Summary
Les protocoles de différenciation neuronale des cellules souches humaines pluripotentes (hPSCs) sont souvent beaucoup de temps et nécessitera d'importantes compétences de culture cellulaire. Ici, nous avons adapté une procédure de différenciation petite molécule à base d'un format de plaque multititre, permettant la génération simple, rapide et efficace des neurones humains d'une manière contrôlée.
Abstract
Protocoles existants pour la génération de neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont souvent fastidieux en ce que ce sont des procédures en plusieurs étapes impliquant l'isolement et l'expansion de cellules précurseurs neurales, avant la différenciation terminale. Par rapport à ces approches consommatrices de temps, nous avons récemment découvert que l'inhibition combinée de trois voies de signalisation, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 et FGF / ERK, favorise l'induction rapide de neuroectoderme de hPSCs, suivie par la différenciation en neurones fonctionnels immédiate. Ici, nous avons adapté notre méthode à un format multititre nouvelle plaque, afin de renforcer sa reproductibilité et de la rendre compatible avec la mi-débit des applications. Il comprend quatre jours de formation neuroectoderme dans les sphères flottantes (corps embryoïdes), suivis par quatre autres jours de différenciation en neurones dans des conditions d'adhérence. La plupart des cellules obtenues avec ce protocole semble être neurones sensoriels bipolaires. En outre,la procédure est très efficace, ne nécessite pas de compétences particulières experts, et est basé sur un simple support chimiquement défini avec rapport coût-efficacité des petites molécules. Grâce à ces caractéristiques, la procédure peut servir de plate-forme utile pour exploration fonctionnelle continue ainsi que pour le criblage cellulaire s'approche nécessitant des neurones sensoriels de l'homme ou des neurones de n'importe quel type.
Introduction
hPSCs, comprenant l'embryon issu cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs), sont pluripotentes sens qu'ils peuvent donner lieu à diverses lignées cellulaires in vitro 1-2. De nombreux types de cellules différenciées ont été dérivées de CSEh à ce jour, en soutenant l'idée que ces cellules présentent des outils précieux pour la recherche scientifique et des approches de dépistage basés sur les cellules, et sont prometteuses pour des traitements à base de cellules.
Protocoles de différenciation neuronale des CSEh sont généralement complexes et de longue haleine car ils sont souvent basées sur l'ensemble induisant sort premier de neurones, suivie de l'isolement manuel des progéniteurs neuronaux, et la différenciation terminale ultérieure dans un type de neurone d'intérêt donné 3-6. À certains égards, cette complexité n'est pas surprenant et inévitable, étant donné qu'un tel état-of-the-art des protocoles de différenciation dirigés ont tendance à imiter les étapes de développement du jeune homme, which est en soi extrêmement complexe. D'un autre côté, il peut aussi en partie le reflet de notre manque de compréhension des processus moléculaires sous-jacents, résultant dans des protocoles de différenciation qui sont encore loin d'être pleinement optimisée.
En ce qui concerne la conversion de hPSCs indifférenciées en neuroectoderme, Pera et al. constaté que la suppression de BMP / SMAD1/5/8 signalisation améliore l'induction neurale de hESC 7. De plus, l'inactivation de SMAD2 / 3 de signalisation a été montré pour favoriser 8 Formation neuroectoderme. Par conséquent, l'inactivation combinée de ces deux voies a tendance à conduire à l'induction neurale plus efficace des hPSCs 4,9. Plus récemment, nous avons montré que la voie de signalisation troisième FGF / ERK, sert de répresseur forte des premières étapes de l'engagement neuroectodermique dans les CSEh. En revanche, la répression simultanée de ces trois voies mènent à la quasi-homogène de conversion des CSEh dans neuroectoderme avecen seulement quatre jours 10. Par la suite, la différenciation terminale très efficace en neurones fonctionnels a été observée dans les huit jours. Les neurones obtenus sont susceptibles d'être neurones sensoriels du système nerveux périphérique, ce qui peut en partie expliquer leur calcul rapide 10. Les défauts de l'entretien neurone sensoriel est considéré une des causes de certaines maladies humaines telles que la dysautonomie familiale 11. Pour modéliser ces maladies sur la base de la technologie hiPSC 12, pour la caractérisation fonctionnelle supplémentaire, ainsi que des fins appliquées ne nécessitant pas un type particulier de neurones, cette procédure différenciation peut présenter une base utile.
Cependant, la stratégie de différenciation nous avions utilisé la formation impliqués des corps embryonnaires (EB) à partir de touffes de 10 colonies de CSEh, et cela s'est traduit par un bon degré d'hétérogénéité concernant la taille des EB, et semblait aussi compromettre l'efficacité de formation des neurones dans certaines CElignes ll. En outre, en raison de l'hétérogénéité des tailles EB, la capacité de tester systématiquement les effets des facteurs de croissance ou de petites molécules pendant et après la formation des neurones semblent être quelque peu confus.
Dans ce rapport, nous avons adapté notre procédure précédente pour un support débit compatible, forcé d'agrégation basée technique pour générer EB dans un environnement hautement taille manière contrôlée, comme le montre également dans d'autres contextes 13. Par la suite, l'EB généré en forme de V des puits de plaques 96 puits ont été transférés à U ultra-faible attachement plaques à 96 puits, pour initier la formation neuroectoderme en suspension. Quatre jours plus tard, l'EB pourraient être étalées donnant naissance à des neurones définitivement différenciées à haute efficacité et l'homogénéité. Sinon, le jour EB-4 ont été dissociées en cellules individuelles et étalées en tant que telle, qui a abouti à faible densité monocouches de neurones humains. Des résultats cohérents ont été obtenus jusqu'à présent avec deux indépendamment delignées de CSEh rived, HuES6 et NCl3.
Comme condition préalable, la formation EB succès était strictement dépendante de l'utilisation d'un polymère synthétique, l'alcool polyvinylique (PVA), avec inhibiteur de ROCK Y-27632 connue pour favoriser la survie de 13-14 CSEh. En conséquence, l'homogénéité de l'EB formé en 96-V-plaques a été considérablement améliorée par rapport à la formation d'EB en tant que cultures de masse basés sur des techniques de fractionnement aléatoires. Ce système offre ainsi une plate-forme nettement améliorée pour la formation neuroectoderme en culture en suspension, suivie de la formation des neurones hautement contrôlé dans des conditions d'adhérence.
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Protocol
1. Préparation de Matrigel recouvertes de plaques et médias
- Préparation de Matrigel enduit de Matrigel plaques a été trouvé pour être un substrat préféré pour la fixation de la différenciation EB et favorise également l'excroissance efficace des neurones à partir de celles-ci 10.
- Décongeler 10 ml de nuit sur la glace Matrigel.
- Le lendemain, diluer le Matrigel comme de la gelée avec deux volumes de glace-froid DMEM/F-12 et préparer des aliquotes de 1 ml à 15 ml prérefroidi tubes coniques qui peuvent être congelés à -20 ° C.
- Décider sur un format de plaque pour la différenciation neuronale. Par exemple, comme point de départ, nous vous recommandons d'effectuer une première série de différenciation dans un format de 12 puits. Pré-cool quatre plaques de 12 puits à 4 ° C. Dissoudre une aliquote de Matrigel congelés en ajoutant 9 ml de pré-réfrigérés DMEM/F-12 suivis par pipetage de haut en bas jusqu'à ce que tout le Matrigel prédilué a dégelé et dissous.
- Puis, Transférer le contenu dans un nouveau tube de 50 ml contenant 15 ml de DMEM/F-12 sur la glace (dilution finale Matrigel: 1:75). Ensuite, ajoutez 0,5 ml de Matrigel dilué dans chaque puits de la pré-refroidis plaques de 12 puits. Envelopper les plaques avec du Parafilm et laisser reposer une nuit à TA.
- Le lendemain, le transfert des plaques à 4 ° C. Plaques revêtues peuvent être stockés pendant plusieurs semaines avant de l'utiliser.
- Médias
Moyennes formation EB (~ 15 ml nécessaire pour effectuer une différenciation dans une plaque de 96 puits - voir le tableau 1 et le schéma de la figure 2):
DMEM/F-12 avec 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
20 ng / ml de FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln
Milieu de différenciation (~ 30 ml nécessaire pour effectuer une différenciation dans une plaque de 96 puits, suivie de la formation des neurones dans un enduit de Matrigel de 12 puits de plaque, voir le tableau 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% de BSA
0,5 uM PD0325901
15 SB431542 uM
0,5 uM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Formation EB forcé
- Cultivez hPSCs sous vos préférés alimentation sans conditions. Nous utilisons MEF milieu conditionné sur Matrigel recouvertes de plaques de 6 puits 15. Cependant, d'autres systèmes de culture tels que maison ou commerciale milieux définis devrait aussi fonctionner. Au moment de commencer un essai de différenciation, hPSCs doit être sous-confluentes et en pleine croissance.
- Eliminer mécaniquement spontanément colonies différenciées à l'aide d'une pipette stérile en plastique sous un microscope stéréo.
- Laver autres colonies indifférenciées en utilisant du PBS, et digérer à des cellules uniques en utilisant Accutase contenant 1X Y-27632. Sédimenter les cellules individuelles par centrifugation à 200 xg pendant 2 min, remettre en suspension dans un petit volume de milieu de formation EB et déterminer titre cellule en utilisant une hématocytomètre.
- Ajouter une fraction aliquote de cellules dele moyen EB restante formation d'aboutir à un titre compris entre 40.000 et 80.000 cellules par ml.
- En utilisant une pipette multicanaux, transférer 100 ul par puits dans une plaque 96V-bas, entraînant 4000 à 8000 cellules par puits. De spin 96-puits dans une centrifugeuse plaque plaque pivotant à 400 g pendant 1 min à prélever des cellules au fond du puits, et transférer à incubateur de culture cellulaire. EBS former une nuit, comme représenté sur la figure 1.
3. Induction neuroectoderme
- Le lendemain (jour 0), la collecte de la plaque EB 96V sous un microscope stéréo et le transfert dans un petit volume dans un plat 3,5 cm bactérienne contenant 2 ml de milieu de différenciation. Agiter doucement le plat pendant quelques secondes pour laver l'EBS.
- Ajouter 100 ul de milieu de différenciation par puits d'un ultra-faible attachement U-96 puits à fond plat. Sous un stéréomicroscope, le transfert EB dans de petits volumes de la vaisselle dans le 96U-puits (un EB par nousll). Placez la plaque 96U en incubateur de culture cellulaire pendant 4 jours afin de permettre la formation neuroectoderme.
4. Formation neurone
- Au jour 4, préparer un plat à laver comme à l'étape 3.1 et plus remplacer DMEM/F-12 dans un préchauffé Matrigel revêtu de plaque de 12 puits par un milieu de différenciation (1 ml par puits).
- Placage de EB
- Recueillir EB de la plaque 96U, lavez-les de graines comme ci-dessus, et soigneusement un par un dans les puits de la Matrigel enduit la plaque de 12 puits (environ 8 EB par puits): EB doit être également répartie dans les puits pour permettre excroissance non perturbé de neurones au cours des prochains jours (voir "jour 5" image de la figure 2).
- Avant le transfert de la plaque arrière de 12 puits dans l'incubateur, permettent EB à fixer sans serrer pour environ 10 min à température ambiante. Ensuite, transférez à 12 puits de plaque de culture cellulaire incubateur. Les neurones se développent à partir de l'EB plaqué de manière radiale dans les 4 prochains jours, comme shosentée en figure 2 («jour 8" image de droite).
5. Formation neurone comme monocouches
- Comme une alternative à la procédure du point 4), au jour 4 de la procédure, de recueillir EBS dans un plat 3,5 cm bactérienne contenant 2 ml de milieu de différenciation, puis de transférer EB dans un petit volume d'un plat contenant du PBS, puis dans un autre plat contenant Accutase.
- Laissez digérer à des cellules uniques, centrifuger à 200 xg pendant 2 min, remettre en suspension dans un petit volume de milieu de différenciation et de déterminer titre cellule en utilisant une hématocytomètre. Réglez titre de 1-2x10 6 cellules par ml en utilisant un milieu de différenciation (sans Y-27632).
- Cellules de la plaque out en préchauffé Matrigel enduit de 12 puits plaque (1 ml par puits), et le transfert de culture cellulaire incubateur. Formation neurone sous forme de monocouches a été observée entre les jours 7 à 8 (figure 3C). Il convient de noter, toutefois, que cette variante monocouche dela procédure n'est pas optimisée en ce qui concerne la survie des cellules et le substrat le plus approprié.
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Representative Results
Dans notre précédent rapport, en ligne avec beaucoup d'autres, EB à partir hPSCs pourrait être généré simplement en réensemencement des agrégats sur le fractionnement systématique de hPSCs en bas de fixation plats 10. Cela se traduit généralement par une large distribution de tailles EB résultant (figure 1C, en haut). Un autre problème résultant de cela est que EB maintenues en suspension ont tendance à s'agréger les unes aux autres, ce qui conduit à une hétérogénéité encore plus de formats EB. Pour contourner ces problèmes, nous avons donc tenté de générer EB en plaquant hPSCs simples en faible attachement des puits de plaques multititre (figure 1A). Il en est résulté aucune formation EB et la mort cellulaire (figure 1B, en bas à droite). L'application d'une molécule de survie connu pour hPSCs, Y-27632, a donné des résultats similaires. De même, l'application de l'alcool polyvinylique (PVA) qui a déjà été montré pour améliorer la formation des CSEh EB 16, ont eu tendance à «rassembler» les hPSCs au bas de l'96VDes puits, mais n'a pas conduit à la formation de EB. Toutefois, si la combinaison Y-27632 avec la supplémentation en PVA, nous avons pu facilement générer EB à partir de suspensions unicellulaires de CSEh, dans des conditions de constitution chimique définie (figure 1B). Idéalement, la taille de la CE à ce format de plaque multititre pourrait être étroitement contrôlée par ensemencement d'un nombre différents de cellules par puits, contrairement à l'aide de techniques classiques (figure 1C, en bas).
Après une incubation supplémentaire dans les plaques 96V, cependant, le EB tendance à coller au fond des puits. Par conséquent, le lendemain de formation EB, il a été nécessaire de transférer l'EBS pour plaques de fixation ultra-faible 96U (figure 1A). Neuroectoderme est induite dans ce format en utilisant un cocktail petite molécule comprenant PD0325901 (FGF / ERK inhibiteur), SB431542 (TGFβ/SMAD2 inhibiteur), et dorsomorphin (BMP/SMAD1 inhibiteur), telle que décrite 10. Après la formation neuroectodermeen utilisant ces cocktail petite molécule, l'EBS peut être étalées pour donner naissance à des neurones de n'importe quel format, à condition que les surfaces sont revêtues d'Matrigel, (figure 2). En initiant la formation EB avec différents nombres de cellules (figure 1C, en bas), nous avons constaté que EB a généré d'environ 8000 cellules ont tendance à donner la meilleure capacité de différenciation neuronale. Elle est caractérisée par des excroissances prononcées neuronales du plaqué EB, EB réduite centres nécrotiques après l'étalement, et une forte expression de marqueurs sensoriels et pan-neuronale tels que BRN3A et β-tubuline III (figures 2 et 3A, B). Les rendements globaux différenciation neuronale semble être comparable à la procédure initiale (~ 70%) (figure 3), qui était applicable à la fois aux CSEh et hiPSCs 10. Nous avons jusqu'ici utilisé deux lignées de CSEh indépendants, HuES6 et NCl3, dans la procédure multi-puits, alors que la lignée cellulaire dépendante de la variabilité dans differentiation l'efficacité ne peuvent généralement pas être exclue.
Plusieurs applications de HPSC dérivés de neurones, il faudra des monocouches de cellules différenciées au lieu de plaqué EB. Nous avons donc également cherché à savoir si les sphères putatifs de cellules neuro-ectodermiques au jour 4 du protocole (Figure 2, milieu) peut être dissociée en cellules individuelles en utilisant Accutase; ensuite être étalées sous forme de monocouches. En effet, lors étalement des cellules individuelles de cellules neuro-ectodermiques jour 4, prononcé la différenciation neuronale de ces cellules réétalées est obtenue à l'efficacité d'environ 60% (figure 3C).
Figure 1. Procédure de formation EB. Un schéma) de la procédure de formation EB. Un jour avant le début du différe ntiation (d-1), une suspension de CSEh contenant plusieurs milliers de cellules par 100 pi est ensemencées dans des puits 96V, suivie d'une centrifugation. EB formé pendant la nuit sont ensuite transférées dans des puits de fixation ultra-faible 96U pour un traitement ultérieur. B) Tester les effets de la PVA et Y-27632 sur la formation EB. Formation EB n'a pu être observée dans un milieu contenant à la fois PVA et Y-27632 (voir la tête de flèche) C) En haut:. EB formé par des moyens conventionnels sont généralement hétérogènes en taille. En bas: EB formé avec «spin EB" technique décrite dans A. En utilisant différents nombres de cellules d'entrée, tailles EB peut être étroitement contrôlée et étaient très uniforme. Cliquez ici pour agrandir la figure .
35fig2highres.jpg "/>
Figure 2. Tableau neurone d'écoulement de formation. Un jour avant l'initiation de la différenciation (d-1), EB sont générés en plaques 96V en utilisant le milieu EB indiqué formation. Lors du transfert de l'EB en plaques 96U, l'induction neurale est initiée en utilisant un milieu de différenciation. 4 jours plus tard, EB sont étalées dans le Matrigel puits revêtus d'un format multipuits désiré. Morphologies représentatifs sont présentés pour chaque étape. L'image de droite montre typiques des excroissances neuronales du plaqué EB - la zone haute densité cellulaire sur l'extrême droite fait partie du centre EB plaqué à partir de laquelle les neurones ont tendance à croître de manière radiale. Sinon, le jour 4, EB peut être dissociée en cellules individuelles et étalées pour la différenciation terminale sous forme de monocouches (texte et la figure 3C pour plus de détails). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Caractérisation des neurones. A) en temps réel RT-PCR caractérisation de jour 8 en vrac cultures neuronales. Noter que dans les échantillons de crête neurale dissociés et les gènes marqueurs pan-neuronales sont fortement régulée à la hausse par rapport aux cellules non différenciées de commande. Bien que les échantillons initiées avec 16.000 cellules ont montré les plus hauts niveaux d'expression neuronaux (noter l'échelle logarithmique), EBS entre 4.000 à 8.000 cellules révélée très utile basée sur des critères morphologiques. B) La plupart des cellules en croissance à partir du plaqué EB sont des neurones coloration positive pour le bêta- tubuline III (rouge) et le neurone sensoriel marqueur BRN3A (vert). C) Les neurones formés après le placage seule cellule au lieu de plaquer EB. Au jour 4, du protocole (Figure 2), Flottante, EB ont été dissociées en utilisant Accutase et ensemencées comme des cellules individuelles pour ensuite différenciation terminale sous forme de monocouches. Comme indiqué sur la gauche, les cellules ayant une morphologie neuronale typique colorées positif pour la bêta-tubuline III ont été facilement obtenue, alors que la survie des cellules semblaient être quelque peu diminué par rapport à EB placage. A droite: Immunocytochimie basée sur la quantification du rendement neuronale (n = 3 sections représentatives analysées + / - écart-type). Cliquez ici pour agrandir la figure .
| Nom de gène | Séquence de l'amorce Fwd | Séquence de l'amorce Rev |
| ACTB (gène de ménage) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (gène de ménage) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Primaires Tableau 2. Utilisés pour la RT-qPCR.
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Discussion
La plupart des protocoles de différenciation impliquant la formation EB à partir hPSCs, y compris notre procédure déjà publié 10, sont basées sur manuel ou assisté par une enzyme de récolte des CSEh sous forme d'agrégats, ce qui conduit inévitablement à l'hétérogénéité des tailles EB. Ce fait conduit à la variabilité de l'efficacité différentiation avec certaines lignées cellulaires, ce qui rend difficile l'analyse systématique, en particulier à l'échelle de débit moyen. En outre, la dissection manuelle est de main-d'œuvre qui, par elle-même compromet l'évolutivité.
En revanche, la méthode décrite ici est basée sur la formation EB à partir de cellules individuelles, ce qui facilite la manipulation des cellules et de la variabilité entre les échantillons réduit. Surtout, nous montrent que la capacité globale de différenciation en neurones ne semble pas être affectée par lancer le protocole de spin EB. De plus, en gardant l'individu EB séparées l'une de l'autre au moyen de l'utilisation de plaques de suspension 96-t empêche ainsiourlet de l'agrégation uns avec les autres en suspension - qui présente encore un autre inconvénient de la procédure classique 10. En conséquence, la quantité de hPSCs d'entrée nécessaires pour initier une expérience donnée est faible en ce qu 'environ un puits de plaque 6-puits avec des colonies HPSC subconfluentes est généralement suffisante pour amorcer la différenciation en deux plaques 96-puits. Enfin, la technique EB rotation permet un contrôle serré des tailles EB. Selon nos observations, les niveaux d'expression de marqueurs neuronaux ont tendance à augmenter dans une certaine mesure avec des tailles croissantes de plaqué EB (figure 3A). D'autre part, une trop grande EB ont tendance à afficher des centres nécrotiques après le placage. Par conséquent, à titre de compromis, nous avons trouvé EB de 4000 à 8000 cellules à un intervalle approprié.
En raison de sa grande efficacité, la simplicité, la rapidité et la rentabilité, nous nous attendons à la méthode décrite à être une plate-forme utile pour les études fonctionnelles, de maladies nécessitant la modélisation humaine sneurones ensory ou moyen débit basés sur les cellules essais pharmacologiques qui nécessitent des neurones de tout type. En ce qui concerne cette dernière application, la compatibilité avec l'analyse automatisée tels que la haute teneur en imagerie serait souhaitable. Ceci, cependant, peut être compromise par le fait que seuls les neurones l'étroit dans la périphérie de la plaqués EB ont pu être analysés. Pour contourner cet obstacle, nous avons également tenté de produire des monocouches de neurones en dissociant EB au jour 4 du protocole et étalement des cellules individuelles. En effet, les données de la figure 3C suggèrent que les neurones formés à une efficacité raisonnable d'environ 60%. Cependant, nous avons observé une diminution de la survie cellulaire dans ces conditions, ce qui suggère que cette variante du protocole peut être exploré et optimisée, par exemple en utilisant un substrat attachement différent. (L'ajout de Y-27632 étalement sur les cellules jours-4 dans l'étape 5.2 a favoriser la survie cellulaire après placage, mais il est également apparu à interférer avecvec la différenciation neuronale ultérieure et doit donc être omis.) En outre, il sera également intéressant d'examiner si d'autres types de neurones pourraient être générés avec cette plate-forme, en faisant varier la composition du milieu de la deuxième phase du protocole. Par ailleurs, en ce qui concerne le transfert de l'EB à partir de 96V en 96U-forme de puits au jour 0, il serait souhaitable de mettre au point une procédure basée sur pipetage multicanaux, pour finalement atteindre à haut débit compatibilité de la méthode décrite.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Société Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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