Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme Published: February 18, 2013 doi: 10.3791/4334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,2
1Department of Biology, University of Konstanz, 2Department of Biology, University of Fribourg

Summary

Drosophila larvaları tat ödül ile koku uyaranlara ilişkilendirmek edebiliyoruz. Burada iştahlı çağrışımlı koku öğrenme analizine olanak sağlayan bir basit davranışsal paradigma tarif.

Abstract

Aşağıda biz Drosophila larvaları iştahlı çağrışımlı koku öğrenmenin metodolojik ayrıntılarını anlatacağız. Kurulumu, genetik parazit ile kombinasyon halinde basit bir larva özellikle beyinde birleştirici öğrenme nöronal ve moleküler temelleri analiz etmek için bir tutamak içerir.

Organizmalar mevcut davranışlarını ayarlamak için geçmiş deneyim kullanabilirsiniz. Davranışsal potansiyeliyle ilgili bu tür satın öğrenme olarak tanımlanır ve bellek izleri 1-4 olarak bu potansiyellerin fiziksel temelleri. Edilebilir Sinir bilimciler bu süreçlerin böceklerden omurgalı 5,6 arasında değişen model organizmalarda çeşitli yöntemler kullanarak beyinde moleküler ve nöronal değişiklikleri açısından organize nasıl anlamaya çalışın. Böyle bir çaba için bu basit ve deneysel erişilebilir model sistemlerde kullanılması yardımcı olur. Drosophila larva dayalı bu talepleri karşılamak için ortaya çıktı7-10: Sağlam davranışsal deneyleri, transgenik çeşitli teknikler ve sadece yaklaşık 10.000 nöron (bilişsel sınırlamalar, birkaç davranış seçenekleri ve sorgulanabilir deneyim zenginliği bazı tavizler ile de olsa) oluşan sinir sisteminin temel örgütün varlığının durumu .

Drosophila larvaları kokuları ve şeker 11-14 gibi iştahlı gustatuar donatı arasındaki ilişkileri kurabilir. Standart tahlil, B. Gerber laboratuarda kurulmuş, hayvanlar bir iki karşılıklı koku eğitim almaktadır: larva bir birinci grubu, bir tat güçlendiricidir (şeker ödül) ile bir arada bir koku maruz kalır ve daha sonra bir koku maruz kalır takviye 9 olmadan B. Takviye olmadan koku A yaşıyor ve sonradan takviye (şeker ödül) ile koku B maruz Öte yandan larva ikinci bir grup karşılıklı eğitimi alır. Aşağıda iki grup vardır tesİki kokuları arasında kendi tercihi için ted. Ödüllendirilir koku Nispeten yüksek tercihlerini çağrışımsal öğrenme yansıtır - bir performans indeksi (PI) olarak sunulmuştur. Performans indeksi ilişkisel mahiyeti ile ilgili sonuç ayrı kokular ve tastants gibi koku ve ödül pozlama, zaman ve taşıma geçişi iki grup 9 arasında farklılık yok gibi diğer parametreler arasındaki kontenjan gelen nedeni, zorlayıcı.

Protocol

1. Hazırlık

  1. Drosophila vahşi tip larva 25 yetiştirilir ° C ve 14/10 ışık / karanlık döngüsü 60% -80% nem. Her zaman 20 kadın standart sinek gıda yaklaşık 6 ml içeren bir flakon (6 cm yüksekliğinde ve 2.5 cm çapında) içine 10 erkek ile konur larvaların tam yaşı kontrol etmek için. Sinekler 12 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin verilir ve ikinci gününde yeni bir şişeye aktarılır. 25 ° C yetiştirilen ve hemen davranışsal deney için kullanılıp kullanılamayacağını yumurtlama larva 5-6 gün sonra besleme 3. deri değiştirme safhasında aşama ulaşır. Bununla birlikte, bir şişenin yan larva olmayan gıda hala ve larva sadece almak için temin etmelidir. Bu larvalar zaten "dolaşıp 3. evre evre" ulaştı - kısa bir süre önce pupa devresi - ve kullanımı sonuçların yorumlanmasını zorlaştırmaktadır.
  2. % 2.5 agaroz petri hazırlanması (diğer laboratuvarlar deney boyunca da% 1 agar konsantrasyonlarının kullanımı, nasılHiç düşük konsantrasyonlarda besleme 3. evre larvalar) substrat kazmak için izin verebilir: 100 ml GKD 2 O. 2,5 gr agaroz çözülür Kaynamaya başlayana kadar bir mikrodalga çözümü ısıtın. Dikkatle çözüm ajite ve tüm agaroz eriyene kadar mikrodalga içine geri koymak. Petri kaplarının alt tamamen kapalı ve agaroz çözüm pürüzsüz bir yüzey oluşturur böyle Petri kutularına sıcak agaroz çözüm dökün. Çözelti, oda sıcaklığına kadar soğutulur ve kapakları kapatmak sağlar. Bu kapaklar su yoğuşması için izin verecek, çünkü hemen kapaklarını kapatın etmeyin.
  3. 2M fruktoz Petri yemeklerin hazırlanması: 100 ml GKD 2 O (yine% 1 agar konsantrasyonu kullanımı mümkündür; ancak 3. evre larvalar substrat kazmak besleme izin verebilir) 2.5 gr agaroz çözülür. Kaynamaya başlayana kadar bir mikrodalga çözümü ısıtın. Dikkatle çözüm ajitasyon ve mikro içine geri koymakTüm agaroz kadar dalga çözülür. Dikkatlice sıcak solüsyon içine fruktoz 35 g ekleyin; şeker kaynatma geriliği önlemek için eriyene kadar karışıma yavaş yavaş karıştırılır. Alt tamamen kapalı ve fruktoz-agaroz çözüm pürüzsüz bir yüzey oluşturur böyle Petri kutularına sıcak fruktoz-agaroz çözeltisi dökün. Çözelti, oda sıcaklığına kadar soğutulur ve kapakları kapatmak sağlar. Bu kapaklar su yoğuşması için izin verecek, çünkü hemen kapaklarını kapatın etmeyin.
  4. 1-oktanol (OCT) koku kapları hazırlanması: Teflon koku kabı yapılan özel bir şekilde saf OCT 10 ul doldurun ve koku buharlaşması için izin vermek için birkaç küçük delik olan bir kapakla kapatın. Konteyner ayrıntılı bir açıklama Gerber ve Stocker 2007 yılında verilmiştir. Ekim için üç koku kapları hazırlayın. Koku kaplar eklenen kimyasalların buharlaşması için izin verir, ama larvaları bunları doğrudan irtibata geçebilirsiniz önlemek. Bu nedenle, burada açıklanan deneyler özelliklegustatuar yan etkiler rahatsızlık vermesini olmadan larvaları koku öğrenme ele.
  5. Amylacetate (AM) koku kapları Hazırlanması: seyreltin parafin yağı 01:50. Özel yapım teflon koku kabına dilüsyon 10 ul doldurun ve koku buharlaşması için izin vermek için birkaç küçük delik olan bir kapakla kapatın. AM için üç koku kapları hazırlayın. Seyreltme iki kokuları arasındaki göreli tercihi bir öğrenme bağlı değişim maskeleyebilir diğer üzerinden bir koku için güçlü bir tercih önlemek için yani, pratik nedenlerden dolayı önemlidir. Hem kokuları için eşit cazibe naif hayvanların daha sonra açıklanacağı testi (2.5) uygulayarak deneyden önce laboratuarda teyit edilmesi gerekebilir. Burada sunulan son zamanlarda bizim laboratuar 9,15,16 çoğaltılamaz edildi Gerber laboratuvar çeşitli yayınlara dayanmaktadır değerleri.
  6. Petri kaplarının Etiketleme: davranışsal deneyler önce tüm petri kodlanmış olması gerekir. Demek ki,Petri kapları içeren fruktoz bir "X" veya bir "A" ve "Y" veya "B" ile agaroz sadece Petri kapları ile örneğin işaretlenmiş olması gerekir. Bu kod tüm veriler kaydedildi sonra sadece deneyci ortaya edilmelidir. Deneyler yaparak bu deneyci beklentilerini larvaların performansını etkileyebilir böylece olası "kör" değildir. Biz yalnızca bir agaroz sunulan zaman fruktoz Petri (+) veya non-ödüllendirerek sunulduğunda ya ödüllendirilir klimalı uyaranlara (CS1 veya CS2) gibi kokuları bahsedeceğiz aşağıda geniş bir okuyucu için bir anlayış kolaylaştırmak için Petri kabı (-).

2. Şeker Ödül Eğitim ve Test

  1. Bir gıda şişeden 30 besleme 3. evre larvalar toplayın. Musluk suyu birkaç damla içeren bir ilk Petri onlara aktarın ve dikkatli bir fırça ile ileriye ve geriye doğru hareket ettirin. Ayrıca musluk wa birkaç damla içeren ikinci bir Petri kabı aktarabilirsinizter hiçbir gıda hamur larvaların bodywall kalır kontrol etmek, aksi larva deneme sırasında gıda koku deneyimi mümkün olacaktır. Bu büyük olasılıkla test ortamında öğrenme süreci ve performans karanlıkta bırakırdı.
  2. Eğitim: Bir iştahlı şeker ipucu şu rejimi ile ilişkilendirmek kokulara larva eğitmek için uygulanır. Işaretli bir "X" sol ve sağ tarafında bir OCT koku kabı koyun - bu nedenle, fruktoz ödül (ayrıntılar 1.6 için bkz "kör" deney) (+) Petri kabı içeren. Petri kabı ortasında üzerine 30 besleme 3. evre larvalar grup koyun, kapağını kapatın ve hayvanlar OCT ile maruz kalırken 5 dakika bekleyin. Larvalar su damlası içinde sıkışıp değildir ve bunun yüzey gerilimini aşmak emin olun. Bu larvalar tarafından serbestçe Petri kabı hareket ve koku ve / veya tat uyaranlara yaşayabilirsiniz.
  3. Eğitim: nemli bir fırça ile Petri kabı gelen larva çıkarın ve transferBöylece, agaroz sadece (-) - Petri içeren - bir "Y" ile etiketlenmiş bir ikinci Petri kabı üzerine m ve sol ve sağ tarafında bulunan bir AM koku kabı vardır. Kapağını kapatın ve hayvanlar AM maruz iken 5 dakika bekleyin.
  4. Eğitim: iki kere tekrar 2.2) ve 2.3), öyle ki her 30 larva tecrübe üç çalışma çevrimi: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). Bu deneyde CS1 AM için OCT ve CS2 kodunu temsil eder.
  5. Test: Yeri 01:00 ve agaroz yalnızca Petri kabı karşıt sitelerinde tek Ekim koku kabı. Test Petri kabı orta eğitimli hayvanlar aktarın. Kapağı kapatın ve 5 dakika bekleyin. Daha sonra sol tarafta, test Petri kabı orta ve sağ tarafındaki larva sayısını saymak.
  6. 30 besleme 3. evre larvalar ikinci bir grup ile 2.5) için adım 2.1) tekrarlayın fakat AM ve OCT hayvanlar aşağıdaki eğitim aldığınız gibi deneysel rollerini takas: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). Bu deneyde CS1 AM için OCT ve CS2 kodunu temsil eder.
  7. Eğitim için olası düzenlemeler. Biz OCT / (+) ya da üç eğitim çalışmaların var olduğu bir eğitim sunmak Üstü - AM / (-) veya AM / (+) da üç eğitim çalışmalarının karşılıklı grubunda - OCT / (-). Eğitim sırasında sıralamaya bağlı etkileri önlemek için Bununla birlikte, tam bir deney aşağıdaki tekrarlarında uyarıcının dizi değişiklik için önemlidir. CS1 ve CS2 sipariş ve ayrıca birinci ve ikinci plaka içinde sunulan ödül sunum değiştirilerek, eğitim denemeler için dört farklı sekanslar mümkündür:
Birinci grup CS1 / (+) - CS2 / (-) Karşılıklı grubu CS2 / (+) - CS1 / (-)
CS1 / (-) - CS2 / (+) CS2 / (-) - CS1 / (+)
CS2 / (+) - CS2 / (-) CS1 / (+) - CS2 / (-)
CS2 / (-) - CS1 / (+) CS1 / (-) - CS2 / (+)

Çevre deney ortamında uyaranlara sistematik etkilerini önlemek için, bir OCT soldaki sunulan ve sağa AM olduğu gibi vakaların bir yarısında testi yapmak zorundadır. Olguların diğer yarısında sağda solda ve OCT üzerine sunulmalıdır AM.

3. Görev ilgili Duyusal-motor Fakülteler Testleri

Yukarıda açıklanan deney tasarımı, kendi başına 3. deri değiştirme safhasında larva besleme vahşi tip koku-şeker öğrenme analiz etmek için olanak sağlar. Olfaktör öğrenme parametresine bağlıdır Ancak, günlük laboratuar yaşam araştırmacılar genellikle, karşılaştırmak larva iki veya daha fazla farklı deney grupları kullanabilirsinizticular gen, nöron, belirli bir mutant bir stok, özel bir gıda diyet, farklı yetiştirme koşulları, toksik kimyasallar larvaları, iki ya da daha fazla Deney grupları test edilmiş tüm durumlarda tek bir ilgisi vardır Böylece, vb, gelişme sırasında eklenen larvalarının farklı gruplar uygun duyusal-motor keskinlikleri gösteriyorsa, test etmek zorunlu kontrol deneyleri kümesi. Potansiyel fenotipleri mutlaka şeker ile ilişkilendirmek kokulara azaltılması veya tamamen kaldırılması yetenekleri nedeniyle değil gibi bu zorunlu hale gelir. Aksine, potansiyel öğrenme kusurları koku ve / veya şeker işleme duyusal-motor devresi herhangi bir aşamada kusurları dayalı olabilir. Bir larva mutant his şeker mümkün değilse, ya da başka bir deyişle, bir şeker bellek tesis edilemez. Ama bu larva öğrenemez sonucuna izin vermez. Ayrıntılı olarak aşağıdaki kontrol deneyleri uygun OCT, AM ve transgenik larvaların fruktoz işlenmesi için test yapılması gerekir.

1. Naif Ekim prefe için testdendir

Bir gıda şişeden 30 besleme 3. evre larvalar toplayın. 2.1 açıklandığı gibi musluk suyu dikkatlice yıkayın. Bir agaroz Petri bir tarafında tek bir Ekim koku kabı koyun, Petri kabı ortasında üzerine larvaları ekleyin kapağını kapatın ve larvaları OCT doğru Petri kabı ve şark sürün ki gibi, 5 dakika bekleyin koku kaynağı. Daha sonra orta ve deney Petri kabı sağ tarafında, sol tarafta larvaların sayısını.

2. Naif AM tercihi için test

Bir gıda şişeden 30 besleme 3. evre larvalar toplayın. 2.1 açıklandığı gibi musluk suyu dikkatlice yıkayın. Bir agaroz Petri bir tarafında tek AM koku kabı koyun, Petri kabı ortasında üzerine larvaları ekleyin kapağını kapatın ve larvaları AM doğru Petri kabı ve şark sürün ki gibi, 5 dakika bekleyin koku kaynağı. Sonradan l sayısınıortasında ve deney Petri kabı sağ tarafında, sol tarafta arvae.

3. Naif şeker tercihi için test

Bir gıda şişeden 30 besleme 3. evre larvalar toplayın. 2.1 açıklandığı gibi musluk suyu dikkatlice yıkayın. Yarısı ve diğer yarısı bir 2M fruktoz-agaroz karışımı içinde% 2.5 agaroz içeren Petri kapları hazırlayın. Petri kabı üzerine larvaları ekleyin, larva fruktoz içeren tarafına doğru Petri kabı ve şark sürün olabilir böyle 5 dk için kapağını kapatın ve bekleyin. Daha sonra orta ve deney Petri kabı sağ tarafında, sol tarafta larvaların sayısını.

Yarım yarım petri Hazırlanması: Yukarıda Bölüm 1.2 'de belirtildiği gibi normal agaroz tabak hazırlayın. Agaroz dolu petri soğutulduktan sonra, dikkatli bir neşter ile dikey eksen boyunca agaroz kesilir. Petri kabı dan agaroz yarısı çıkarın. APetri kabı boş yarısına gg sıcak fruktoz-agaroz çözüm (Hazırlık 1.3). Her iki yarım maç ve tanımlanmış bir kenar oluşturmak olmadığını dikkatli olun - Bu larva seçim davranışını etkiler ve oldukça zor bir davranış analizi render 4..

Sham eğitimi

Transgenik besleme 3. evre larvalar OCT ve hava (3.1), AM ve hava (3.2) ve şeker ve saf agaroz (3.3), test deney ek bir kümesi arasındaki vahşi bir düzeyde ayırt etmek mümkün olup olmadığını test rağmen son zamanlarda olmuştur (tartışma için Gerber ve Stocker, 2007 bakınız) tanıttı. Bu deneyler için gerekçesi aşağıdaki gibidir. Eğitim larva döneminde kitlesel taşıma ve izleyen koku ve şeker stimülasyon tabi. Böylece gözlenen öğrenme fenotip (naif koku ve şeker algı testleri vahşi bir düzeyde olsa da!) Yanıltıcı olduğunu da mümkündür. Gerçekten de, mümkün olduğu transjenik hayvanların dstres direnci, motivasyon, yorgunluk, duyusal adaptasyon, bağlamsal öğrenme ve tokluk değişiklikleri ile ilgili vahşi tip larva iffer. Böylece, Michels ve ark. (2005) size ödül atlarsanız ve sadece her iki maruz dışında tam olarak eğitim sırasında larva tedavisi durumunda, belli bir mutant (1) tespit etmek mümkün olup olmadığını sınama boş bir koku kabı karşı AM denetimleri tanıttı kokuları, size kokuları ihmal ve sadece ödül maruz dışında bir eğitim-benzeri şekilde larva davranırsan (3), boş bir koku kabı karşısında AM tespit;, (2) aynı rejim sonrasında Ekim algılamak ve (4 ) aynı rejim sonrasında Ekim algılayabilir. Kapsamlı bir tartışma ve yöntemleri hakkında daha fazla bilgi için Michels ve ark (2005) ve Gerber ve Stocker (2007) bakınız.

4. Şeker Ödül Öğrenme Veri Analizi

  1. Şeker ödül öğrenme protokolü veri değerlendirmek için iki Recipro her biri için OKT tercih indeksi (PREF OCT) hesaplamakCally eğitimli gruplar:
    AM / - (-) OCT / (+) almış olan ilk grup için eğitim:
    PREF Ekim (OCT + / AM) = (# Ekim tarafta larvaların - # AM tarafta larva) / # bütün larvaların sağ, sol ve orta bölgeler içinde
    : - OCT / (-) eğitim AM / (+) alınan ikinci grup için
    PREF AM (AM + / OCT-) = (AM # tarafta larvaların - # larva OCT tarafında) / # sağ, sol ve orta bölgeler içindeki tüm larvaların
  1. 4,1 iki PREF değerleri için performans indeksi (Pİ)) hesaplayın. PI koku ve ceza pozlama, zaman ve taşıma geçiş rahatsızlık vermesini etkilerini iptal ederek ilişkisel öğrenmeyi temsil eder:
    PI = (PREF Ekim (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / OCT)) / 2
    Böylece PI'ler -1 ile 1 arasında değişir. Anlamlı pozitif değerler iştahlı öğrenme açıklamak ise anlamlı negatif değerler caydırıcı, öğrenme temsil eder. Tam bir deneme genellikle 10 veya daha fazla PI'ler oluşmaktadır. Veri kutusunda araziler includin görselleştirildiği gibidirBelirli bir deney grubu g tüm değerleri. Değerlerin% 50 kutu içinde bulunan varlık; ortanca performans indeksi kutusu arsa içinde bir kalın çizgi olarak gösterilir.

5. Görev ilgili Duyusal-motor Fakülteler için Veri Analizi

  1. Uygun Ekim koku işleme şöyle bir OCT koku tercihi indeksi hesaplamak için test ederken verileri değerlendirmek için:
    Koku PREF Ekim = (# Ekim tarafta larvaların - # diğer tarafta larva) / # sağ, sol ve orta bölgeler içindeki tüm larvaların
  2. Uygun AM koku algısı aşağıdaki gibi bir AM koku tercihi indeksi hesaplamak için test ederken verileri değerlendirmek için:
    / # Sağ, sol ve orta bölgeler içindeki tüm larvaların - PREF AM = (# diğer tarafta larvaların AM # tarafında larva) Koku
  3. Uygun fruktoz algı için test aşağıdaki gibi bir fruktoz tercih indeksi hesaplamak zaman verileri değerlendirmek için:
    PREF fruktoz = (# fruktoz tarafta larvalarının - # diğer tarafta larva) / # Sağ, sol ve orta bölgeler içindeki tüm larvaların
  4. Sahte eğitim için ayrıntılar Michels ve ark 'de verilmiştir. 2005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1A larva olfaktör çağrışımsal öğrenme için deneysel prosedürlerin genel bir görünümünü gösterir. Bir şeker ödül larvaları ile iki sunulan kokuların bir eşleştirme ile ödüllendirilmemiş koku ile karşılaştırıldığında, ödül koku doğru çekici bir tepki ifade etmek için potansiyel davranış kazanır. Larva iki grup her zaman ya da koku Ekim veya AM ile pekiştireç eşleştirme tarafından eğitilir. Performans indeksi (Pİ) karşılıklı eğitimli gruplar arasında tercih farkı olarak ilişkisel işlevi ölçer.

Birleştirici fonksiyonu transgenik larvaları incelendiğinde durumda, temel duyu-motor yetenek testleri gereklidir. Bu onlara bir dolu koku kabı ve hava arasındaki veya saf agaroz ve agaroz artı bir şeker arasında seçim sunarak yapılır. (Sham eğitimi burada gösterilmemiştir). Larvaların son dağıtımı, belirli bir veri sayfasında belirtildiği (Şekil 2) ve vis edilirBir kutu diyagramı (Şekil 3) olarak ualized. Olumlu sonuçlar tercihi endeksleri ve performans endeksleri durumunda iştahlı öğrenme için cazip bir seçim davranışı göstermektedir. Negatif değerler hesaplanan tercihi endeksleri için caydırıcı bir seçim davranışı gösterir ve caydırıcı performans endeksleri halinde öğrenme.

Şekil 1
Şekil 1. Larva çağrışımlı koku öğrenme, naif koku tercihleri ​​ve naif tat tercihlerini ölçmek için davranışsal deney şeması.

  1. 30 Drosophila besleme 3. evre larvalar 2M fruktoz şeker ödül içeren bir agaroz Petri kabı beş dakika yerleştirilir. Aynı zamanda, bir birinci koku Teflon konteyner sağlanmıştırs (OCT). Böylece larvalar ilk eğitim aşamasında olumlu pekiştireç bir koku uyaran ilişkilendirebilirsiniz. Daha sonra, larvalar güçlendiricidir olmayan fakat yine 5 dakika için ikinci bir koku (AM) ile ikinci bir agaroz Petri tabağına aktarılır. Eğitim üç kez tekrarlanır. Son olarak, test ortamında larvaların koku tercih agaroz bir Petri tabağına olmayan ödüllendirdi koku karşı ödül koku için ölçülür. Bu bir ilk tercihi indeksi (PREF) hesaplama sağlar. Larva ikinci bir grup karşılıklı şekilde benzer eğitilmiştir. Burada, ikinci bir tercih indeksi (PREF) hesaplanabilir. Sonunda Performans Endeksi (PI) tercihi endeksleri hem ortalaması alınarak hesaplanır. Çalışmaların sırası ile ilgili daha fazla bilgi için ayrıca bkz: 2.7.
  2. Naif koku tercih analiz etmek için, OKT veya AM ya ile dolu bir tek koku kabı saf agaroz Petri kabı bir tarafında yer alır. 30 besleme 3. evre larvalar pla vardırPetri kabı ortasında ced ve 5 dakika sonra Petri tabağına larvaların dağılım sayılır. Elde edilen veriler sonucunda bir koku tercihi indeksi (PREF) hesaplanır.
  3. Naif tat tercihini 2M fruktoz analiz için onun diğer tarafta saf agaroz içeren bir Petri kabı bir yarısında doldurulur. 30 besleme 3. deri değiştirme safhasında larva Petri tabağına yerleştirilir ve 5 dakika sonra Petri tabağına larvaların dağılım sayılır. Elde edilen veriler sonucunda bir tat tercih Endeksi (PREF) hesaplanır.

Şekil 2,
Şekil 2. A) şeker ödül öğrenme için elde veri kaydetme ve işleme için bir ham veri sayfası örneği, B) naifkoku tercihleri ​​ve C) naif tat tercihleri. Tüm deneyler için, orta ve Petri kutularına ve sağ tarafında sol tarafta larva sayısı belirtilmiştir. Bu bilgilerin tercihi endeksleri Out (PREF) hesaplanır. Larva öğrenme iki karşılıklı eğitim gruplarının Prefs computating kaynaklanan performans endeksleri (PI) olarak tasvir edilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3
Şekil 3. Örnek veri görselleştirme A) şeker ödül öğrenme, B) naif koku tercihleri ​​ve C) naif tat tercihleri ​​için elde. Kutudiyagramlar aşağıdaki gibi verileri temsil: medyan (kutu içinde kalın çizgi), üst ve alt bıyık diğer her biri% 25 temsil etmektedir kutu tüm veri noktaları arasında en az% 50 olduğunu gösterir. Dolayısıyla aykırı olmadan minimum ve maksimum değerler bıyık sınırları ile gösterilir. Aykırı küçük daireler gibi onlar herhangi bir nokta 1. ve 3. çeyrekleri den fazla 1,5 kez çeyrekler arası aralık olarak tanımlanır tasvir edilmektedir. Wilcoxon rank sum testi iki veri gruplarının karşılaştırılması için kullanılır ise tek veri noktaları istatistiksel analizi, Wilcoxon signed rank testi ile yapılır. Anlamlılık düzeyi p ns> 0.05, * p <0.05, ** p <0.01 veya p *** <0.001 olarak gösterilir. Her deney örnek büyüklüğü: N = 15.

A) öğrenme deneyleri için her zaman karşılıklı deneylerinin iki tercihi endeksleri (PREF) nihai performans indeksi (Pİ) hesaplamak için alınır. Performans Endeksleri (PI) uygun kutu araziler olarak tasvir edilir.


Şekil 4,. Larva beyin içindeki hücrelerin belirli bir etiketler, her biri gal4 hatları örnekleri. Larva beynin frontal görüşlerinin daima tam z projeksiyonları gösterilmiştir. Nöronların spesifik setleri anti-FasII/anti-ChAT doublestaining (eflatun) tarafından görüntülenmiştir bütün larva CNS anti-yeşil floresan protein (yeşil) tarafından etiketlenir. A) NP225 etiketleri projeksiyon denilen ikinci dereceden olfaktör nöron kümesi, nöronlar (ok) ve gelişmekte olan yetişkin görme sistemi (ok başı). B) NP2426 işaretleri ilk koku röle istasyonu olfaktör internöron (ok) bir dizi, anten lob denir. C) GR66a münhasıran bu tat duyu nöronlarının bir dizi etiketler periferik tat duyu organlarından gelen subeosophageal gangliyona projesi (ok). D nöronlar farklı türde) NP3128 etiketleri birkaç setleri. Ok nöropil bölgenin üzerine proje mantar vücut denilen dopaminerjik nöronların bir dizi vurgulamaktadır ok ucu B. benzer anten lob koku internöron işaretler. E) H24 işaretleri mantar vücut Kenyon hücreler (ok), gösterildiği nöronların bir dizi larva koku öğrenme için gerekli olması. F) daha fazla NP7493 sinek beyin oluşturmak üzere değişim sırasında ayırt gelişmekte olan nöronların (oklar) birkaç takım içerir nispeten spesifik olmayan salgılama modeli bir örnektir. Ölçek bar = 50 mikron.

Şekil 5,
Şekil 5. Bakış D çağrışımsal öğrenme çalışma başarılı girişimleri özetleyenrosophila larva. Koku uyaran hem de hafif ödül veya ceza (koşulsuz uyaran) ya ile ilişkili bir şartlı uyarıcı olarak kullanılır. Ödüllendirme uyaranlara şeker ve tuz düşük konsantrasyonlarda içerir; cezalandırıyor uyaranlara tuz konsantrasyonu yüksek, kinin, elektrik çarpması, ısı, mekanik titreşim yoluyla uyarılması (vızıltı) ve ışık 11,12,17-24 oluşmaktadır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Gal4 / UAS laboratuarımızda sık kullanılan inşa
Kısaltma Protein Fonksiyon Edebiyat
Görüntüleme
UAS-mCD8 :: GFP Yeşil floresan proteini membrane işaretleyici Lee ve ark., 1999
UAS-n-SYB :: GFP Yeşil floresan proteini presinaptik işaretleyici Ito ve ark., 1998
UAS-Dscam17.1 :: GFP Yeşil floresan proteini postsinaptik işaretleyici Wang ve ark., 2004
UAS-NLS :: GFP Yeşil floresan proteini hücre gövdesi işaretleyici Robertson ve diğ., 2003
Nöronal sinyal ile müdahale
UAS-hid kafa involüsyon arızalı apoptozis Zhou et al., 1997
UAS-rpr orakçı apoptozis Zhou et al., 1997
UAS-shi ts Dynamin negatif baskın blokları vesicle geri dönüşüm Kitamoto, 2001
UAS-Kir.2.1 :: EGFP içsel K + kanal rektifiye Hiçbir membran depolarizasyon Baines ve ark., 2001
UAS-TRPA1 katyon kanalı Sıcaklığa bağlı bir etkinleştirme Rosenzweig ve ark., 2005
UAS-ChR2 Channelrhodopsin ışığa bağımlı aktivasyon Schroll ve ark., 2006

Tablo 1. Genellikle nöronal anatomi görselleştirmek ve sinaptik iletim 25-33 işlemek için laboratuarda kullanılan UAS efektör yapıları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila larvaları anlatılan kurulum kıyaslanabilir bir ilköğretim beynin içindeki birleştirici koku öğrenme soruşturma için izin verir. Yaklaşımı bir laboratuvar kurmak için, basit, ucuz, kolay ve yüksek teknoloji ekipman 9 gerektirmez. Biz fruktoz ödül 11 ile takviye iştahlı çağrışımsal öğrenme çalışma deneyi, bir sürümü mevcut. Anlatılan kurulumdan kapsamlı eğitim denemelerinin sayısı varyasyonları, tek tahlil karşı kitle tayini, saklama süresi, kullanılan koku ve koku konsantrasyonları ve cinsiyet 9,15,34,35 araştırılmıştır parametrik çalışmalar bir dizi dayanmaktadır. Böylece, tasvir davranışsal kurulum Drosophila yüksek beyin fonksiyonları incelemek için son derece tekrarlanabilir bir yaklaşım, bu bilgileri bütünleştirir. Sonuçta, herhangi bir çözünür madde ödüllendirmek veya cezalandırmak etkisi kolayca bu deneyde test edilebilir, basit kurulum dayanmaktadır.

ve elektrik çarpması, ışık, ısı, kinin veya; ve_content "> Ayrıca, paradigma çeşitli türevleri son larva 23,36 (. Gerber ve ark (2004) yılında kurulmuştur) ilişkilendirilebilir görsel öğrenme soruşturma izin verdiğini yayınlandı titreşimler de başarıyla çağrışımlı koku öğrenme 9,17,19-21,37-40 için caydırıcı reinforcers olarak uygulanmıştır. Böylece, deney düzeneğinde kapsamlı bir dizi öğrenme ve Drosophila larvaları bellek (en, davranışsal nöronal ve moleküler temelleri analiz var Şekil 5) 13,14,41,42. Burada, tahlil ve elde edilebilir nispeten yüksek performans endeksleri gürbüzlüğüne öğrenme koku-fruktoz odaklanmıştır. Özellikle caydırıcı bazı varyantlar sadece küçük davranışsal yol değişir. Bu sınırlar larva uzun süreli çalışmalar yapmak hayvanların gelişim ile ilgili konular yanında, yöntem, bir dereceye uygulama içinoldukça imkânsız bellek.

Larva beyin kendi bütünlüğü içinde sadece yaklaşık 10,000 nöron oluşur. Böylece onun (sayı bakımından) göreceli basit organizasyon nedeniyle bu da öğrenme ve hafızanın moleküler ve nöronal bazında ileri çalışmalar için izin genetik girişime de erişilebilir. Özellikle GAL4/UAS sistemleri ve yeni değişiklikler nöronların tanımlı ayarlar genetik manipülasyonu için izin ve yukarı bir uzay-zamansal bir şekilde (Şekil 4) 7,10 bile tek hücrelere. İşbu efektör hatları kapsamlı bir dizi kendi nöronal çıkışı (Tablo 1) işlemek için nöronların bu tanımlı ayarlar (Şekil 4) alternatif 25,43 veya görselleştirmek için imkan sunuyor. Çoğu zaman efektör genler hücre-bağımsız olarak hücre ölümüne sebep ya da nöronal iletimi 29,30,33 inhibe edebildiği uygulanır. Daha yakın zamanda geliştirilen teknolojiler olduğunu arkışık veya ısı (Tablo 1) 31,32,44 tarafından sürülen nöronların bir kontrollü yapay aktivasyonu için düşüktür.

Özet olarak, genetik parazit ve burada açıklanan davranışsal deney ince yöntemlerin kombinasyonu öğrenme ve Drosophila larvalarının temel beyin bellek, sinirsel ve davranışsal moleküler temeli ortaya çıkarılması mümkün kılar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz özellikle deney düzeneği ve el yazması üzerinde yorumlar hakkında teknik talimatlar için Gerber laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz de vahşi tip kantonlar stoklar sinek bakım ve onarım için Lyubov Pankevych ederim. Bu çalışma DFG hibe TH1584/1-1, SNF hibe 31003A_132812 / 1 ve Konstanz Üniversitesi Zukunftskolleg (bütün AST) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fructose Sigma 47740 57-48-7
NaCl Fluka 71350 7647-14-5
Agarose Sigma A5093 9012-36-6
1-octanol Sigma 12012 111-87-5
Amylacetate Sigma 46022 628-63-7
Paraffin oil Sigma 18512 8012-95-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawlow, I. P. New Researches on Conditioned Reflexes. Science. 58, 359-361 (1923).
  2. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat. Rev. Neurosci. 4, 266-275 (2003).
  3. Kandel, E. R. Cellular insights into behavior and learning. Harvey Lect. 73, 19-92 (1979).
  4. Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 737-744 (2004).
  5. Milner, B., Squire, L. R., Kandel, E. R. Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron. 20, 445-468 (1998).
  6. Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 8, (2007).
  7. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  8. Gerber, B., Stocker, R. F., Tanimura, T., Thum, A. S. Smelling, tasting, learning: Drosophila as a study case. Results Probl. Cell. Differ. 47, 139-185 (2009).
  9. Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem. Senses. 32, 65-89 (2007).
  10. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  11. Gerber, B., Hendel, T. Outcome expectations drive learned behaviour in larval Drosophila. Proc. Biol. Sci. 273, 2965-2968 (2006).
  12. Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
  13. Pauls, D., Selcho, M., Gendre, N., Stocker, R. F., Thum, A. S. Drosophila larvae establish appetitive olfactory memories via mushroom body neurons of embryonic origin. J. Neurosci. 30, 10655-10666 (2010).
  14. Selcho, M., Pauls, D., Han, K. A., Stocker, R. F., Thum, A. S. The role of dopamine in Drosophila larval classical olfactory conditioning. PLoS One. 4, e5897 (2009).
  15. Neuser, K., Husse, J., Stock, P., Gerber, B. Appetitive olfactory learning in Drosophila larvae:effects of repetition, reward strength, age, gender, assay type and memory span. Animal Behaviour. 69, 891-898 (2005).
  16. Scherer, S., Stocker, R. F., Gerber, B. Olfactory learning in individually assayed Drosophila larvae. Learn Mem. 10, 217-225 (2003).
  17. Aceves-Pina, E. O., Quinn, W. G. Learning in normal and mutant Drosophila larvae. Science. 206, 93-96 (1979).
  18. Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. J. Neurogenet. 2, 1-30 (1985).
  19. Khurana, S., Abu Baker, M. B., Siddiqi, O. Odour avoidance learning in the larva of Drosophila melanogaster. J. Biosci. 34, 621-631 (2009).
  20. Pauls, D., et al. Electric shock-induced associative olfactory learning in Drosophila larvae. Chem. Senses. 35, 335-346 (2010).
  21. Eschbach, C., et al. Associative learning between odorants and mechanosensory punishment in larval Drosophila. J. Exp. Biol. 214, 3897-3905 (2011).
  22. von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
  23. Gerber, B., et al. Visual learning in individually assayed Drosophila larvae. J. Exp. Biol. 207, 179-188 (2004).
  24. Rohwedder, A., et al. Nutritional Value-Dependent and Nutritional Value-Independent Effects on Drosophila melanogaster Larval Behavior. Chem. Senses. , (2012).
  25. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
  26. Ito, K., et al. The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen. Learn Mem. 5, 52-77 (1998).
  27. Wang, J., et al. Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis. Neuron. 43, 663-672 (2004).
  28. Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression. Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).
  29. Zhou, L., et al. Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).
  30. Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
  31. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  32. Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
  33. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  34. Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).
  35. Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).
  36. von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. , (2011).
  37. Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae. J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).
  38. Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae. J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).
  39. Khurana, S., et al. Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement. Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).
  40. Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. Memory through metamorphosis in normal and mutant. 14, 68-74 (1994).
  41. Michels, B., et al. Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning. Learn Mem. 18, 332-344 (2011).
  42. Saumweber, T., et al. Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47. J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).
  43. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186, 735-755 (2010).
  44. Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).

Tags

Nörobilim Sayı 72 Gelişimsel Biyoloji Nörobiyoloji Biyokimya Moleküler Biyoloji Fizyoloji Davranış, Meyve sineği larva evre koku alma koku alma sistemi koku 1-oktanol OCT öğrenme ödül şeker besleme hayvan modeli
In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Apostolopoulou, A. A., Widmann, A.,… More

Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter