innførte Michels et al. (2005) kontroller som tester om et gitt mutant er i stand til å (1) oppdage AM versus en tom lukt beholder hvis du behandler larvene akkurat som under trening bortsett fra at du utelater belønning og bare utsettes for både lukt, (2) oppdage Okt Etter samme regimet, (3) oppdage AM versus en tom lukt container, hvis du behandler larvene i en trenings-aktig måte, bortsett fra at du utelater lukt og bare utsettes for belønning, og (4 ) oppdage Okt Etter samme regime. For en omfattende diskusjon og ytterligere detaljer om metodene se Michels et al (2005) og Gerber og Stocker (2007).
4. Data Analysis for Sugar Reward Learning
- Evaluering av data av sukkerdelen belønning læring protokollen beregne en oktober preferanse indeks (PREF oktober) for hver av de to gjensidig poputisk opplæring grupper:
For den første gruppen som mottok oktober / (+) - AM / (-) opplæring:
PREF oktober (OCT + / AM-) = (# av larver på okt side - # av larver på AM side) / # av alle larvene i venstre, høyre og midten soner
For den andre gruppen som fikk AM / (+) - oktober / (-) opplæring:
PREF AM (AM + / OCT-) = (# av larver på AM side - # av larver på okt side) / # av alle larvene i venstre, høyre og midten soner
- Beregn en forestilling indeks (PI) for de to PREF verdier fra 4.1). PI representerer assosiativ læring ved å slette ut perturbing effekter av lukt og straff eksponering, passering av tid og håndtering:
PI = (PREF oktober (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / OCT)) / 2
Dermed PI kan variere -1 til 1. Betydelig negative verdier representerer motvilje læring, mens betydelig positive verdier beskriver appetitive læring. En komplett eksperiment består vanligvis av 10 eller flere proteasehemmere. Data er visualisert som boksplottene including alle verdier av en gitt eksperimentell gruppe. 50% av de verdier som ligger innenfor boksen, median ytelsen indeksen er indisert som fet linje innenfor boksen plottet.
5. Data Analysis for Task-relevante Sensory-motor fakulteter
- Evaluering av data ved testing for riktig oktober lukt behandling beregne en OCT lukt preferanse indeksen som følger:
Lukt PREF oktober = (# av larver på okt side - # av larver på den andre siden) / # av alle larvene i venstre, høyre og midten soner - Evaluering av data ved testing for riktig AM lukt oppfatning beregne en AM lukt preferanse indeksen som følger:
Lukt PREF AM = (# av larver på AM side - # av larver på den andre siden) / # av alle larvene i venstre, høyre og midten soner - Evaluering av data ved testing for riktig fruktose oppfatning beregne en fruktose preferanse indeks som følger:
PREF fruktose = (# av larver på fruktose side - Ant. larver på den andre siden) / # Av alle larvene i venstre, høyre og midten soner - Detaljene for humbug trening er gitt i Michels et al. 2005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1a viser en oversikt over de eksperimentelle prosedyrer for larve olfactory assosiativ læring. Ved sammenkobling av en av to presentert lukt med en sukker belønning larver erverve atferden potensial å uttrykke en attraktiv respons mot belønnet lukt i forhold til unrewarded lukt. To grupper av larver er alltid trent av enten sammenkobling forsterkeren med lukt oktober eller AM. Ytelsen indeks (PI) måler assosiative funksjonen som forskjellen i preferanse mellom gjensidig trente gruppene.
I tilfelle assosiativ funksjon er analysert i transgen larver, er tester for grunnleggende sensoriske-motor evne som kreves. Dette gjøres ved å tilby dem valget mellom en fylt lukt container og luft eller mellom ren agarose og agarose pluss en sukker. (Sham trening er ikke vist her). Den endelige fordeling av larvene er notert i et bestemt datablad (figur 2) og visualized som et boksplott (figur 3). Positive resultater indikerer et attraktivt valg oppførsel for innstillingen indekser og appetitive læring i tilfelle av ytelse indeksene. Negative verdier indikerer en aversive valg oppførsel for de beregnede preferanser indekser og motvilje læring i tilfelle av ytelse indeksene.
Figur 1. Scheme av de atferdsmessige eksperimenter for å måle larve assosiative olfactory læring, naive olfactory preferanser og naive gustatory preferanser.
- 30 Drosophila fôring 3. instar larver er plassert i fem minutter på en agarose petriskål som inneholder en sukker belønning av 2M fruktose. Samtidig et første odor er tilgjengelig i Teflon containers (OCT). Dermed larver kan knytte en lukt stimulans med en positiv forsterker i første trening fase. Neste, larver overført til en andre agarose petriskål uten forsterker, men med den andre lukt (AM) for igjen 5 min. Treningen blir gjentatt tre ganger. Til slutt, i testsituasjon lukt preferanse av larvene er målt for belønnet lukt mot den ikke-belønnet lukt på en agarose petriskål. Dette tillater beregning av en første preferanse indeks (PREF). En andre gruppe av larver er trent på samme måte i en vekselvis måte. Her kan en andre preferanse indeks (PREF) bli beregnet. Endelig en Performance Index (PI) er beregnet ved å ta gjennomsnittet både preferanseaksjer indekser. For ytterligere informasjon om rekkefølgen på studiene se også 2.7.
- For å analysere den naive lukt preferanse, blir en enkelt lukt container fylt med enten oktober eller AM plassert på den ene siden av en ren agarose petriskål. 30 fôring 3. instar larver er placed i midten av petriskålen og etter 5 minutter ble fordelingen av larver på petriskålen telles. Fra de oppnådde data en olfactory preferanse indeks (PREF) blir deretter beregnet.
- For å analysere den naive gustatory preferanse 2M fruktose er fylt i en halvdel av en petriskål som inneholder ren agarose på den andre siden. 30 mating 3. instar larver plasseres i midten av petriskålen og etter 5 minutter ble fordelingen av larver på petriskålen telles. Fra de innhentet data en gustatory preferanse Index (PREF) beregnes deretter.
Figur 2. Eksempel på en rå datablad for registrering og behandling av data innhentet for A) sukker belønning læring, B) naivelukt preferanser og C) naive gustatory preferanser. For alle eksperimentene antall larver på venstre side, i midten, og på høyre side av de petriskåler noteres. Ut av denne informasjonen preferanseaksjer indekser (PREF) beregnes. Larve læring er avbildet som ytelse indekser (PI) som stammer fra computating de prefs av to gjensidig opplæring grupper. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Eksempel datavisualisering innhentet for A) sukker belønning læring, B) naive lukt preferanser og C) naive gustatory preferanser. Boksplott data som følger: median (fet linje innenfor boksen), den boksen indikerer 50% av alle datapunkter mens den øvre og nedre whisker representerer den andre 25% hver. Derfor uten utliggere minimums-og maksimumsverdi indikeres av whisker grenser. Utliggere er avbildet som små sirkler de er definert som helst mer enn 1,5 ganger interkvartile spenner fra 1. og 3. kvartil. Statistisk analyse av single datapunkter gjøres med Wilcoxon signert-rank test, mens Wilcoxon rang sum testen brukes for sammenligning av to datagrupper. Signifikansnivå er angitt som ns for p> 0,05, * for p <0,05, ** for p <0,01 eller *** for p <0,001. Antall på hvert eksperiment: N = 15.
For læring eksperimenter i A) alltid to preferanseaksjer indekser (PREF) av gjensidige eksperimenter er tatt for å beregne den endelige ytelsen indeksen (PI). Ytelse Indekser (PI) er avbildet som boksplottene tilsvarende.
Figur 4. Eksempler GAL4 linjer som hver etiketter et bestemt sett av celler i larvenes hjernen. Alltid fullt z-projeksjoner av frontpartiet utsikt over larve hjernen vises. Bestemte sett av nerveceller er merket med anti-grønn fluorescerende protein (grønn) i hele larve CNS som er visualisert ved anti-FasII/anti-ChAT doublestaining (magenta). A) NP225 etiketter et sett av andre ordens olfactory neurons, kalt projeksjon nevroner (pil) og utvikle voksen visuelle systemet (pilspiss). B) NP2426 merker et sett av olfactory interneurons (pil) på den første olfactory reléstasjon, kalt antennal lobe. C) GR66a merker utelukkende et sett av gustatory sensoriske nevroner som prosjektet fra perifere gustatory sanseorganer til subeosophageal ganglion (pil). D) NP3128 etiketter flere sett av ulike typer nerveceller. Pilen markerer olfactory interneurons av antennal lapp ligner B. pilspiss fremhever et sett av dopaminerge nevroner som prosjekt på en neuropil region kalt sopp kroppen. E) H24 merker et sett av sopp kroppen Kenyon celler (pil), nevroner som der vist å være nødvendig for larvenes olfactory læring. F) NP7493 er et eksempel på en relativt uspesifikk uttrykk mønster som omfatter flere sett av utviklingsland nevroner (piler) som ytterligere vil skille under metamorfose å danne hjernen av fluen. Skala barer = 50 mikrometer.
Figur 5. Oversikt som oppsummerer vellykkede forsøk på å studere assosiativ læring i Drosophila larver. Olfactory stimuli såvel som lette kan brukes som en betinget stimulans å være forbundet med enten belønning eller straff (ubetingede stimulus). Givende stimuli inkluderer sukker og lave konsentrasjoner av salt; straffe stimuli omfatter høye konsentrasjoner av salt, kinin, elektrisk støt, varme, mekanisk stimulering gjennom vibrasjon (buzz) og 11,12,17-24 lys. Klikk her for å se større figur .
| GAL4 / UAS konstruerer ofte brukt i vårt laboratorium | |||
| Forkortelse | Protein | Funksjon | Litteratur |
| Visualisering | |||
| UAS-mCD8 :: GFP | grønt fluorescerende protein | medl.rane markør | Lee et al., 1999 |
| UAS-n-syb :: GFP | grønt fluorescerende protein | presynaptisk markør | Ito et al., 1998 |
| UAS-Dscam17.1 :: GFP | grønt fluorescerende protein | postsynaptic markør | Wang et al., 2004 |
| UAS-NLS :: GFP | grønt fluorescerende protein | cellen kroppen markør | Robertson et al. 2003 |
| Interferens med nevrale signaler | |||
| UAS-hid | head involusjon defekt | induserer apoptose | Zhou et al., 1997 |
| UAS-RPR | reaper | induserer apoptose | Zhou et al., 1997 |
| UAS-shi ts | dominerende negative dynamin | blokker vesicle resirkulering | Kitamoto, 2001 |
| UAS-Kir.2.1 :: EGFP | innvendig rette K + kanalen | ingen membran depolarisering | Baines et al., 2001 |
| UAS-TRPA1 | kation kanal | temperaturavhengig aktivering | Rosenzweig et al., 2005 |
| UAS-ChR2 | Channelrhodopsin | lys avhengig aktivering | Schroll et al., 2006 |
Tabell 1. UAS effektor konstruksjoner ofte brukes i laboratoriet for å visualisere neuronal anatomi og manipulere synaptisk overføring 25-33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne oppsettet i Drosophila larver tillater undersøkelse av assosiative olfactory læring innenfor et relativt elementær hjerne. Tilnærmingen er enkel, billig, lett å etablere i et laboratorium og krever ikke high-tech utstyr 9. Vi presenterer en versjon av forsøket, for å studere appetitive assosiativ læring forsterket av fruktose belønning 11. Den beskrevne oppsettet er basert på en serie av parametrical studier som omfattende undersøkt variasjoner i antall treningsforsøk, enkelt analysen versus masse analysen, retensjonstid, brukte lukt og lukt konsentrasjoner og 9,15,34,35 kjønn. Dermed integrerer avbildet atferdsmessige oppsettet denne informasjonen i en usedvanlig reproduserbar måte å studere høyere hjernefunksjoner i Drosophila. Til syvende og sist, basert på enkle oppsettet belønne eller straffe effekten av eventuelle dissoluble stoff kan lett testes med denne analysen.
ve_content "> I tillegg ble flere varianter av paradigmet nylig publisert som tillater gransking av assosiative visuell læring i larvene 23,36 (etablert i Gerber et al (2004).) og elektrisk sjokk, lys, varme, kinin eller vibrasjoner ble også implementert som aversive forsterkere for assosiativ olfactory læring 9,17,19-21,37-40. Dermed finnes et omfattende sett av eksperimentelle oppsett for å analysere de atferdsmessige, neuronal og molekylære grunnlaget for læring og hukommelse i Drosophila larver ( figur 5) 13,14,41,42. Her fokuserte vi utelukkende på lukt-fruktose læring grunnet robustheten analysen og de relativt høye ytelse indekser som kan oppnås. spesielt noen av aversive variantene fører til bare små atferdsmessige endringer. Dette begrenser til en viss grad ved anvendelse av metoden, foruten utviklingsspørsmål av dyrene som gjør studier på larvenes langsiktigminne ganske umulig.Larve hjernen består av bare ca 10.000 nevroner i sin helhet. Således på grunn av dets relative enkle (i form av tall) organisasjon er det vel tilgjengelig for genetisk forstyrrelse, som igjen gir mulighet for videre studier på molekylært og neuronal grunnlaget for læring og hukommelse. Spesielt GAL4/UAS systemer og dets nylige modifikasjoner tillate for genetisk manipulasjon av definerte sett med nevroner og opp til selv enkeltceller i et spatio-temporal måte (Figur 4) 7,10. Herved et omfattende sett av effektor linjer tilbyr muligheten til å visualisere disse definerte sett av nevroner (figur 4) 25,43 eller alternativt å manipulere sine neuronal utgang (tabell 1). Oftest effektor gener brukes som kan celle-autonomously indusere celledød eller hemme neuronal overføring 29,30,33. Mer nylig teknologier ble utviklet som allav for en kontrollert kunstig aktivering av neuroner drevet av lys eller temperatur (tabell 1) 31,32,44.
I sammendraget, tillater en kombinasjon av avanserte måter genetisk innblanding og her er beskrevet atferdsmessige eksperimenter avdekke nevrale, molekylære og atferdsmessige grunnlaget for læring og hukommelse i elementær hjernen Drosophila larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker spesielt å takke medlemmene av Gerber lab for tekniske instruksjoner om sin eksperimentelle oppsett og kommentarer til manuskriptet. Vi vil også takke Lyubov Pankevych for fly omsorg og vedlikehold av villtype kantoner lager. Dette arbeidet støttes av DFG tilskuddet TH1584/1-1, SNF stipend 31003A_132812 / 1 og Zukunftskolleg ved University of Konstanz (alle til AST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fructose | Sigma | 47740 | 57-48-7 |
| NaCl | Fluka | 71350 | 7647-14-5 |
| Agarose | Sigma | A5093 | 9012-36-6 |
| 1-octanol | Sigma | 12012 | 111-87-5 |
| Amylacetate | Sigma | 46022 | 628-63-7 |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | 8012-95-1 |
References
- Pawlow, I. P. New Researches on Conditioned Reflexes. Science. 58, 359-361 (1923).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat. Rev. Neurosci. 4, 266-275 (2003).
- Kandel, E. R. Cellular insights into behavior and learning. Harvey Lect. 73, 19-92 (1979).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 737-744 (2004).
- Milner, B., Squire, L. R., Kandel, E. R. Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron. 20, 445-468 (1998).
- Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 8, (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Gerber, B., Stocker, R. F., Tanimura, T., Thum, A. S. Smelling, tasting, learning: Drosophila as a study case. Results Probl. Cell. Differ. 47, 139-185 (2009).
- Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem. Senses. 32, 65-89 (2007).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gerber, B., Hendel, T. Outcome expectations drive learned behaviour in larval Drosophila. Proc. Biol. Sci. 273, 2965-2968 (2006).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Pauls, D., Selcho, M., Gendre, N., Stocker, R. F., Thum, A. S. Drosophila larvae establish appetitive olfactory memories via mushroom body neurons of embryonic origin. J. Neurosci. 30, 10655-10666 (2010).
- Selcho, M., Pauls, D., Han, K. A., Stocker, R. F., Thum, A. S. The role of dopamine in Drosophila larval classical olfactory conditioning. PLoS One. 4, e5897 (2009).
- Neuser, K., Husse, J., Stock, P., Gerber, B. Appetitive olfactory learning in Drosophila larvae:effects of repetition, reward strength, age, gender, assay type and memory span. Animal Behaviour. 69, 891-898 (2005).
- Scherer, S., Stocker, R. F., Gerber, B. Olfactory learning in individually assayed Drosophila larvae. Learn Mem. 10, 217-225 (2003).
- Aceves-Pina, E. O., Quinn, W. G. Learning in normal and mutant Drosophila larvae. Science. 206, 93-96 (1979).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. J. Neurogenet. 2, 1-30 (1985).
- Khurana, S., Abu Baker, M. B., Siddiqi, O. Odour avoidance learning in the larva of Drosophila melanogaster. J. Biosci. 34, 621-631 (2009).
- Pauls, D., et al. Electric shock-induced associative olfactory learning in Drosophila larvae. Chem. Senses. 35, 335-346 (2010).
- Eschbach, C., et al. Associative learning between odorants and mechanosensory punishment in larval Drosophila. J. Exp. Biol. 214, 3897-3905 (2011).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
- Gerber, B., et al. Visual learning in individually assayed Drosophila larvae. J. Exp. Biol. 207, 179-188 (2004).
- Rohwedder, A., et al. Nutritional Value-Dependent and Nutritional Value-Independent Effects on Drosophila melanogaster Larval Behavior. Chem. Senses. , (2012).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Ito, K., et al. The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen. Learn Mem. 5, 52-77 (1998).
- Wang, J., et al. Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis. Neuron. 43, 663-672 (2004).
- Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression. Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).
- Zhou, L., et al. Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
- Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).
- Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. , (2011).
- Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae. J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).
- Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae. J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).
- Khurana, S., et al. Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement. Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).
- Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. Memory through metamorphosis in normal and mutant. 14, 68-74 (1994).
- Michels, B., et al. Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning. Learn Mem. 18, 332-344 (2011).
- Saumweber, T., et al. Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47. J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186, 735-755 (2010).
- Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).
