Summary
Larvas de Drosophila são capazes de associar estímulos odor com recompensa gustativa. Aqui nós descrevemos um paradigma comportamental simples que permite a análise da aprendizagem associativa apetitiva olfativo.
Abstract
A seguir, descrevemos os detalhes metodológicos da aprendizagem associativa apetitiva olfativo em larvas Drosophila. A configuração, em combinação com interferência genética, fornece um identificador para analisar as bases neuronais e moleculares da aprendizagem associativa especificamente no cérebro de um simples larval.
Organismos podem utilizar a experiência passada para ajustar o comportamento presente. Essa aquisição do potencial comportamental pode ser definida como a aprendizagem, e as bases físicas destes potenciais como traços de memória 1-4. Neurocientistas tentar entender como esses processos são organizados em termos de alterações moleculares e neuronal no cérebro, usando uma variedade de métodos em organismos modelo, desde insetos aos vertebrados 5,6. Para tais esforços é útil usar sistemas modelo que são simples e acessíveis experimentalmente. A larva Drosophila acabou por satisfazer essas demandas com base naa disponibilidade de ensaios comportamentais robustos, a existência de uma variedade de técnicas transgênicas ea organização fundamental do sistema nervoso que compreende apenas cerca de 10 mil neurônios (embora com algumas concessões: limitações cognitivas, comportamentais, poucas opções e riqueza de experiência questionável) 7-10 .
Larvas de Drosophila podem formar associações entre odores e reforço gustativa apetitivo como o açúcar 11-14. Num ensaio padrão, criada no laboratório de B. Gerber, os animais recebem um dois-odor formação recíproca: Um primeiro grupo de larvas é exposto a um odor que A juntamente com um reforçador gustativas (recompensa açúcar) e é subsequentemente exposto a um odor B sem reforço 9. Enquanto isso, um segundo grupo de larvas recebe formação recíproca ao experimentar odor Um sem reforço e subsequentemente serem expostos a B odor com reforço (recompensa açúcar). A seguir ambos os grupos são tested por sua preferência entre os dois odores. Preferências relativamente mais elevadas para o odor recompensado reflectir a aprendizagem associativa - apresenta-se como um índice de desempenho (PI). A conclusão sobre a natureza associativa do índice de desempenho é atraente, porque além de a contingência entre os odores e tastants, outros parâmetros, tais como odor e exposição recompensa, passagem do tempo e manuseio não diferem entre os dois grupos 9.
Protocol
1. Preparação
- Drosophila larvas tipo selvagem são criados a 25 ° C e 60% a 80% de humidade num ciclo de 14/10 de luz / escuridão. Para controlar a idade exata das larvas sempre 20 fêmeas são colocados com 10 homens em um frasco (6 cm de altura e 2,5 cm de diâmetro), que inclui cerca de 6 ml de alimento mosca padrão. As moscas são permitidos para pôr ovos durante 12 horas e são transferidas para um novo frasco no segundo dia. 5-6 dias após a postura de ovos larvas atingir a alimentação 3 ª etapa instar se levantado a 25 ° C e pode agora ser usado para a experiência de comportamento. No entanto, tem de se assegurar que apenas tomar as larvas que estão ainda no alimento e as larvas não a partir do lado do frasco. Essas larvas já alcançaram "vagando 3 º instar palco" - pouco antes pupação - e seu uso dificulta a interpretação dos resultados.
- Preparação de 2,5% de agarose pratos de Petri (outros laboratórios também usar concentrações de ágar de 1% durante todo o experimento, comoconcentrações cada vez menores podem permitir que a alimentação de larvas de 3 º a escavar o substrato): Dissolver 2,5 g de agarose em 100 ml DDH 2 O. Aquece-se a solução num forno de microondas até que comece a ferver. Cuidadosamente agite a solução e colocá-lo de volta no microondas até que todos agarose é dissolvido. Verter a solução de agarose quente em placas de Petri de tal forma que o fundo das placas de Petri é completamente coberto e a solução de agarose forma uma superfície lisa. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e coloque a tampa. Não feche imediatamente as tampas, porque permitiria a condensação de água nas tampas.
- Preparação de 2M pratos de Petri de frutose: Dissolver 2,5 g de agarose em 100 ml DDH 2 O (de novo, o uso da concentração de ágar a 1%, é possível, no entanto, pode permitir a alimentação 3 de larvas para escavar o substrato). Aquece-se a solução num forno de microondas até que comece a ferver. Cuidadosamente agite a solução e colocá-lo de volta para o microonda até que toda a agarose é dissolvido. Adiciona-se cuidadosamente 35 g de frutose dentro da solução quente, lentamente, agitar a mistura até o açúcar se dissolver, para evitar o retardo de ebulição. Verter a solução de frutose-agarose quente em placas de Petri de tal forma que a parte inferior é completamente coberto e a solução de frutose-agarose forma uma superfície lisa. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e coloque a tampa. Não feche imediatamente as tampas, porque permitiria a condensação de água nas tampas.
- Preparação de 1-octanol recipientes (OCT) odor: Encher 10 ul de outubro pura num recipiente de teflon feitos odor e fechar com uma tampa que tem vários furos pequenos para permitir a evaporação do odor. Uma descrição detalhada dos recipientes é dada na Gerber e Stocker 2007. Prepare três recipientes de odor para outubro Recipientes de odores para permitir a evaporação de substâncias químicas inseridas, mas evitam que as larvas podem contactar directamente com eles. Assim, as experiências aqui descritas especificamenteabordar a aprendizagem olfativa em larvas sem perturbar efeitos colaterais gustativas.
- Preparação de recipientes amylacetate (AM) odor: Diluir AM 1:50 em óleo de parafina. Encher 10 ul da diluição num recipiente personalizado odor made Teflon e fechar com uma tampa que tem vários furos pequenos para permitir a evaporação do odor. Prepare três recipientes de odor para AM. A diluição é importante por razões de ordem prática, isto é, para evitar uma forte preferência para um odor em relação ao outro que podem mascarar uma mudança aprendizagem dependente de preferência na relação entre os dois odores. A atracção igual para ambos os odores podem ter de ser confirmadas no laboratório antes da experiência feita com o teste descrito mais tarde (2.5), com os animais naive. Os valores aqui apresentados são baseados em várias publicações do laboratório Gerber, que foram recentemente reproduzidas por nosso laboratório 9,15,16.
- Etiquetagem dos pratos de Petri: Antes das experiências de comportamento de todos os pratos de Petri tem de ser codificado. Isso significa que,frutose contendo placas de Petri tem que ser marcado, por exemplo, com um "X" ou um "A" e os pratos de Petri de agarose apenas com um "Y" ou "B". Este código deve ser revelada ao pesquisador somente depois que todos os dados foram gravados. Ao realizar as experiências "cegas", não é possível, portanto, que as expectativas do experimentador podem afectar o desempenho das larvas. Para facilitar a compreensão para o público grande no seguinte só vamos falar sobre os odores como estímulos condicionados (CS1 ou CS2) que, ou são recompensados quando apresentado em um prato de Petri frutose (+) ou não-recompensado quando apresentado de agarose só Petri (-).
2. Formação açúcar Recompensa e Teste
- 30 Recolha de alimentação 3 de larvas a partir de um frasco de alimentos. Transferi-los para uma placa de Petri primeiro que contém algumas gotas de água da torneira e cuidadosamente movê-los para a frente e para trás, com um pincel. Transferi-los para uma segunda placa de Petri que contém também algumas gotas de tap water de verificar que nenhuma pasta de alimentos permanece no bodywall das larvas, caso contrário larvas seria capaz de experimentar o odor de alimentos durante o experimento. Isso provavelmente obscurecer o processo de aprendizagem e seu desempenho na situação teste.
- Formação: Para treinar larvas aos odores associados com um taco de açúcar apetitivo o seguinte regime é aplicado. Coloque um recipiente odor outubro no lado esquerdo e direito de um "X" marcado - assim, a recompensa de frutose contendo (+) placa de Petri (experimento "cego", para mais detalhes veja 1.6). Coloque o grupo de alimentação 30 3 o ínstar foram para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e espere por 5 min, enquanto que os animais são expostos a outubro Certifique-se de que as larvas não está preso dentro da gota de água e pode vencer a tensão superficial do mesmo. Por que as larvas podem se mover livremente sobre a placa de Petri e experimentar estímulos olfativos e / ou gustativa.
- Formação: Remover as larvas da placa de Petri com um pincel humedecido e transferir om sobre uma placa de Petri segundo que é marcado com um "Y" - assim, agarose apenas (-) contendo prato Petri - e tem um odor AM recipiente localizado no seu lado esquerdo e direito. Fechar a tampa e espere por 5 min, enquanto que os animais são expostos a AM.
- Formação: Repetir a 2,2) e 2,3), duas vezes, de modo que todos os 30 larvas de experiência de três ciclos de formação: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). Neste experimento CS1 representa outubro e códigos CS2 para AM.
- Teste: Coloque um PM e um recipiente odor outubro nos sites opostos de uma placa de Petri de agarose-somente. Transfira os animais treinados para o meio do teste do prato de Petri. Fechar a tampa e espere por 5 min. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, o lado direito do meio e do prato de Petri de teste.
- Repita os passos 2.1) a 2.5), com um segundo grupo de alimentação 30 3 rd larvas mas inverter os papéis experimentais de AM e outubro de tal forma que os animais recebem a formação seguinte: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). Neste experimento CS1 representa outubro e códigos CS2 para AM.
- Arranjos possíveis para a formação. Acima apresenta-se uma formação que existe em três ensaios de formação de um ou outro OCT / (+) - AM / (-) ou no grupo recíproca também de três ensaios de formação de AM / (+) - OCT / (-). No entanto, para evitar os efeitos dependentes da sequência durante a formação, é importante variar a sequência dos estímulos em repetições seguintes da experiência completa. Através da variação da ordem CS1 ou CS2 e também a apresentação de recompensa no primeiro ou no segundo prato apresentado, quatro sequências diferentes para os ensaios de formação são possíveis:
| Primeiro grupo | CS1 / (+) - CS2 / (-) | Recíproco grupo | CS2 / (+) - CS1 / (-) |
| CS1 / (-) - CS2 / (+) | CS2 / (-) - CS1 / (+) | ||
| CS2 / (+) - CS2 / (-) | CS1 / (+) - CS2 / (-) | ||
| CS2 / (-) - CS1 / (+) | CS1 / (-) - CS2 / (+) |
Para evitar efeitos sistemáticos de estímulos do meio ambiente circundante experimental, deve-se realizar o teste em metade dos casos, que o OCT é apresentado do lado esquerdo e de AM para a direita. Na outra metade dos casos AM devem ser apresentados no lado esquerdo e no lado direito outubro.
3. Os testes para a tarefa relevantes sensório-motor Faculdades
O desenho das experiências acima descritas permite a análise de odor-de-açúcar de aprendizagem no tipo selvagem de alimentação 3 de larvas por si só. No entanto, os investigadores no laboratório da vida diária geralmente usam dois ou mais diferentes grupos experimentais de larvas para comparar, se a aprendizagem olfactiva depende de um pargene cular, um conjunto específico de neurónios, um estoque mutante, uma dieta de alimentos especiais, diferentes condições de criação, produtos químicos tóxicos adicionados durante o desenvolvimento, etc Assim, em todos os casos em que dois ou mais grupos experimentais de larvas são testados deve-se fazer uma conjunto de experiências de controlo obrigatórias para testar, se os diferentes grupos de larvas mostram adequadas sensório-motor acuidade. Isto torna-se obrigatória a partir fenótipos potenciais não são, necessariamente, devido às habilidades reduzidas ou abolidas aos odores associados com açúcar. Em vez disso, o potencial de defeitos de aprendizagem pode ser baseada em defeitos em qualquer etapa do circuito sensório-motora no tratamento de odores e / ou açúcar. Ou por outras palavras, se uma larva mutante não é capaz de açúcar sentido, não é possível estabelecer uma memória de açúcar. Mas isso não permite concluir que a larva não consegue aprender. Em detalhe as experiências de controle a seguir tem que ser feito para testar a adequada outubro, AM e processamento de frutose de larvas transgênico.
1. Teste para ingênuo outubro prefecia
30 Recolha de alimentação 3 de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Coloque um recipiente único odor outubro de um lado de uma placa de Petri de agarose, adicionar as larvas para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e esperar por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar para a OCT fonte de odor. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste.
2. Teste de preferência AM ingênuo
30 Recolha de alimentação 3 de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Coloque um recipiente único odor AM de um lado de uma placa de Petri de agarose, adicionar as larvas para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e espere por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar para o AM fonte de odor. Subsequentemente contar o número de larvae no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste.
3. Teste de preferência açúcar ingênuo
30 Recolha de alimentação 3 de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Preparar placas de Petri que contêm 2,5% de agarose, de metade e de uma mistura de frutose-agarose 2M na outra metade. Adicionar as larvas para a placa de Petri, fechar a tampa e esperar por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar em direcção ao lado de frutose, contendo. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste.
Preparação de pratos de Petri de meia meia: Preparar placas normais de agarose como descrito acima na secção 1.2. Quando a agarose pratos de Petri são cheias arrefecido, corte cuidadosamente o agarose ao longo do eixo vertical, com um bisturi. Remova um meio de agarose a partir de uma placa de Petri. Add uma solução de frutose-agarose quente (para a preparação ver 1.3), com a meia vazia da placa de Petri. Tenha cuidado para que as duas metades corresponder e não formar uma borda definida - isso afeta o comportamento de escolha larval e torna uma análise comportamental bastante difícil 4..
Sham treinamento
Apesar dos testes se a alimentação transgênica 3 ª larvas são capazes de distinguir em um nível tipo selvagem entre outubro e ar (3,1), AM e ar (3,2) e açúcar e agarose pura (3,3), um conjunto adicional de experimentos de teste foi recentemente introduzido (para discussão ver Gerber e Stocker, 2007). O racional para estas experiências é o seguinte. Durante a formação das larvas passam por tratamento sucessivo em massa e odor e açúcar estimulação. Assim, é bem possível que o fenótipo observado aprendizagem é enganador (embora naïve odor e testes de percepção de açúcar estão num nível de tipo selvagem!). De facto, é possível que os animais transgénicos differ de larvas do tipo selvagem em relação à resistência ao estresse, motivação, adaptação, fadiga sensorial, a aprendizagem contextual, e as mudanças na saciedade. Assim, Michels et al. (2005) introduziu controles que testam se um mutante dado é capaz de (1) detectar AM versus um recipiente vazio odor se você tratar as larvas exatamente como durante o treinamento, exceto que você omitir a recompensa e apenas expor a tanto odores; (2) detectar outubro, após o mesmo regime, (3) detectar AM versus um recipiente vazio odor, se você tratar as larvas de uma forma de treinamento de como não ser que você omitir os odores e apenas expor a recompensa, e (4 ) detectar PTU após o mesmo regime. Para uma discussão abrangente e mais detalhes sobre os métodos consulte Michels et al (2005) e Gerber e Stocker (2007).
4. Análise de Dados para a Aprendizagem Recompensa Açúcar
- Para avaliar os dados do protocolo de aprendizagem açúcar recompensa calcular um índice de preferência OCT (PREF OCT) para cada um dos dois reciprocidadecamente grupos formados:
Para o primeiro grupo que recebeu outubro / (+) - AM / (-) formação:
PREF outubro (outubro + /-AM) = (n º de larvas do lado de outubro - # de larvas do lado AM) / n º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio
Para o segundo grupo que recebeu AM / (+) - OCT / (-) formação:
PREF AM (+ / outubro) = (n º de larvas em AM lado - N º de larvas do lado de outubro) / n º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio
- Calcular um índice de desempenho (PI) para os dois valores PREF de 4,1). O PI representa aprendizagem associativa por anulando efeitos perturbadores de odor e exposição punição, passagem do tempo e manipulação:
PI = (PREF outubro (outubro + / AM) + PREF AM (+ / outubro)) / 2
Assim PIs pode variar de -1 a 1. Valores significativamente negativos representam aversivo de aprendizagem, enquanto que valores significativamente positivos descrever aprendizagem apetitiva. Um experimento completo geralmente é composto por 10 ou mais IPs. Os dados são visualizados como includin parcelas caixag todos os valores de um dado grupo experimental. 50% dos valores de estar localizado no interior da caixa, o índice de desempenho mediano é indicado como uma linha a negrito no interior da caixa de bigodes.
5. Análise de Dados para a Tarefa relevantes sensório-motor Faculdades
- Para avaliar os dados ao testar para o processamento adequado odor outubro calcular um índice de preferência outubro odor da seguinte forma:
Odor PREF outubro = (# de larvas no lado OCT - # de larvas no outro lado) / n º de todas as larvas no interior das zonas esquerda, direita e metade - Para avaliar os dados quando o teste de percepção de odor adequada AM AM calcular um índice de preferência odor da seguinte forma:
Odor PREF AM = (# de larvas no lado AM - # de larvas no outro lado) / n º de todas as larvas no interior das zonas esquerda, direita e metade - Para avaliar os dados ao testar para a percepção adequada frutose calcular um índice de preferência de frutose como segue:
PREF frutose = (# de larvas no lado frutose - # de larvas no outro lado) / N º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio - Detalhes para a formação farsa são dadas em Michels et al. 2005.
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Representative Results
Figura 1A mostra uma visão geral dos procedimentos experimentais para a aprendizagem olfativa larval associativo. Por emparelhamento de um dos dois odores apresentados com uma recompensa larvas açúcar adquirir o comportamento potencial para expressar uma resposta atraente para o odor recompensado em comparação com o odor recompensa. Dois grupos de larvas são sempre treinados por qualquer emparelhar o reforço com o odor outubro ou AM. O índice de desempenho (PI) mede a função associativo como a diferença na preferência entre os grupos mutuamente treinados.
No caso de função associativa é analisado em larvas de transgênicos, testes de habilidade sensorial-motor básico são obrigatórios. Isto é feito dando-lhes a escolha entre um recipiente cheio e odor do ar puro ou entre agarose e agarose, mais um açúcar. (Formação Sham não é mostrado aqui). A distribuição final das larvas é anotado em uma ficha específica (Figura 2) e visualized como um gráfico de caixa (Figura 3). Os resultados positivos indicam um comportamento de escolha atraente para os índices de preferência e de aprendizagem apetitiva no caso dos índices de desempenho. Valores negativos indicam um comportamento aversivo escolha para os índices de preferência calculados e aversivo aprendizagem, no caso dos indicadores de desempenho.
Figura 1. Esquema dos experimentos comportamentais para medir a aprendizagem associativa larval olfativo, ingênuos preferências olfativas e gustativas ingênuos preferências.
- 30 Drosophila alimentação 3 de larvas instar são colocados, durante cinco minutos, em uma placa de Petri de agarose que contém um açúcar de frutose recompensa 2M. Ao mesmo tempo, um odor é fornecido em primeiro recipiente de Teflons (outubro). Assim larvas pode associar um estímulo odor com um reforço positivo na primeira fase de treinamento. Larvas, em seguida são transferidos para um segundo disco de Petri de agarose sem reforço, mas com o odor segundo (AM) para de novo 5 min. O treinamento é repetido três vezes. Finalmente, na situação de teste a preferência odor das larvas é medido para o odor recompensado contra o odor não-recompensado com uma placa de Petri de agarose. Isto permite o cálculo de um índice de preferência em primeiro lugar (PREF). Um segundo grupo de larvas é formado de forma semelhante de uma maneira mutuamente. Aqui, um índice de preferência segundo (PREF) pode ser calculada. Finalmente um índice de desempenho (PI) é calculado pela média de índices de ambas as preferências. Para mais informações sobre a seqüência dos ensaios ver também 2.7.
- Para a análise da preferência odor naïve, um recipiente cheio com odor único ou OCT ou AM é colocada sobre um lado de uma placa de Petri puro agarose. 30 de alimentação 3 ª larvas são placed, no meio da placa de Petri e depois de 5 min a distribuição das larvas no prato de Petri é contado. A partir dos dados obtidos de um índice de preferência olfactiva (PREF) é então calculada.
- Para a análise da fructose naïve 2M gustativa preferência é preenchido em metade de uma placa de Petri que contém agarose puro no seu outro lado. 30 de alimentação 3 de larvas instar são colocados no meio da placa de Petri e depois de 5 min a distribuição das larvas no prato de Petri é contado. A partir dos dados obtidos de um Índice de Preferência gustativa (PREF) é então calculada.
Figura 2. Exemplo de uma folha de dados brutos para o registro e processamento de dados obtidos para A aprendizagem recompensa), açúcar B) ingênuopreferências de odor e C) ingênuos preferências gustativas. Para todas as experiências o número de larvas no lado esquerdo, no meio e no lado direito das placas de Petri são anotados. Fora deste índices de preferência de informação (PREF) são calculados. Aprendizagem larval é retratado como índices de desempenho (PI) decorrentes computating as preferências de dois grupos formados reciprocamente. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Exemplo de visualização de dados obtidos para a aprendizagem de recompensa), açúcar B) preferências odor ingênuos e C) ingênuos preferências gustativas. Boxplots representam os dados da seguinte forma: mediana (linha em negrito dentro de uma caixa), a caixa indica 50% de todos os pontos de dados ao passo que a parte superior e inferior whisker representa os restantes 25% cada. Portanto, sem discrepantes os valores mínimo e máximo são indicados pelas fronteiras suíças. Outliers são descritos como pequenos círculos que são definidos como qualquer ponto mais do que 1,5 vezes o intervalo interquartil do 1 º e 3 º quartis. A análise estatística de pontos únicos de dados é feito o teste de Wilcoxon Signed Rank, enquanto que teste de Wilcoxon é usado para comparação de dois grupos de dados. Níveis de significância são indicados como ns para p> 0,05, * para p <0,05, ** para p <0,01 ou *** para p <0,001. O tamanho da amostra de cada experimento: N = 15.
Para as experiências de aprendizagem em A) sempre dois índices de preferência (PREF) dos experimentos recíprocos são levados para o cálculo do índice de desempenho final (PI). Índices de Desempenho (PI) são retratados como diagramas de caixa de acordo.
Figura 4. Exemplos de GAL4 linhas cada uma das quais rotula um conjunto específico de células no cérebro larval. Sempre cheio z projeções de vistas frontais do cérebro larval são mostrados. Conjuntos específicos de neurónios estão marcados por anticorpos anti-proteína verde fluorescente (verde) no SNC inteiros de larvas, que é visualizada por doublestaining anti-FasII/anti-ChAT (magenta). A) NP225 um conjunto de etiquetas de segunda ordem neurónios olfactivos, chamado projecção neurónios (seta) e o sistema de desenvolvimento de adulto visual (ponta de seta). B) NP2426 marcas de um conjunto de interneurónios olfativos (seta) na estação relê primeiro olfativo, chamado o lobo antenal. C) GR66a rotula exclusivamente um conjunto de neurónios sensoriais que gustativas projeto de periféricos gustativas órgãos sensoriais para o gânglio subeosophageal (seta). D) NP3128 etiquetas vários conjuntos de diferentes tipos de neurónios. A seta marca interneurônios olfativos do lobo antenal semelhantes a B. A seta destaca um conjunto de neurônios dopaminérgicos que o projeto em uma região chamada neuropil corpo cogumelo. E) H24 marcas de um conjunto de células de Kenyon cogumelo corpo (seta), neurônios que quando mostrados ser necessária para a aprendizagem olfactiva larval. F) NP7493 é um exemplo de um padrão de expressão relativamente inespecífica que inclui vários conjuntos de neurónios em desenvolvimento (setas) que irá diferenciar ainda mais durante a metamorfose para formar o cérebro da mosca. Barra de escala = 50 um.
Figura Visão geral 5. Resumindo tentativas bem sucedidas para estudar aprendizagem associativa em Drosophila larvas. Estímulos olfactivos, bem como de luz pode ser utilizada como um estímulo condicionado a ser associada com qualquer recompensa ou punição (estímulo não condicionado). Estímulos gratificantes incluem açúcar e baixas concentrações de sal; estímulos punir compreendem altas concentrações de sal, quinino, choque elétrico, calor, estimulação mecânica através de vibração (buzz) e luz 11,12,17-24. Clique aqui para ver maior figura .
| GAL4 / UEA constrói muitas vezes utilizados em nosso laboratório | |||
| Abreviatura | Proteína | Função | Literatura |
| Visualização | |||
| UEA-mCD8 :: GFP | proteína fluorescente verde | membrane marcador | Lee et al., 1999 |
| UAS-n-syb :: GFP | proteína fluorescente verde | marcador de pré-sináptica | Ito et al., 1998 |
| UEA-Dscam17.1 :: GFP | proteína fluorescente verde | marcador pós-sináptica | Wang et al., 2004 |
| UEA-NLS :: GFP | proteína fluorescente verde | marcador corpo celular | Robertson et al., 2003 |
| Interferência com a sinalização neuronal | |||
| UEA-HID | involução cabeça com defeito | induz apoptose | Zhou et al., 1997 |
| UEA-rpr | ceifeiro | induz apoptose | Zhou et al., 1997 |
| UEA-shi ts | dominante negativo dinamina | vesicl blocose reciclagem | Kitamoto, 2001 |
| UEA-Kir.2.1 :: EGFP | interiormente retificar canais de K + | não despolarização da membrana | Baines et al., 2001 |
| UEA-TRPA1 | canal de cátion | temperatura de ativação dependente | Rosenzweig et al., 2005 |
| UEA-chr2 | Channelrodopsina | ativação dependente de luz | Schroll et al., 2006 |
Tabela 1. UAS construções efectoras frequentemente utilizado no laboratório para visualizar a anatomia neuronal e manipular a transmissão sináptica 25-33.
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Discussion
A configuração descrita em larvas Drosophila permite a investigação sobre a aprendizagem associativa olfativa dentro de um cérebro comparativamente elementar. A abordagem é simples, barato, fácil de estabelecer em um laboratório e não requer equipamentos de alta tecnologia 9. Nós apresentamos uma versão do experimento, para estudar a aprendizagem associativa apetitiva reforçado pela recompensa frutose 11. A configuração descrita baseia-se numa série de estudos paramétricos que exaustivamente investigadas variações no número de tentativas de treino, dosagem única versus massa ensaio, o tempo de retenção, os odores usados e as concentrações de odor e sexo 9,15,34,35. Assim, a configuração descrita comportamental integra esta informação em uma abordagem excepcionalmente reprodutível para estudar as funções superiores do cérebro em Drosophila. Em última instância, com base na sua configuração simples efeito de recompensa ou punição de qualquer substância dissoluble pode ser facilmente testado com este ensaio.
ve_content "> Além disso, diversas variantes do paradigma foram publicados recentemente, que permitem a investigação de aprendizagem visual associativa no larvas 23,36 (estabelecido em Gerber et al (2004).) e choque elétrico, luz, quinino, calor ou vibrações também foram implementadas com sucesso como reforços para a aprendizagem aversivos olfativo associativo 9,17,19-21,37-40. Assim, um conjunto abrangente de instalações experimentais existe para analisar a base comportamental, neural e molecular de aprendizagem e memória em larvas de Drosophila ( A Figura 5) 13,14,41,42. Aqui, concentrou-se exclusivamente no odor frutose-aprendizagem, devido à robustez do ensaio e os índices de desempenho relativamente elevados que podem ser alcançados. Especialmente algumas das variantes aversivas levar somente comportamental pequeno Isto limita as mudanças. em certa medida, a aplicação do método, além de problemas de desenvolvimento dos animais que fazem estudos sobre larvas de longo prazomemória, em vez impossível.O cérebro larval consiste de apenas cerca de 10.000 neurônios na sua totalidade. Assim, devido à sua organização relativamente simples (em termos de números), é bem acessível a interferência genética, que por sua vez permite para estudos avançados sobre a base molecular e neuronal da aprendizagem e da memória. Especialmente os sistemas GAL4/UAS e suas modificações recentes permitem a manipulação genética de conjuntos definidos de neurónios e até mesmo as células individuais de uma maneira espácio-temporal (Figura 4) 7,10. Por este meio um amplo conjunto de linhas efectoras oferece a possibilidade de visualizar estes conjuntos definidos de neurónios (Figura 4) 25,43, ou, alternativamente, para manipular a sua saída neuronal (Tabela 1). Na maioria das vezes são aplicados genes efectores que podem autonomamente células induzir a morte celular ou inibir a transmissão neuronal 29,30,33. Mais recentemente foram desenvolvidas tecnologias que albaixo para uma activação de neurónios artificial controlada dirigidas pela luz ou da temperatura (Tabela 1) 31,32,44.
Em resumo, a combinação de meios sofisticados de interferência genética e as experiências aqui descritas comportamentais permitem revelar a base neuronal, molecular e comportamentais de aprendizagem e da memória no cérebro elementar de larvas de Drosophila.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos especialmente de agradecer aos membros do laboratório Gerber para instruções técnicas sobre a sua configuração experimental e comentários sobre o manuscrito. Agradecemos também Lyubov Pankevych para o cuidado mosca e manutenção do estoque selvagem cantões tipo. Este trabalho é apoiado pela subvenção DFG TH1584/1-1, a concessão SNF 31003A_132812 / 1 e o Zukunftskolleg da Universidade de Konstanz (toda a AST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fructose | Sigma | 47740 | 57-48-7 |
| NaCl | Fluka | 71350 | 7647-14-5 |
| Agarose | Sigma | A5093 | 9012-36-6 |
| 1-octanol | Sigma | 12012 | 111-87-5 |
| Amylacetate | Sigma | 46022 | 628-63-7 |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | 8012-95-1 |
References
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