Summary
多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。
Abstract
ヒト多能性幹細胞（hPSCs）からニューロンを生成するための既存のプロトコルはしばしば彼らが前終末分化に神経前駆細胞の単離および拡張を伴う多段階の手続であるという点で、手間がかかります。これらの時間のかかるアプローチと比較して、我々は最近、3シグナル伝達経路、TGFβ/SMAD2、BMP/SMAD1、およびFGF / ERK、を合わせた抑制が機能して神経細胞への分化即時続いhPSCs、神経外胚葉からの迅速な誘導を促進することを見出した。ここでは、さらに、その再現性を向上させ、半ばスループットのアプリケーションと互換性を持たせるために、小説multititreプレートフォーマットに我々の手順を適応している。それが付着した条件下でのニューロンへの分化の一層の4日間続いフローティング球における外胚葉形成の4日後（胚様体）を含む。このプロトコルを用いて得られたほとんどの細胞は双極感覚ニューロンであるように見えます。また、手順は非常に効率的であり、特定の専門的なスキルを必要とせず、コスト効率の高い小分子との単純な化学的に定義されたメディアに基づいています。これらの特長により、プロシージャは、さらなる機能調査のための有用なプラットフォームとしてだけでなく、どのようなタイプの人間の感覚神経細胞や神経細胞を必要とする細胞ベースのスクリーニングアプローチのための役割を果たすことができる。
Introduction
胚由来のヒト胚性幹細胞（hESC）や人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含むhPSCsは、それらがin vitroで1-2の様々な細胞系統を生じさせることができる多能意味です。多数の分化した細胞の種類は、これらの細胞は、科学的研究と細胞ベースのスクリーニングのアプローチのための貴重なツールを紹介し、細胞ベースの治療のための約束を保持するという考えを支持し、現在までにヒトES細胞に由来している。
ヒトES細胞の神経細胞分化プロトコルは、彼らはしばしば神経前駆細胞の分離マニュアル、および利息3-6の与えられたニューロンタイプへのその後の最終分化に続いて、第1誘導全体の神経運命に基づいているため、通常、複雑で時間のかかるものです。いくつかの点では、この複雑さは、このような最先端の指示分化プロトコルを段階的に早い人間開発、whicを模倣する傾向があることを考えれば驚くべき、不可避ではないhはそれ自体が非常に複雑である。その一方で、それは部分的にもはるかに完全に最適化されてからまだ分化プロトコルで、その結果、根本的な分子過程の理解の我々の欠如を反映しているかもしれない。
神経外胚葉への分化hPSCsの変換につきましては、ペラら BMP / SMAD1/5/8シグナル伝達の抑制はhESCの7の神経誘導を増強することを発見した。また、SMAD2 / 3シグナル伝達の不活性化は神経外胚葉の形成8を促進することが示されている。したがって、これら2つの経路の不活性化が組み合わさhPSCs 4,9のより効率的な神経誘導につながる傾向。さらに最近では、我々は第三シグナル伝達経路は、FGF / ERKは、ヒトES細胞における神経外胚葉コミットメントの最も早い段階の強力なリプレッサーとして機能することが示されている。逆に、これらのすべての3つの経路の同時抑圧はと神経外胚葉にhESCの近傍同種の変換につながるわずか4日10インチ続いて、機能的な神経細胞への高い効率的な終末分化は8日以内に観察された。得られたニューロンは、部分的に10彼らの急速な導出を説明するかもしれない末梢神経系の感覚神経細胞である可能性が高かった。感覚ニューロンのメンテナンスの欠陥は、家族性自律神経失調症11などの特定のヒトの疾患の原因を考えられている。ニューロンの特定のタイプを必要としない適用の目的のためだけでなく、さらなる機能解析のために、hiPSC技術12に基づいて、そのような疾患をモデル化するため、この分化の手順では、有用な基礎を提示することができる。
しかし、差別化戦略は、我々は当初のhESCコロニー10の塊から胚体の関与形成（EBS）を採用し、これはEBのサイズに関する異質性のかなり度をもたらし、また、いくつかのCEのニューロン形成効率を損なうように見えたLLライン。また、EBのサイズの異質性に起因して、体系的にニューロン形成中および後に追加の成長因子または小分子の効果をテストする能力がやや混乱しているように見えた。
また、他のコンテキスト13に示すように、本 報告では、我々は非常にサイズ制御された方法でEBを生成するための培地スループット互換、強制集約ベースの技術に我々の前の手順を適応した。続いて、96ウェルプレートのV字型のウェル中に生成されたEBを懸濁液中の神経外胚葉の形成を開始するために、U字型、超低付着の96ウェルプレートに移した。 4日後、EBは、高効率と均一性で分化した神経細胞を生じさせるプレーティングすることができます。あるいは、日-4はEBは、単一細胞に解離し、そのように播種し、人間の神経細胞の低密度の単層で生じた。首尾一貫した結果は、これまで独立して2で得られたデrivedのhESCライン、HuES6とNCL3。
前提条件として、成功したEB形成は一緒hESCの生存13-14を促進することが知られているROCK阻害剤Y-27632で、合成ポリマー、ポリビニルアルコール（PVA）の使用に厳密に依存していた。その結果、96-Vプレートで形成されたEBの均質性は実質的にランダムな分割手法に基づいて大量培養としてEBの形成に比べて強化されました。このシステムは、このように付着した条件の下で高度に制御されたニューロンの形成に続いて懸濁培養における神経外胚葉形成、有意に改善されたプラットフォームを提供します。
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Protocol
1。マトリゲル被覆プレートとメディアの準備
- マトリゲルは、EBSの差別化の取り付けのための好ましい基質であることが判明し、また、これらの10からニューロンの効率的な伸長を促進されたマトリゲル被覆プレートの作製。
- 氷の上で一晩マトリゲルの雪解け10ミリリットル。
- 翌日、氷のように冷たいDMEM/F-12の2ボリュームとゼリー状のマトリゲルを希釈し、-20℃で凍結保存することができる予冷した15 mlコニカルチューブに1mlのアリコートを準備
- 神経分化にプレートフォーマットを決めて。例えば、出発点として、私たちは12ウェルフォーマットにおける分化の最初のラウンドを実行することをお勧めします。 4℃でプレクール4 12ウェルプレートすべて予め希釈マトリゲルは解凍し、溶解するまで上下にピペッティングし、続いて予冷DMEM/F-12 9mlを添加することにより凍結マトリゲルの1アリコートを溶かす。
- その後、氷（最終マトリゲル希釈：1:75）にDMEM/F-12の15ミリリットルを含む新しい50 mlチューブに内容を転送します。次に、予め冷却し、12ウェルプレートの各ウェルに希釈したマトリゲルの0.5 mlを加える。パラフィルムでプレートを包み、室温で一晩放置する。
- 翌日、4℃にプレートを転送コートされたプレートは、使用前に数週間のために保存することができます。
- メディア
EB形成培地（1 96ウェルプレートでの差別化を行うのに必要な〜15ミリリットル- 図2の表1及びスキームを参照してください ）：
0.4％（PVA）とDMEM/F-12
1X N2
1X B27
0.05％BSA
20 ng / mlでのFGF2
10μMのY-27632
1X PenStrepGln
分化培地（1 96ウェルプレートでの差別化を行うのに必要な〜30ミリリットルは、1マトリゲル被覆した12ウェルプレートにおけるニューロン形成に続いて、 表1を参照してください ）：
DMEM/F-12
1X N2
0.05％BSA
0.5μMのPD0325901
15μMのSB431542
0.5μMのDorsomorphin
1X PenStrepGln
2。強制EB形成
- お好みのフィーダを含まない条件下でhPSCsを栽培しています。我々は、マトリゲル被覆された6ウェルプレート15日 、MEF馴化培地を使用しています。しかし、このような自家製または市販の定義されたメディアなど、他の培養系でも動作するはずです。分化実験開始時に、hPSCsはサブコンフルエントと活発に成長しなければなりません。
- 機械的にステレオ顕微鏡下で滅菌したプラスチック製のピペットチップを用いて自発的に分化したコロニーを削除します。
- 1X、Y-27632を含むAccutaseを用いて単一細胞にPBS、およびダイジェストを使用して残りの未分化コロニーを洗う。 2分間、200×gで遠心分離によってペレット単一細胞、EB形成の少量の培地で再懸濁し、血球計数器を用いて細胞力価を決定します。
- に対する細胞のアリコートを追加ミリリットル当たり40,000〜80,000細胞間の力価になり、残りのEB形成媒体。
- マルチチャンネルピペットを使用して、1ウェルあたり4,000〜8,000個で、その結果、96V底プレートにウェル当たり100μlを移す。 1分間400 xgでスイングアウトプレート遠心機でスピン96ウェルプレートはウェルの底部での細胞を収集し、細胞培養インキュベーターに転送する。 図1に示すように、EBは、一晩形成することになる。
3。神経外胚葉誘導
- 次の日（0日）、分化培地2mlを含む3.5センチメートル細菌皿に小さな音量でステレオ顕微鏡と転送で96VプレートからEBを収集します。優しくEBを洗うには、数秒のために皿を攪拌。
- 100分化培地のウェルあたりの超低付着U底96ウェルプレートを追加します。実体顕微鏡下では、96U-ウェルに洗浄皿から小さなボリュームで転送EBS（我あたり1 EBLL）。神経外胚葉の形成を可能にするために4日間細胞培養インキュベーターに96Uプレートを置きます。
4。ニューロン形成
- 4日目に、ステップ3.1のように洗浄皿を準備し、さらに分化培地（ウェル当たり1ミリリットル）で予め温めマトリゲル被覆した12ウェルプレートにDMEM/F-12を交換してください。
- EBのメッキ
- 96UプレートからEBを収集し、マトリゲル被覆した12ウェルプレート（ウェル当たり約8 EBS）のウェルに、これら上記のように、そして慎重にシードそれらを一つずつ洗っ：EBSは均等の平穏な成長を可能にするためにウェル内に分配されるべきである次回日間のニューロン（ 図2の"5日目"画像を参照してください）。
- バックインキュベーターに12ウェルプレートの譲渡の前に、EBを緩く室温で約10分間アタッチすることができます。その後、細胞培養インキュベーターに12ウェルプレートを慎重に移す。ニューロンは、笙のように、次の4日以内に放射状にめっきしたEBから外に成長するだろう図2のWN（ "8日目"右の画像）。
5。単層としてニューロン形成
- 点4）の手順の代わりに、手順の4日目に、分化培地2mlを含む3.5センチメートル細菌皿にEBを集め、次いでPBS含有皿に少量のEBを転送して、にAccutaseを含む別の皿。
- 分化培地の小さなボリュームに再懸濁し、単一細胞、2分間、200×gで遠心分離に消化し、血球計数器を用いて細胞力価を決定しましょう。分化培地を用いml当たり1-2X10 6細胞（Y-27632は除く）に力価を調整します。
- 予め温めておいたマトリゲル被覆した12ウェルプレート（ウェル当たり1ミリリットル）、および細胞培養インキュベーターへの転送では、プレートの細胞外。単層としてニューロンの形成は日7から8（ 図3C）間で観察された。それは、しかし、注意すべきは、この単層バリアント手順は完全に細胞の生存および最も適した基板に関して最適化されていません。
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Representative Results
我々の以前の報告書では、多くの他の人と並んで、hPSCsからEBを単に低接着皿10へhPSCsのルーチンを分割する際に凝集体を再播種することによって生成することができます。その結果、EBのサイズ（ 図1C、上側）の広範な分布で、これは通常の結果。このことから生じたもう一つの問題は、懸濁液中に維持されたEBは、EBのサイズのさらに高い異質性につながる、互いに凝集する傾向があるということです。これらの問題を回避するために、我々は、したがって、multititreプレート（ 図1A）の低付着ウェルに単一hPSCsをメッキしてEBを生成しようとしました。これはノーEB形成と細胞死（ 図1B、右下）となりました。 hPSCs、Y-27632、生存のための既知の分子を適用すると、同様の結果が得られた。同様に、以前にhESCを16のEB形成を増強することが示されている適用ポリビニルアルコール（PVA）は、96Vの下部hPSCsを"収集"する傾向があったウェルが、EB形成には至らなかった。しかし、PVAの補充と、Y-27632を組み合わせるならば、我々は容易に化学的に定義された条件下でのヒトES細胞の単細胞懸濁液、（ 図1B）からEBを生成することができました。都合の良いことに、このmultititreプレート形式でEBのサイズがきつく、従来の技術（ 図1C、底）を使用してとは対照的に、1ウェルあたりの細胞数が異なる播種することにより制御することができた。
96Vプレートでさらに培養すると、しかし、EBはウェルの底に固執する傾向があった。したがって、EB形成後の日に、それは、超低付着96Uプレート（ 図1A）にEBを転送する必要がありました。外胚葉は、その後PD0325901（FGF / ERK阻害剤）、SB431542（TGFβ/SMAD2阻害剤）で構成される小分子カクテルを使用して、この形式で誘導され、dorsomorphin（BMP/SMAD1阻害剤）は、10に記載されている。神経外胚葉の形成に続いて（ 図2）、この小分子カクテルを使用して、EBは表面がマトリゲルでコーティングされていれば、任意の形式上のニューロンを生じさせるようにプレートアウトすることができます。細胞の数が異なる（ 図1C、下）とEB形成を開始することによって、我々は8000の周りの細胞から生成EBを最高の神経分化能をもたらす傾向があることがわかった。これはメッキEBから顕著な神経増生によって特徴付けられる、めっき後壊死EBセンターを減少し、そのようなBRN3Aとβ-チューブリンIII（ 図2および図3A、B）のように感覚と汎神経マーカーの高発現。全体的な神経分化効率はヒトES細胞とhiPSCs 10〜両方に適用された元の手順（〜70％）（ 図3）に匹敵するように見える。我々はこれまでdifferentiatioでセルラインに依存ばらつきのに対し、マルチウェル手順では、2つの独立したhESC株、HuES6とNCL3を採用してきたn個の効率は、一般的に排除することはできません。
hPSC由来のニューロンのいくつかのアプリケーションでは、代わりにメッキEBの分化した細胞の単層を必要とするでしょう。そこで我々はまた、プロトコルの4日目（ 図2中段）における推定上の神経外胚葉細胞球はAccutaseを用いて単一細胞に解離させることができるかどうかを検討し、次に単層としてプレーティングする。確かに、日-4神経外胚葉細胞の単一細胞をプレーティングする際に、これらの再播種細胞の顕著な神経分化が約60％（ 図3C）の効率が得られる。
図1。 EB形成の手順。EB形成手順の）回路図。 differe開始前の一日 ntiation（D-1）、100μlあたり数千の細胞を含むヒトES細胞の懸濁液を遠心分離し、96Vのウェルに播種されています。 EBは、さらに治療のために、超低付着96Uウェルに転送され一夜に形成されますB）EB形成上のPVAと、Y-27632の影響をテストします。 EB形成のみPVAと、Y-27632（矢頭参照）の両方を含有する培地中で観察することができ、C）上：従来の手段によって形成されたEBは、通常サイズの不均一である。ボトム：EBSは、入力セルの異なる番号を使用して、Aで示される"スピンEB"技術で形成され、EBのサイズが厳密に制御することができ、非常に均一であった。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2。ニューロン形成のフローチャート。分化の開始（D-1）の前にある日、EBを指示されたEB形成媒体を使用して96Vプレート内で生成されます。 96UプレートにEBの譲渡時に、神経誘導、分化培地を使用して開始されます。 4日後に、EBを希望するマルチウェルフォーマットのマトリゲル被覆ウェルでプレーティングされています。代表的な形態は、各ステップのために示されている。右の写真はメッキEBから典型的な神経細胞増生を示しています - 非常に右に高い細胞密度領域には、神経細胞が放射状に外に成長する傾向がある、そこからメッキEBセンターの一部です。あるいは、4日目に、EBは単細胞に解離させることができると組織化単分子膜（詳細については、テキストと図3C）のように端末の差別化プレートアウト。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図3。ニューロンの特性評価。8日目バルクニューロン培養の）リアルタイムRT-PCRの特性。未分化のコントロール細胞と比較して差別化された試料では神経堤および汎神経マーカー遺伝子が強くアップレギュレートされたことに注意してください。 16000セルを用いて開始サンプルは最高神経発現レベル（対数スケールに注意）、EBを示したが、8000〜4000の間の細胞は形態学的基準に基づいて、最も有用であることが証明されますB）メッキEBから生えほとんどの細胞はに陽性染色ニューロンであるβ- IIIチューブリン（赤）と感覚ニューロンマーカーBRN3A（緑）C）の代わりにEBをメッキの単一細胞播種後に形成された神経細胞。プロトコル（ 図2の4日目）、浮動EBはAccutaseを用いて解離してから末端単層として区別するために、単一細胞として播種した。細胞生存率は、EBなどメッキに比べてやや減少したように見えたのに対し、左図のように、β-IIIチューブに陽性染色され、典型的な神経形態を持つ細胞は容易に得られた。右：神経細胞収量の免疫細胞ベースの定量化（n = 3の場合の代表的なセクションが+ /を分析- SD）は拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
| 遺伝子の名前 | 順方向プライマー配列 | Revのプライマー配列 |
| ACTB（ハウスキーピング遺伝子） | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A（ハウスキーピング遺伝子） | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
表2 RT-QPCRに用いるプライマー。
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Discussion
私たちの以前に公表されている手順10を含むhPSCs、、からのEB形成を伴う最も分化プロトコルは、手動または必然的にEBのサイズで異質につながる集約などhESCの酵素アシスト収穫に基づいています。この事実は、それによって培地スループットスケールで特に困難な体系的な分析を、レンダリング、いくつかの細胞株を分化効率の変動につながる。さらに、マニュアル解剖自体はスケーラビリティが損なわれる労働集約的である。
これとは対照的に、ここで説明する方法は、細胞のハンドリングとサンプル間のばらつきを最小限に抑えるを容易に単一細胞からEB形成に基づいています。重要なことは、我々は、ニューロンへの全体的な分化能がスピンEBSとプロトコルを開始することによって影響を受けると思われないことを示している。さらに、維持96ウェルサスペンションプレートを用いることによって互いから分離された個々のEBはトンを防止従来の手順10の更に別の欠点がある-懸濁液中でお互いに集約するから裾。結果として、与えられた実験を開始するために必要な入力hPSCs量は約サブコンhPSCコロニーで6ウェルプレートのウェル1は、通常、2つの96ウェルプレートに分化を開始するのに十分であるという点で、低いです。最後に、スピンのEB技術は、EBのサイズを厳密に制御することができます。我々の観察によると、神経細胞マーカーの発現レベルは、めっきされたEBのサイズが増加（ 図3A）がある程度増加する傾向にある。一方、大きすぎるEBは、めっき後に壊死センターを表示する傾向があります。そこで、妥協案として、我々は4,000〜8,000細胞のEBを適切な範囲であることがわかった。
その高い効率性、シンプルさ、速度、および費用対効果のために、我々は機能的研究のための有用なプラットフォームであることが記載されている方法を先取りし、人間のを必要とする疾患モデリングensoryニューロン、または任意のタイプのニューロンが必要な培地スループット細胞ベースの薬理学的アッセイ。後者のアプリケーションに関しては、このような高コンテンツイメージングなどの自動化された分析との互換性を確保することが望ましい。しかし、これはメッキEBの周囲にのみoutgrowingニューロンが分析できるという事実によって損なわれる可能性があります。この障害を回避するために、我々はまた、プロトコルの4日目のEBを解離させ、単一細胞をめっきすることによって神経細胞の単層を生成しようとしました。実際、 図3Cのデータは、神経細胞が約60％の効率で合理的に形成されていることを示唆している。しかし、我々はさまざまなアタッチメント基板を用いることにより、例えば、プロトコルのこの変化はさらに検討し、最適化することができることを示唆し、これらの条件下での細胞生存率の低下が観察された。 （ステップ5.2日-4細胞をプレーティングする時に、Y-27632の添加は、メッキ後の細胞の生存を促進しましたが、それはまたwを妨げるように見えたi番目以降の神経分化と省略されるべきである。）さらに、それはまた、神経細胞の他の種類のプロトコルの第二ステージにおける培地組成を変化させることによって、このプラットフォームで生成することができるかどうかを調べるのは興味深いだろう。また、0日目96U字型ウェルに96VからEBの移転に関して、それが最終的に記載された方法の高スループットの互換性を達成するために、マルチチャンネルピペッティングに基づく手順を工夫することが望ましいであろう。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、マックス·プランク協会によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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