Summary
Протоколы для нейрональной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs), часто отнимает много времени и потребует значительных навыков культуры клеток. Здесь мы адаптировали небольшая молекула на основе дифференциации процедуры в формат пластин multititre, позволяющий простым, быстрым и эффективным поколения человеческие нейроны в управляемом режиме.
Abstract
Существующие протоколы для генерации нейроны из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), часто утомительной в том, что они многоступенчатой процедуры, связанные с выделением и расширением нейронных клеток-предшественников, до терминальной дифференцировки. По сравнению с этим трудоемким подходы, недавно мы обнаружили, что комбинированное торможение тремя сигнальными путями, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, и FGF / ERK, способствует быстрой индукции нейроэктодермы от hPSCs, с последующим немедленным дифференциации в функциональные нейроны. Здесь мы адаптировали нашу процедуру новый формат пластин multititre, дальнейшего повышения ее воспроизводимости и сделать его совместимым с середины пропускная способность приложений. Она включает в себя четыре дня нейроэктодермы образование в плавающих сфер (эмбриоидных органов), а затем еще четыре дня дифференциацию в нейроны под приверженцем условиях. Большинство клеток, полученных с помощью этого протокола, кажется, биполярное сенсорных нейронов. Кроме того,Процедура очень эффективна, не требует особых навыков эксперта, и основан на простом химически определенной среде с экономичным малых молекул. Благодаря этим особенностям, процедура может служить полезной платформой для дальнейшего функционального расследования, а также для клеточного скрининга приближается требующих человеческих сенсорных нейронов или нейронов любого типа.
Introduction
hPSCs, включая эмбрионов, полученных человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), являются плюрипотентных смысле, что они могут дать повод для разных линий клеток в лабораторных условиях 1-2. Многочисленные дифференцированных типов клеток были получены из ЭСК на сегодняшний день, подтверждая мнение, что эти клетки представляют ценный инструмент для научных исследований и клеточных подходов скрининга, а также перспективны для клеточной терапии.
Нейронные протоколов дифференциации ЭСК, как правило, сложный и трудоемкий, поскольку они часто основаны на первом вызывающие общий нервный судьбы, после чего руководство изоляции нейронных предшественников, и последующей дифференциации терминал в данном нейроне типа интересом 3-6. В некоторых связи, эта сложность не удивительно и неизбежным, учитывая, что такое государство-оф-искусство направлены протоколы дифференциации, как правило, поэтапно имитировать раннее развитие человеческого потенциала, whicч само по себе чрезвычайно сложно. С другой стороны, оно может частично отражать наше отсутствие понимания основных молекулярных процессов, в результате дифференциации протоколов, которые еще далеко не полностью оптимизирована.
Что касается превращения недифференцированных hPSCs в нейроэктодермы, Пера и соавт. Установлено, что подавление BMP / SMAD1/5/8 сигнализации повышает нейронной индукции ЭСК 7. Кроме того, инактивация SMAD2 / 3 сигнализация была показана способствовать формированию нейроэктодермы 8. Соответственно, в сочетании инактивации этих двух путей имеет тенденцию приводить к более эффективному нейронной индукции hPSCs 4,9. Совсем недавно, мы показали, что третий сигнальный путь, FGF / ERK, служит сильным репрессор из первых шагов обязательства нейроэктодермальных в ЭСК. С другой стороны, одновременное подавление всех этих трех путей приводит к почти однородным преобразованием ЭСК в нейроэктодермы свсего за четыре дня 10. Впоследствии, высокоэффективных терминальной дифференцировке в функциональные нейроны наблюдалось в течение восьми дней. Нейроны были получены, вероятно, будет сенсорных нейронах периферической нервной системы, которое может частично объяснить их быстрого вывода 10. Дефекты в сенсорных нейронов обслуживания считается причиной некоторых болезней человека, таких как семейные Dysautonomia 11. Для моделирования таких заболеваний, основанный на технологии hiPSC 12, для дальнейшего функциональные характеристики, а также для прикладных целей, не требующих особого типа нейронов, эта дифференциация процедуры могут представлять собой полезную основу.
Тем не менее, стратегия дифференциации мы изначально занято участвуют формирования эмбриональных органов (ЭТ) от скопления колоний ЭСК 10, и это привело к довольно степень неоднородности в отношении EB размеров, а также появилась на компромисс нейрона эффективности формирования в некоторых сеLL линий. Кроме того, из-за неоднородности в размерах EB, способность к систематическому проверить эффекты дополнительных факторов роста или малых молекул, во время и после формирования нейронов, казалось, несколько сбит с толку.
В этом докладе мы адаптировали нашу предыдущую процедуру для средней пропускной совместимы, вынуждены агрегации на основе техники для создания ЭТ в высшей степени размер контролируемой форме, а также показаны в других контекстах 13. Впоследствии ЭТ генерируется в V-формы лунки 96-луночных были переданы в П-образной ультра-низким вложений 96-луночные планшеты, инициировать нейроэктодермы образование в суспензии. Четыре дня спустя, ЭТ может быть высевают что приводит к терминально дифференцированные нейроны с высокой эффективностью и однородностью. Кроме того, день-4 ЭТ были распадается на отдельные клетки и высевают, как такие, в результате которых низкой плотности монослоя человеческих нейронов. Когерентные результаты были получены до сих пор с двумя независимыми де-rived линий ЭСК, HuES6 и NCl3.
В качестве предпосылки, успешное формирование EB было строго зависит от использования синтетических полимеров, поливинилового спирта (ПВС), вместе с рок-ингибитор Y-27632 известно, способствуют выживанию чЭСК 13-14. В результате, однородность ЭТ формируется в 96-V-пластины были существенно расширены по сравнению с формирования ЭТ как массовое культур на основе случайных методов расщепления. Эта система обеспечивает, таким образом значительно улучшить платформу для нейроэктодермы образование в суспензионной культуре, а затем строго контролируемых нейронов при формировании приверженцем условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Matrigel покрытие пластин и СМИ
- Подготовка Matrigel покрытием Matrigel пластины были найдены, чтобы быть предпочтительным субстратом для прикрепления дифференциации ЭТ, а также способствует эффективному вырост нейронов из этих 10.
- Оттепель 10 мл Matrigel ночь на льду.
- На следующий день, развести желеобразной Matrigel с двумя объемами ледяной DMEM/F-12 и подготовить аликвоты по 1 мл в prechilled 15 мл конические пробирки, которые могут храниться замороженными при -20 ° C.
- Решают на пластину формата дифференцировку нейронов. Например, в качестве отправной точки, мы рекомендуем выполнить первый раунд дифференциации в 12-луночный формат. Предварительно прохладно четыре 12-луночных планшетах при 4 ° C. Растворите одну аликвоту замороженных Matrigel путем добавления 9 мл предварительно охлажденного DMEM/F-12 затем с помощью пипетки вверх и вниз, пока все разведенного Matrigel оттаивания и растворяют.
- Затем, Передавать содержимое в новый 50 мл пробирку, содержащую 15 мл DMEM/F-12 на льду (конечное разведение Matrigel: 1:75). Затем добавить 0,5 мл разведенной Matrigel в каждую лунку предварительно охлажденные 12-луночных планшетах. Оберните пластин с Parafilm и дать постоять при комнатной температуре в течение ночи.
- На следующий день, передавать пластин до 4 ° C. Покрытые пластины можно хранить в течение нескольких недель перед использованием.
- Средства массовой информации
EB формирования среднего (~ 15 мл, необходимых для выполнения дифференциации в одном 96-луночный планшет - см. таблицу 1 и схему на рисунке 2):
DMEM/F-12 с 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 нг / мл FGF2
10 мкм Y-27632
1x PenStrepGln
Дифференциация среднего (~ 30 мл, необходимых для выполнения дифференциации в одном 96-луночный планшет с последующим формированием нейрона в одной Matrigel покрытые 12-луночный планшет, см. таблицу 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% BSA
0,5 мкМ PD0325901
15 SB431542 мкМ
0,5 мкМ Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Принудительное EB Формирование
- Расти hPSCs под нужный фидерных свободных условиях. Мы используем MEF-кондиционированной среды на матригеле покрытием 6-луночных планшетах 15. Тем не менее, другие системы культуры, такие как домашние или коммерческие определены средства массовой информации также должны работать. На момент начала эксперимента дифференциации, hPSCs должна быть суб-вырожденная и активно растет.
- Механически удалить спонтанно дифференцировать колонии, используя стерильный пластиковый наконечник пипетки под стерео микроскоп.
- Вымойте оставшиеся недифференцированные колонии использованием PBS, и дайджест на одной клетки, используя Accutase 1X содержащие Y-27632. Пелле отдельных клеток путем центрифугирования при 200 мкг в течение 2 мин, ресуспендируют в небольшом объеме EB среднего формирования и определить титр клетки помощью гемоцитометр.
- Добавить аликвоты клетокостальные средние формирования EB привести к титр между 40000 и 80000 клеток на мл.
- С помощью многоканальной пипетки, передавать 100 мкл на лунку для 96V-нижняя плита, в результате чего 4000 до 8000 клеток на лунку. Спин 96-луночный планшет в свинг-из тарельчатой центрифуге при 400 мкг в течение 1 мин, чтобы собрать клетки в нижней части скважины, и передать культуру клеток инкубатора. ЭТ образуют одну ночь, как показано на рисунке 1.
3. Нейроэктодермы индукционные
- На следующий день (день 0), собирать ЭТ от 96V пластины под стерео микроскопа и передаче в небольшом объеме в 3,5 см бактериальной блюдо, содержащий 2 мл дифференциации среды. Аккуратно перемешивать блюдо в течение нескольких секунд, чтобы вымыть EB.
- Добавить 100 мкл дифференциации среды в скважине ультра-низким вложение U-дно 96-луночный планшет. В стереомикроскопа, передача ЭТ в небольших объемах из стиральной блюдо в 96U скважин (одна EB за намиLL). Место 96U пластины в культуре клеток инкубаторе в течение 4 дней, чтобы нейроэктодермы образования.
4. Нейрон Формирование
- На 4-й день, подготовить стиральную блюдо, как в шаге 3.1 и дополнительно заменить DMEM/F-12 в предварительно нагретой Matrigel покрытые 12-луночный планшет дифференциация среды (1 мл на лунку).
- Покрытие из ЭТ
- Сбор ЭТ от 96U плиты, мыть этим, как указано выше, и тщательно семя их по одной в лунки Matrigel покрытые 12-луночный планшет (около 8 ЭТ на лунку): EBS должны быть равномерно распределены в пределах скважины, чтобы спокойно следствием нейронов в течение ближайших дней (см. "5-й день" Изображение на рисунке 2).
- До передачи на 12-луночный планшет обратно в инкубатор, позволяют ЭТ в свободно закрепить около 10 минут при комнатной температуре. Затем осторожно переносить 12-луночный планшет для культуры клеток инкубатора. Нейроны будет расти из покрытием ЭТ в радиальном порядке в течение следующих 4 дней, а шоWn на рисунке 2 ("8-й день" изображение справа).
5. Нейрон формирование в виде монослоев
- В качестве альтернативы шаги пункт 4), на 4 день процедуры, собирать ЭТ в 3,5 см бактериальной блюдо, содержащий 2 мл дифференциации среднего, а затем передать ЭТ в небольшом объеме PBS-содержащих блюдо, а затем в другое блюдо, содержащее Accutase.
- Пусть переварить в одиночных камерах, центрифуги при 200 мкг в течение 2 мин, ресуспендируют в небольшом объеме дифференциации среднего и определить титр клетки помощью гемоцитометр. Отрегулируйте титры к 1-2х10 6 клеток на мл, используя дифференциацию среды (без Y-27632).
- Пластина клеток в предварительно нагретой Matrigel покрытые 12-луночный планшет (1 мл на лунку), и переход к культуре клеток инкубатора. Нейрон образование в виде монослоев наблюдается между днями 7 до 8 (рис. 3С). Следует отметить, однако, что этот монослой вариантПроцедура не полностью оптимизирована по отношению к выживаемости клеток и наиболее подходящим субстратом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нашем предыдущем докладе, в соответствии с многими другими, EBS от hPSCs может быть создан просто replating агрегатов на рутину расщепления hPSCs в низких вложений блюда 10. Это обычно приводит к широкому распространению в результате EB размеров (рис. 1С, вверху). Еще одна проблема, в результате этого в том, что ЭТ поддерживается во взвешенном состоянии, как правило, совокупности друг с другом, что приведет к еще более высокой неоднородностью EB размеров. Чтобы обойти эти проблемы, поэтому мы пытались создать ЭТ при посеве одного hPSCs в низких вложений скважин пластин multititre (рис. 1А). В результате не образуются EB и гибели клеток (рис. 1б, внизу справа). Применяя известную молекулу для выживания hPSCs, Y-27632, дали сходные результаты. Кроме того, применение поливинилового спирта (ПВС), которое ранее было показано для повышения EB формирования ЭСК 16, как правило, "собрать" hPSCs в нижней части 96VСкважинах, но не приводят к EB образования. Однако, если объединение Y-27632 с добавками ПВА, мы смогли легко генерировать ЭТ от одноклеточных суспензий ЭСК, под определенным химическим условиям (рис. 1б). Удобно, EB размеров в этом формате пластину multititre может быть жестко контролируется путем посева разного числа клеток на лунку, в отличие от использования обычных методов (рис. 1С, внизу).
При дальнейшей инкубации в 96V пластин, однако, ЭТ как правило, придерживаются в нижней части скважины. Таким образом, на следующий день после формирования EB, он должен был передать ЭТ до ультра-низких вложений 96U пластин (рис. 1А). Нейроэктодермы затем индуцируется в этом формате с помощью небольшой коктейль молекула, состоящая из PD0325901 (FGF / ERK ингибитор), SB431542 (TGFβ/SMAD2 ингибитор), и dorsomorphin (BMP/SMAD1 ингибитор), как описано 10. После формирования нейроэктодермыс помощью этой небольшой коктейль молекулы, ЭТ можно покрыть, чтобы дать начало нейронам на любом формате, при условии, что поверхность покрыта Matrigel; (рис. 2). Инициируя EB образование с разным количеством клеток (рис. 1С, внизу), мы обнаружили, что ЭТ, полученные от около 8000 клеток, как правило, дают лучшие нейронов потенциал дифференциации. Это характеризуется выраженным выросты нейронов с покрытием ЭТ, сокращение некротической центры EB после посева, и высокой экспрессией сенсорных и пан-нейронных маркеров, таких как BRN3A и β-III тубулина (рис. 2 и 3А, Б). В целом эффективность нейронных дифференциации по всей видимости, сравнимой с первоначальной процедуры (~ 70%) (рис. 3), которая была применима как к ЭСК и hiPSCs 10. До сих пор мы использовали две независимые линии ЭСК, HuES6 и NCl3 в порядке, многоямного, в то время как клеточная линия зависит от изменчивости в differentiatioп эффективность может вообще не быть исключено.
Несколько приложений HPSC полученные нейроны потребуют монослоев дифференцированных клеток, а не покрытая EB. Поэтому мы также исследовали, может ли предполагаемый клетки нейроэктодермальных сферы в день 4 протокола (рис. 2, в центре) может быть распадается на отдельные клетки использованием Accutase, чтобы затем высевают в виде монослоев. Действительно, при посеве из одной клетки день-4 клеток нейроэктодермальных, произнес нейрональной дифференцировки этих клеток replated получается при КПД около 60% (рис. 3).
Рисунок 1. EB порядок формирования.) Схема процедуры формирования EB. За день до начала differe ntiation (Д-1), суспензии ЭСК, содержащий несколько тысяч клеток в 100 мкл высевали в лунки 96V, с последующим центрифугированием. ЭТ формируется в течение ночи, затем переносят в ультра-низким 96U крепление скважины для дальнейшего лечения. Б) эффекты ПВА и Y-27632 на формирование EB. EB образование может наблюдаться только в среде, содержащей как ПВА и Y-27632 (см. стрелки) C) Top:. ЭТ формируется с помощью обычных средств, как правило, неоднородны по размеру. Внизу: ЭТ формируется с «спин EB" Техника изображенные на А. При использовании различного числа входных клеток, EB размеры могут быть жестко контролируется и были очень равномерно. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
35fig2highres.jpg "/>
Рисунок 2. Нейрон формирования блок-схемы. Один день до начала дифференциации (Д-1), EBS генерируются в 96V пластины, используя указанный средний формирования EB. При передаче ЭТ в 96U пластин, нейронные индукции инициируется использованием дифференциации среды. 4 дня спустя, EBS высевают в Matrigel покрытием скважин желаемого многоямного формате. Представитель морфологии показано для каждого шага. На рисунке справа показаны типичные выросты нейронов с покрытием EBS - высокая поверхностная плотность клеток на само право является частью покрытием центр EB, из которых нейроны имеют тенденцию к росту в радиальном порядке. Кроме того, на 4 день, EBS может быть отделена на отдельные клетки и высевают для терминальной дифференцировки в виде монослоев (текст и рисунок 3C для подробностей). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Характеристика нейронов.) В режиме реального времени RT-PCR характеристике день 8 объемных нейронов культур. Отметим, что в дифференцированных образцы нервного гребня и пан-нейронов маркерных генов были сильно активируемых по сравнению с недифференцированных клеток управления. Хотя образцы инициирован с 16000 клеток показали самые высокие уровни экспрессии нейронов (обратите внимание на логарифмический масштаб), EBS от 4000 до 8000 клеток оказалась наиболее полезной основанные на морфологических критериях. B) Большинство клеток, растущих из покрытием ЭТ нейроны окрашивания положительного для бета- III тубулина (красный) и сенсорных нейронов маркер BRN3A (зеленый). C) нейронов, образовавшихся после одного покрытия ячейку вместо обшивки EB. На 4-й день протокола (Рис. 2), Плавающий ЭТ были диссоциированных использованием Accutase и высевают, как отдельные клетки, чтобы затем смертельно дифференцироваться в виде монослоев. Как показано на рисунке слева, клетки с типичной морфологией нейронов, что окрашивались позитивно для бета-III тубулина было легко получить, в то время как выживаемость клеток оказалось несколько снизилась по сравнению с EB покрытия. Справа: Иммуноцитохимическая на основе количественного нейронов выход (п = 3 представителя разделов проанализированы + / - SD). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
| Название ген | Fwd последовательность праймера | Rev последовательность праймера |
| ACTB (уборка гена) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (уборка гена) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| Isl1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Таблица 2. Праймеры, используемые для RT-КПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство дифференциация протоколы с участием EB образования из hPSCs, в том числе наших ранее опубликованных процедуры 10, основаны на ручном или фермента при содействии уборки ЭСК в виде агрегатов, что неизбежно приводит к неоднородности в EB размеров. Этот факт приводит к изменчивости в дифференциации эффективность некоторых клеточных линий, тем самым делая систематического анализа трудно, особенно на средних масштабах пропускной способности. Кроме того, руководство рассечение является трудоемким что само по себе ставит под угрозу масштабируемость.
В отличие от метода, описанного здесь, основаны на EB образования из одной клетки, которая облегчает обработку клеток и уменьшает изменчивость между выборками. Важно отметить, что мы показываем, что общий потенциал дифференцировки в нейроны, похоже, не будут затронуты начала протокола со спином EB. Кроме того, сохранение отдельных ЭТ отделены друг от друга за счет использования 96-луночные подвески предотвращает тподол соединились друг с другом в подвеска - которая представляет еще один недостаток обычной процедуре 10. В результате, количество входных hPSCs, необходимые для начала данного эксперимента является низким, что примерно в одну лунку 6-луночный планшет с субконфлюентные колонии HPSC, как правило, достаточно для начала дифференциации в двух 96-луночных планшетах. Наконец, метод спин EB позволяет жесткий контроль над EB размеров. По нашим наблюдениям, уровень экспрессии маркеров нейронов имеют тенденцию к увеличению в некоторой степени с увеличением размеров покрытием ЭТ (рис. 3А). С другой стороны, слишком большой ЭТ склонны показывать некротических центрах после посева. Таким образом, в качестве компромисса, мы обнаружили, ЭТ от 4000 до 8000 клеток, чтобы быть подходящим диапазоном.
Благодаря своей высокой эффективности, простоте, скорости и рентабельности, мы ожидаем, что описанный способ быть полезной платформой для функциональных исследований, болезни, требующие моделирования человека сensory нейронов, или средняя пропускная способность клеточных фармакологических тестов требует нейроны любого типа. Что касается последнего применения, совместимость с автоматизированного анализа, таких как высокое содержание изображений хотелось бы. Это, однако, может быть скомпрометирована тем, что только перерастает нейронов на периферии покрытием ЭТ могут быть проанализированы. Чтобы обойти это препятствие, мы также попытались сформировать монослоев нейронов в результате диссоциации ЭТ на 4 день протоколов и покрытие из отдельных клеток. Действительно, данные на рисунке 3C показывают, что нейроны образуются при разумной эффективностью около 60%. Однако, мы наблюдали снижение выживаемости клеток в этих условиях, предполагая, что это изменение протокол может быть дополнительно изучены и оптимизированы, например, путем использования различных подложке вложений. (Добавление Y-27632 от обшивки из день-4 клеток в шаге 5,2 сделала способствовать выживаемости клеток после посева, но она также появилась вмешиваться Wго последующей дифференцировке нейронов и поэтому должна быть опущена). Кроме того, он также будет интересно исследовать, могут ли другие типы нейронов может быть сгенерирован с этой платформой, варьируя состав среды на втором этапе протокола. Кроме того, в отношении передачи ЭТ от 96V 96U в форме скважин на день 0, было бы желательно, чтобы разработать процедуры, основанные на многоканальной пипеткой, чтобы в конечном итоге достичь высокой пропускной способности совместимость описанным способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Общества Макса Планка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
