Summary
Protokoller for neuronal differentiering af pluripotente humane stamceller (hPSCs) er ofte tidskrævende og kræver væsentlige cellekultur færdigheder. Her har vi tilpasset et lille molekyle-differentiering procedure til en multititre pladeformat, hvilket tillader enkel, hurtig og effektiv produktion af humane neuroner på en kontrolleret måde.
Abstract
Eksisterende protokoller til generering af neuroner fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) er ofte kedelig derved, at de er flertrinsprocesser, der involverer isolering og ekspansion af neurale precursorceller, før terminal differentiering. I forhold til disse tidskrævende metoder, har vi for nylig fundet, at kombineret hæmning af tre signalveje, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 og FGF / ERK, fremmer hurtig induktion af neuroectoderm fra hPSCs, efterfulgt af øjeblikkelig differentiering i funktionelle neuroner. Her har vi tilpasset vores procedure en hidtil ukendt multititre pladeformat, for yderligere at øge dens reproducerbarhed og for at gøre den forenelig med mid-throughput anvendelser. Det omfatter fire dages neuroectoderm dannelse i flydende kugler (embryoid organer), efterfulgt af yderligere fire dages differentiering i neuroner under adhærerende betingelser. De fleste celler opnået med denne protokol synes at være bipolære sensoriske neuroner. Endvidereproceduren er meget effektiv, kræver ikke særlige ekspert færdigheder, og er baseret på en simpel kemisk defineret medium med omkostningseffektive små molekyler. På grund af disse funktioner, kan proceduren tjene som en nyttig platform for yderligere funktionel undersøgelse samt for cellebaseret screening metoder, som kræver menneskelige sensoriske neuroner eller neuroner af enhver type.
Introduction
hPSCs omfattende embryo-afledte humane embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (hiPSCs), er pluripotente forstand, at de kan give anledning til forskellige cellelinier in vitro 1-2. Talrige differentierede celletyper er afledt af hESCs til dato, støtter tanken om, at disse celler udgør værdifulde værktøjer til videnskabelig forskning og cellebaserede screeningsmetoder, og lovende for celle-baserede lægemidler.
Neuronal differentiering protokoller for hESCs er sædvanligvis komplicerede og tidskrævende, da de ofte er baseret på første inducerende samlede neural skæbne, efterfulgt af manuel isolering af neurale progenitorceller og efterfølgende terminal differentiering til en bestemt neuron type interesse 3-6. I nogle henseende er denne kompleksitet ikke overraskende og uundgåelig i betragtning, at en sådan state-of-the-art rettet differentiering protokoller tendens til trinvis efterligner tidlig menneskelig udvikling, which er i sig selv meget kompleks. På den anden side kan det til dels også afspejler vores manglende forståelse af de underliggende molekylære processer, hvilket resulterer i differentiering protokoller, der stadig langt fra at være fuldt optimeret.
Med hensyn til omdannelse af udifferentierede hPSCs i neuroectoderm, Pera et al. fundet, at suppression af BMP / SMAD1/5/8 signalering øger neural induktion af hESCs 7. Desuden har inaktivering af Smad2 / 3 signaleringen vist sig at fremme neuroectoderm dannelse 8. Følgelig kombineret inaktivering af disse to veje har tendens til at føre til mere effektiv neural induktion af hPSCs 4,9. Mere nyligt har vi vist, at en tredje signalvej, FGF / ERK, fungerer som en stærk repressor af de tidligste trin af neuroectodermal engagement i hESCs. Omvendt samtidig undertrykkelse af alle disse tre veje fører til nær-homogen konvertering af hESCs til neuroectoderm medpå bare fire dage 10. Efterfølgende blev højeffektive terminal differentiering i funktionelle neuroner observeret inden otte dage. De opnåede neuroner sandsynligvis ville være sensoriske neuroner i det perifere nervesystem, som delvist kan forklare deres hurtige afledning 10. Fejl i sensorisk neuron vedligeholdelse anses en årsag til visse menneskelige lidelser, såsom familiær dysautonomi 11. Til modellering af sådanne sygdomme baseret på hiPSC teknologi 12 for yderligere funktionel karakterisering, samt for anvendt formål, der ikke kræver nogen særlig type af neuroner, kan denne differentiering procedure fremlægge et brugbart grundlag.
Men differentiering strategi, vi oprindelig ansat involveret dannelse af embryonale organer (EBS) fra klumper af hESC kolonier 10, og det resulterede i en ganske grad af heterogenitet med hensyn til EB størrelser, og syntes også at kompromittere neuron formation effektivitet i nogle cell linjer. Som følge af heterogeniteten i EB størrelser, evnen til systematisk at teste virkningerne af yderligere vækstfaktorer eller små molekyler under og efter neuron dannelse syntes at være noget forvirret.
I denne rapport, tilpassede vi vores tidligere procedure til et medium throughput-kompatibel, tvungen aggregation-baseret teknik til generering EB'er i en meget størrelse-kontrolleret måde, som også er vist i andre sammenhænge 13. Efterfølgende EBS genereret i V-formede brønde i plader med 96 brønde blev overført til U-formet ultra-low fastgørelse 96-brøndsplader, at indlede neuroectoderm dannelse i suspension. Fire dage senere kunne EB'er blive udpladet give anledning til terminalt differentierede neuroner ved høj effektivitet og homogenitet. Alternativt var dag-4 EB'er dissocieret til enkelte celler og udpladet som sådan, hvilket resulterede i lav massefylde monolag af humane neuroner. Sammenhængende resultater blev hidtil opnået med to uafhængigt deudledt hESC linjer, HuES6 og NCL3.
Som en forudsætning, var vellykket EB formation strengt afhængig af anvendelsen af en syntetisk polymer, polyvinylalkohol (PVA), sammen med ROCK inhibitor Y-27632 kendt for at fremme hESC overlevelse 13-14. Som følge heraf dannes homogeniteten af EB'er i 96-V-plader blev i alt væsentligt forbedret i forhold til dannelsen af EB'er som massekulturer baseret på tilfældige opdeling teknikker. Dette system tilvejebringer således en væsentlig forbedret platform for neuroectoderm dannelse i suspensionskultur efterfulgt af nøje kontrolleret neuron formation under adhærerende betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Matrigelcoatede Plader og medier
- Fremstilling af Matrigel-overtrukne plader Matrigel har vist sig at være et foretrukket substrat for fastgørelse af differentiering EB'er, og fremmer også en effektiv udvækst af neuroner fra disse 10.
- Thaw 10 ml Matrigel natten over på is.
- Næste dag, fortyndes den geléagtige Matrigel med to volumener iskold DMEM/F-12 og forberede alikvoter af 1 ml i forafkølet 15 ml koniske rør, der kan opbevares frosne ved -20 ° C.
- Beslut på en tallerken format for neuronal differentiering. For eksempel, som udgangspunkt anbefales at foretage en første runde af differentiering i en 12-brønds format. Præ-fede fire 12-brønds plader ved 4 ° C. Opløse en alikvot af frosne Matrigel ved tilsætning af 9 ml nedkølede DMEM/F-12 efterfulgt af pipettering op og ned indtil al fortyndet Matrigel smeltet og opløst.
- DerefterOverføres indholdet i et nyt 50 ml glas indeholdende 15 ml DMEM/F-12 på is (endelig Matrigel fortynding: 1:75). Derefter tilsættes 0,5 ml fortyndet Matrigel til hver brønd i forvejen afkølet 12-brønds plader. Wrap pladerne med parafilm og lad stå ved stuetemperatur natten over.
- Næste dag, overføre pladerne til 4 ° C. Coatede plader kan opbevares i flere uger før brug.
- Medier
EB dannelse medium (~ 15 ml nødvendig for at udføre differentiering i en 96-brønds plade - se tabel 1 og ordningen i figur 2):
DMEM/F-12 med 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln
Differentiation medium (~ 30 ml nødvendig for at udføre differentiering i en 96-brøndsplade, efterfulgt af neuron dannelse i en Matrigel-coated 12-brønds plade, se tabel 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% BSA
0,5 uM PD0325901
15 um SB431542
0,5 pM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Tvungen EB Formation
- Dyrk hPSCs under dine foretrukne feeder-frie betingelser. Vi bruger MEF-konditioneret medium på Matrigelcoatede 6-brønds plader 15. Dog bør andre dyrkningssystemer, såsom hjemmelavede eller kommercielle definerede medier også arbejde. På tidspunktet for start af differentiering eksperiment skulle hPSCs være sub-sammenflydende og aktiv vækst.
- Mekanisk fjerne spontant differentierede kolonier under anvendelse af en steril plast-pipettespids under et stereomikroskop.
- Vask resterende udifferentierede kolonier ved hjælp af PBS, og fordøje til enkelte celler ved hjælp Accutase indeholdende 1X Y-27.632. Pellet enkelt cellerne ved centrifugering ved 200 x g i 2 minutter, resuspenderes i et lille volumen EB dannelse medium og bestemme celle titer ved anvendelse af en hematocytometer.
- Tilsættes en aliquot af celler tilDen tilbageværende EB dannelse medium at resultere i en titer mellem 40.000 og 80.000 celler pr.
- Hjælp af en multikanalpipette, 100 pi per brønd overføres til en 96 V-bundet plade, hvilket resulterer i 4.000 til 8.000 celler pr. Spin 96 brønde i et swing-out plade centrifuge ved 400 x g i 1 min for at opsamle celler i bunden af brøndene, og overførsel til cellekultur inkubator. EB'er vil danne natten over, som vist i figur 1..
3. Neuroectoderm Induktion
- Næste dag (dag 0), indsamle EB'er fra 96V plade under et stereomikroskop og overførsel i en lille mængde ind i en 3,5 cm bakteriel skål indeholdende 2 ml differentiation medium. Ryst forsigtigt skålen i flere sekunder for at vaske EB'er.
- Tilsæt 100 pi differentiering medium per brønd af en ultralav-binding U-bundede 96-brønds plade. Under et stereomikroskop, transfer EB'er i små mængder fra vask skålen ind i 96U-brønde (en EB pr vill). Sted 96U plade i cellekultur inkubator i 4 dage for at tillade neuroectoderm dannelse.
4. Neuron Formation
- På dag 4, fremstilling af en vaske skålen som i trin 3.1 og yderligere erstatte DMEM/F-12 i et i forvejen opvarmet Matrigel-coated 12-brønds plade ved differentiation medium (1 ml per well).
- Plating af EB'er
- Collect EB'er fra 96U plade, vaskes disse som ovenfor, og omhyggeligt frø dem en efter en i brønde på Matrigelcoatede plade med 12 brønde (ca. 8 EB'er per well): EB'er er ligeligt fordelt i brøndene for at muliggøre uforstyrret udvækst af neuroner i løbet af de kommende dage (se "dag 5" billede i figur 2).
- Før overførsel af den 12-brønds plade tilbage i inkubatoren, tillader EB'er til løst vedhæfte til omkring 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter forsigtigt overføre plade med 12 brønde til cellekultur inkubator. Neuroner vil vokse ud fra det pletterede EB'er i en radial måde i de næste 4 dage, som shown i figur 2 ("dag 8" billede til højre).
5. Neuron Dannelse som monolag
- Som et alternativ til trinnene punkt 4), på 4. dag af proceduren, indsamle EB'er ind i en 3,5 cm bakteriel skål indeholdende 2 ml differentiering medium, og overfør derefter EB'er i en lille mængde til en PBS-holdig skål, og derefter ind i en anden skål indeholdende Accutase.
- Lad fordøje til enkelte celler, centrifugeres ved 200 x g i 2 minutter, resuspendere i et lille volumen af differentiering medium og bestemme celle-titer ved hjælp af en hematocytometer. Juster titer til 1-2x10 6 celler per ml under anvendelse differentiation medium (uden Y-27632).
- Plade celler ud i foropvarmede Matrigel-coated 12-brønds plade (1 ml per brønd), og overførsel til cellekultur inkubator. Neuron dannelse som monolag blev observeret mellem dag 7-8 (figur 3C). Det skal dog bemærkes, at denne monolag variant affremgangsmåden er ikke fuldt optimeret med hensyn til celleoverlevelse og mest passende substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores tidligere rapport, på linje med mange andre kunne EB'er fra hPSCs genereres ved blot at genudpladning aggregater upon rutinemæssig opdeling af hPSCs i lav-vedhæftede retter 10. Dette resulterer som regel i en bred fordeling af resulterende EB størrelser (figur 1C, øverst). Et andet problem er resultatet af dette er, at EB'er holdes i suspension har tendens til at aggregere med hinanden, hvilket fører til en endnu større heterogenitet EB størrelser. For at omgå disse problemer, vi derfor forsøgt at generere EB'er ved udpladning enkelt hPSCs ind low-binding brønde i multititre plader (figur 1A). Dette resulterede ikke EB dannelse og celledød (figur 1B, nederst til højre). Anvendelse af en kendt overlevelse molekyle for hPSCs gav Y-27.632, lignende resultater. Ligeledes anvender polyvinylalkohol (PVA), som tidligere har vist sig at øge EB dannelse af hESCs 16, tendens til at "samle" de hPSCs i bunden af 96V-Brønde, men førte ikke til EB dannelse. Men hvis kombinere Y-27.632 med PVA tilskud, var vi i stand til let at generere EB'er fra encellede suspensioner af hESCs, under kemisk definerede betingelser (figur 1B). Hensigtsmæssigt kan EB størrelser i denne multititre pladeformat være stram styring ved podning forskellige antal celler per brønd i modsætning til anvendelse af konventionelle teknikker (figur 1C, nederst).
Efter yderligere inkubation i 96V plader, imidlertid EB'er tendens til at holde sig til bunden af brøndene. Derfor dagen efter EB formation, blev det nødvendigt at overføre EB'er til ultra-lav tilknytning 96U plader (figur 1A). Neuroectoderm derpå induceres i dette format ved hjælp af et lille molekyle cocktail bestående af PD0325901 (FGF / ERK inhibitor), SB431542 (TGFβ/SMAD2 inhibitor), og dorsomorphin (BMP/SMAD1 inhibitor), som beskrevet 10. Efter neuroectoderm formationved hjælp af denne lille molekyle cocktail kan EB'er blive udpladet for at give anledning til neuroner på ethvert format, hvis overflade er belagt med Matrigel, (fig. 2). Ved at igangsætte EB formation med forskellige antal celler (figur 1C, nederst), fandt vi, at EB'er genereret fra omkring 8000 celler tendens til at give den bedste neuronal differentiering kapacitet. Dette er karakteriseret ved udprægede neuronale udvækster fra den belagte EB'er, reduceret nekrotiske EB centre efter udpladning, og høj ekspression af sensoriske og pan-neuronale markører, såsom BRN3A og β-III-tubulin (figur 2 og 3A, B). De samlede neuronal differentiering effektivitet synes at være sammenlignelig med den oprindelige procedure (~ 70%) (figur 3), der gjaldt for både hESCs og hiPSCs 10. Vi har hidtil anvendt to uafhængige hESC linjer, HuES6 og NCL3, i multibrønd procedure, hvorimod cellelinie-afhængige variation i differentiation effektivitetsgevinster kan generelt ikke udelukkes.
Adskillige anvendelser af hPSC-afledte neuroner kræver monolag af differentierede celler i stedet for belagte EB'er. Vi har derfor også undersøgt, om formodede neuroektodermale celle kugler på dag 4 i protokollen (fig. 2, i midten) kunne adskilles i enkelte celler ved Accutase, for derefter at blive udpladet som monolag. Faktisk efter udpladning enkelte celler af dag-4 neuroektodermale celler, udtalt neuronal differentiering af disse genudpladet celler opnås ved en effektivitet på omkring 60% (fig. 3C).
Figur 1. EB formation procedure. A) Skematisk af EB formation procedure. En dag før påbegyndelse af Forskel ntiation (d-1), en suspension af hESCs indeholdende flere tusinde celler pr 100 gl er podet i 96V brønde, efterfulgt af centrifugering. EB'er dannet natten over overføres herefter til ultralave tilslutningskrav 96U brønde til yderligere behandling. B) Test virkningen af PVA og Y-27632 på EB-dannelse. EB formation kun kunne observeres i medium indeholdende både PVA og Y-27.632 (se pilen hoved) C) Top:. EB'er dannet ved konventionelle midler er som regel heterogene i størrelse. Nederst: EB'er dannet med "spin EB" teknik afbildet i A. Ved at bruge forskellige antal inputceller, kan EB størrelser være tæt kontrolleret og var meget ensartet. Klik her for at se større figur .
35fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Neuron formation flow chart. En dag før indledningen af differentiering (d-1), er EB'er genereret i 96V plader med den angivne EB formation medium. Efter overførslen af EB'er i 96U plader, neural induktion initieres ved hjælp af differentiering medium. 4 dage senere, er EB'er udpladet i Matrigelcoatede brønde i en ønsket multibrønd format. Repræsentative morfologier er vist for hvert trin. Billedet til højre viser typiske neuronale udvækster fra belagte EB'er - den høje celletæthed område på meget ret er en del af forgyldt EB centrum, hvorfra de neuroner tendens til at vokse ud i en radial måde. Alternativt på dag 4, kan EB'er adskilles i enkelte celler og udpladet for terminal differentiering som monolag (tekst og figur 3C for detaljer). Klik her for at se større figur .
Figur 3. Karakterisering af neuroner. A) Real-time RT-PCR karakterisering af dag 8 bulk-neuronale kulturer. Bemærk, at i differentierede prøver neural crest og pan-neuronale markørgener var stærkt opreguleres i forhold til udifferentierede kontrolceller. Selv prøver indledt med 16.000 celler viste de højeste neuronale ekspressionsniveauer (bemærk logaritmisk skala), EBS mellem 4.000 til 8.000 celler viste sig mest nyttige baseret på morfologiske kriterier. B) De fleste celler, der vokser ud fra den belagte EB'er er neuroner farves positive for beta- III tubulin (rød) og den sensoriske neuron markør BRN3A (grøn). C) Neuroner dannet efter enkelt celle udpladning i stedet for udpladning af EB'er. På dag 4 i protokollen (figur 2), Var flydende EB'er dissocieret ved hjælp Accutase og podes ud som enkelte celler til så terminalt differentiere som monolag. Som vist til venstre, blev celler med typisk neuronal morfologi, der farves positive for beta-III tubulin opnås let, hvorimod celleoverlevelse syntes at være noget reduceret i forhold til EB plettering. Højre: Immuncytokemi-baseret kvantificering af neuronal udbytte (n = 3 repræsentative udsnit analyseret + / - SD). Klik her for at se større figur .
| Navn genet | Ang primersekvensen | Rev primersekvensen |
| ACTB (husholdning gen) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (husholdning gen) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Tabel 2. Primere anvendt til RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste differentiering protokoller, der involverer EB dannelse fra hPSCs, herunder vores tidligere offentliggjorte procedure 10, er baseret på manuel eller enzym-assisteret høst af hESCs som aggregater, hvilket uundgåeligt fører til heterogenitet i EB størrelser. Dette forhold fører til variation i differentiering effektivitet med visse cellelinier, hvorved systematiske analyser vanskelig, især på et medium throughput skala. Desuden, manuel dissektion er arbejdskrævende som i sig selv bringer skalerbarhed.
I modsætning hertil er den her beskrevne fremgangsmåde er baseret på EB-dannelse ud fra enkeltceller, hvilket letter håndtering af celler og minimerer variation mellem prøver. Vigtigt er det, viser vi, at den samlede differentiering kapacitet i neuroner ikke synes at være påvirket ved at indlede protokollen med spin EB'er. Desuden holder de enkelte EB'er adskilt fra hinanden ved hjælp af anvendelse af 96-brønds ophængningsplader forhindrer them i at aggregere med hinanden i suspension - der viser endnu en anden ulempe ved den konventionelle procedure 10. Som følge heraf er mængden af input hPSCs nødvendige for at initiere et givet eksperiment lavt, at omkring en brønd i 6-brønds plade med subkonfluente hPSC kolonier er sædvanligvis tilstrækkelig til at initiere differentiering i to plader med 96 brønde. Endelig spin EB teknik muliggør nøje kontrol med EB størrelser. Ifølge vores observationer, tendens ekspressionsniveauerne af neuronale markører til at stige til en vis grad med voksende størrelser af belagte EB'er (figur 3A). På den anden side, tilbøjelige til for stor EB'er at vise nekrotiske centre efter udpladning. Dermed som et kompromis, fandt vi EB'er på 4.000 til 8.000 celler at være et passende område.
På grund af sin høje effektivitet, enkelhed, hastighed og omkostningseffektivitet, forventer vi den beskrevne metode til at være en nyttig platform for funktionelle undersøgelser, sygdom-modellering kræver menneskelig sensory neuroner, eller medium throughput cellebaserede farmakologiske assays kræver neuroner af enhver type. Med hensyn til sidstnævnte anvendelse, vil foreneligheden med automatiseret analyse, såsom med højt indhold billeddannelse være ønskelig. Dette kan imidlertid være umulig, fordi det kun outgrowing neuroner i periferien af den belagte EB'er kunne analyseres. For at omgå denne hindring, vi også forsøgt at generere monolag af neuroner ved dissociere EB'er på dag 4 i protokollen og udpladning enkelte celler. Faktisk viser dataene i figur 3C viser, at neuroner dannet ved rimelig effektivitet på omkring 60%. Vi imidlertid observeret et fald i celleoverlevelse under disse betingelser, hvilket antyder, at denne variant af protokollen kan undersøges yderligere og optimeres, fx ved hjælp af en anden fastgørelse substrat. (Tilsætning af Y-27632 efter udpladning dag-4-celler i trin 5,2 gjorde fremme celleoverlevelse efter udpladning, men det syntes også at interferere wi'te efterfølgende neuronal differentiering og derfor udelades.) Endvidere vil det også være interessant at undersøge, om andre typer neuroner kan genereres med denne platform, ved at variere medium præparat i det andet trin af protokollen. Desuden med hensyn til overførslen af EB'er fra 96V til 96U-formede brønde på dag 0, ville det være ønskeligt at udtænke en fremgangsmåde baseret på multikanal pipettering, sidste ende at opnå high-throughput forenelighed beskrevne fremgangsmåde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
