Summary
我们描述了一种技术,在该技术中的截面从一个鼠标的腹主动脉原位移植到刚好低于肾动脉在异体或同源的收件人。这种技术可能是有用的,大小均匀的大血管移植的研究中,被认为是有利的。
Abstract
在小鼠吻合血管手术通常被认为是困难的,高度依赖于个人的外科医生的技能。这在很大程度上是真实的,但也有一些重要的原则,可以减少这些程序的难度,并提高再现性。原位的主动脉移植是一个很好的学习过程,在这过程中这些原则,因为它涉及到两个终端到终端的吻合,但持续的成功需要有良好的缝合技术和处理的船只。这个过程开始于采购部门在收件人的原生主动脉的长度从供体动物,腹主动脉。采购主动脉收件人主动脉之间的分割端部,然后被放置到的地方使用的端至端吻合缝合。要成功实现这一目标,需要一个高集中度的好工具,稳健的手,和升值是多么容易鼠标就可以被损坏的血管,导致血栓形成。学习这些重要的原则是什么占据了大部分的初学者的时间学习显微小型啮齿动物时。在整个这个协议中,我们是指这些重要的点。该模型可用于研究血管性疾病中的各种不同的实验系统1-8。在这里示出的上下文中,它是最经常用于移植后的血管疾病,一个共同的实体器官移植的长期并发症内膜增生的发生在移植物的研究。该模型的主要优点是,它便于形态计量学分析和移植的血管位于邻接的内源性的容器,它可以作为一个附加的控制9。此处所示的技术是最经常使用小鼠体重18-25克。我们已经积累了我们的经验,使用C57BL/6J,BALB / CJ,和C3H/HeJ小鼠品系的。
Protocol
1。术前准备
- 手术过程中,无论多么用心做,在显著压力的结果。为了尽量减少这种压力的影响,并最大限度地储备,动物应保持在动物饲养至少72小时之前使用10,11。
- 必须是无菌的手术工具,纱布和棉签。这是没有必要使用无菌手套,提供的只是提示仪器触摸缝合或手术视野。
- 用于止血,夹紧压力是非常重要的必要的最低限度。由于压力过大或粗糙处理而损坏的血管会导致血栓形成,导致在后,腿麻痹,肠缺血和死亡在24小时内。我们已经发现,使用与不超过2克/厘米2的压力下的夹具,消除了该问题。这些夹在表1中指出。钳的压力在规格夹由高品质的手术拉琴T制造商。我们发现,便宜夹或一次性夹普遍施加过大的压力。
- 侧支血管的相对位置,以及腹主动脉和下腔静脉(IVC)的位置是应变依赖。您还可以找到小的小鼠个体之间的差异,特别是在侧支血管的位置。
2。供体手术
- 小鼠可以麻醉用异氟醚(1.5-2.5%的诱导,维持1.0%在空气中),或用戊巴比妥(55-65毫克/千克)。戊巴比妥规定的时间限制(1.5小时),但提供的外科医生选择旋转的动物更方便,如果需要的话。麻醉的时间可以延长至最多2小时到小肠或肝脏手术期间需要时,通过将2-3滴的麻醉。也可用于由训练有素的医生谁约氯胺酮/甲苯噻嗪(100毫克/千克体重7毫克/公斤二甲苯胺噻嗪,IP俗称“K仔”的氯胺酮及)Ň1至1.5小时内完成步骤,但它有一个窄的安全剂量范围。在美国,使用苯巴比妥已经成为更多的问题,在最近几年,由于供应短缺。至关重要的是,被监测麻醉深度,是一定的,它是足够的。脚趾掐反射是最好的指标,足够的深度,但也应注意呼吸速率和其他运动。
- 麻醉诱导后,使用脱毛去除头发上腹部的凝胶或剃须刀。
- 安装上的动物实验室磁带在扩展eagled的位置,以保持它的操作板采用。的金属板允许使用加热垫在它下面,在手术过程中的温度支持。我们手动控制的加热垫,这是一个消费级的单元,用于家庭使用的温度。温度被保持在35-38°之间。的金属的操作板也是易于消毒程序之间。
- 使用杀菌剂如洗必泰消毒区域,随后用乙醇洗涤。重复此步骤三次,以确保充分消毒。这也将删除任何剩余的头发裁片,如果存在的话。
- 用剪刀做一个切口,通过体壁,暴露腹腔脏器。
- 使用棉签,内脏推到一边,露出腹部的大血管。的内脏放置一块纱布用温生理盐水弄湿保持湿润。
- 使用钝性分离,非常仔细地解剖腹主动脉离周围组织。从下腔静脉解剖容器要非常小心。将一个或多个分支,如腰动脉,必须小心吊起并烧灼。解剖主动脉的部分应该是肾血管下方和上方的分叉进入股动脉的主动脉。这部分可以作为供体材料为许多的两个受助人,多少分支血管的供体动物的存在和大小。
- 领带的缝合线的正下方的肾动脉和其他的正上方的分叉。用剪刀把主动脉,全含200 U / ml的肝素生理盐水冲洗移植。非常小心地保持一端的船只和滴生理盐水的解决方案,它贯穿于重力的船只。不要让气泡通过的船只。处理容器的端部,尽可能少尽可能其他的内膜可以损坏导致血栓形成购买。删除它从现场,并立即将其放置在冰冷的盐水的容器。允许供体动物的抽血。
3。接收方操作
- 麻醉动物和应用的脱毛胶或使用剃须刀去除头发上腹部。之前我们管理丁丙诺啡剂量在0.1毫克/千克建立镇痛皮下切口。
- 中号指望。2-15动物实验室磁带的作业现场使用。动物必须装在一个温暖的操作阶段,这将有助于在操作过程中保持体温。
- 庆大霉素眼药膏对眼睛的干燥,以防止他们。
- 腹部,然后由乙醇洗消毒。重复此步骤三次,以确保充分消毒。
- 再次检查是否有足够的麻醉,然后再进行下一个步骤。
- 作出在两个阶段通过皮肤和体壁的正中切口,小心不要入射到组织下方。
- 将吊具保持腹部切口开放。指向的螺杆组件朝向后肢端保持大量的钳位,满分的方式。
- 一个正方形的无菌生理盐水纱布弄湿,并把它在肠道。随着你的手指轻轻地在纱布上,插入在肠道内的棉签,轻轻地反映到S的肠子IDE所以他们都坐在顶部的纱布。另一块纱布,把它的肠子,并用生理盐水湿。
- 删除任何脂肪组织,,覆盖主动脉和下腔静脉(IVC)。要轻柔。的IVC是很脆弱的。
- 轻轻地用钳子从下腔静脉解剖腹主动脉。清除的面积足够大,以提供空间两个夹具,在它们之间有足够的容器,这样,分割时,会有足够的接枝可缝合的容器。解剖时,寻找血管分支。如果必要的话,烧灼他们具有低温度cauterizer。
- 将肾动脉和另一只以上的分叉血管钳的正下方。
- 切主动脉。主动脉的端部通常会缩回,离开约5毫米的空间。检查止血。如果夹具的正常工作,只有少量的血逃脱后切。如果继续出血,检查的夹子,以确保没有干扰ING与他们同在。需要注意的是没有除去的主动脉。这仅仅是划分。
- 用肝素盐水冲洗伤口两端(200 U /毫升),然后用棉签删除多余的解决方案。
- 德移植到地方在每一端使用三个连续的缝合线。只是在每端一侧吻合缝合,然后填写在休息时进行连续缝合或间断缝合。七至八个不连续的缝线是足够的。如果您使用的是连续缝合,确保血管壁保持轻松,你不会导致吻合口狭窄。
- 小心地取出钳颅端和查找内存泄漏的缝合线。少量渗水的确定提供约一分钟内停止。如果有更多的比,它是能够使用一个单一的线圈以止血。
- 对主动脉的吻合口上方用湿棉签轻轻按下,然后删除第二个夹子。轻轻按下并释放了几次,检查显示主动脉专利。的接枝将立即灌注和脉冲应该是可见的。
- 取出纱布覆盖的肠子,将它们放回原位。避免扭曲的肠道,并保持正常的解剖定位。
- 关闭的肌肉层,用5-0薇乔。
- 关闭的皮肤,使用5-0或6-0 prolene线。
- 治疗小鼠皮下carprophen,在5毫克/公斤,以增加在终止前麻醉镇痛。
- 给鼠标0.5-0.8毫升生理盐水皮下注射。
- 将鼠标在加热笼恢复。在恢复过程中,请仔细监控,以确保恢复正常。手术后2-3小时,鼠标应该表现比较正常。在12小时后运,丁丙诺啡皮下2 mg / kg的镇痛治疗的动物。动物,在任何时候,如果弯腰驼背,制造噪音或表现出有限的运动范围,调查的问题。如果不能建立一个明确的原因和固定,应实施安乐死的动物,每个机构的协议。在24小时的动物应在收到另一个的carprophen剂量皮下注射5毫克/公斤。后肢麻痹表示失败的吻合或血栓。在这种情况下,动物应被安乐死。
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Representative Results
图1示出了主动脉接枝。白色箭头表示的缝合线。专利接枝将显示一个可见的脉冲, 图2表示一个典型的实验中,受体存活56天的期间其次。一组由野生型(C57BL / 6×FVB)受体小鼠BALB / c小鼠主动脉移植。另一组“KO”,指定由缺乏表达血红素加氧酶1,从而导致血栓形成在24小时内移植的受惠人士半价优惠(C57BL / 6×FVB)。值得注意的是,这会导致所有收件人死亡作为图中所示的图3所示的回波的测量在一个正常的动物,并在移植接受者IVC和腹主动脉。请注意,该接枝是在外观上的非移植主动脉专利和类似。
图1。有一种观点的一个移植的主动脉。白色箭头表示的缝合线。
图2。Kaplan-Meier法描绘两组小鼠移植的BALB / c小鼠主动脉主动脉移植后的生存。 “KO”指定收件人缺乏血红素加氧酶-1,其中的表达导致血栓形成的主动脉移植物在24-48小时。 “WT”指定的野生型小鼠。转载来自于:一氧化碳救援血红素加氧酶1基因敲除小鼠动脉血栓形成的同种异体主动脉移植,陈乙,郭,范Ç,Bolisetty小号,约瑟夫ŕ,赖特MM,乔治·阿加瓦尔A,JF。病理学杂志。 2009年7月,第175(1):422-9与爱思唯尔的许可。
FIGURE 3。回波成像下腔静脉(IVC)和腹主动脉在体内正常小鼠(左图)和腹主动脉移植受者(右图)。与Visualsonics的VEVO 660仪器的图像。星号表示的血管的内腔。
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Discussion
主动脉移植小鼠模型,因为小鼠很好定义immunogenetically 9,12,13,他们可以很容易地操纵,以改变它们的特定基因的表达,如果需要的话,提供了许多优点。正如在引进,血管外科在小鼠比大多数型号的船只的大小,因为是比较困难的。即使是伟大的动脉,如主动脉通常不超过100〜200微米内径操纵这些船只需要一个显着的技术和灵巧8,14。最常见的并发症是那些刚刚开始实施的系统观察这个手术后,腿麻痹,通常是由于血栓形成造成的损伤血管内膜粗糙处理或夹紧。大多数的销售公司销售工具,适用于显微夹创建太多的压力,可用于小鼠,通常大于25克/厘米2的压力。在CLAMPS我们使用的是光滑的,2克/厘米2,这仅仅是足够的压力,以达到止血,而不是损坏的船只的压力。一些外科医生喜欢使用缝合,而不是夹。我们不推荐这种做法,因为它是一种方法,是高度依赖于外科医生的能力,以了解正确的压力,我们认为,可以有助于以较低的成功率。与实践,90%或更好的存活率应预期。
终端到终端的吻合的缝合技术,是一项重要的技能,有经验的收购。根据以往的经验,手术技术和手工灵巧,充分能力,可以实现后50-100手续。最近的研究表明,可能成为在未来15替代技术吻合。
此过程中的主要限制是,最喜欢的显微程序,在小鼠中,高水平的技巧是没有出色的精细运动技能的成功执行和个人需要的能力可能永远不会达到很高的水平。然而,实践中,大多数人可以达到一个可接受的成活率。组织的小尺寸也导致额外的约束,因为移植物的大小是非常小的,因此,用于随后的分析的材料的量被限制。该模型最大的优势,是很好的特点的小鼠,有许多近交系,转基因小鼠,基因敲除小鼠的免疫遗传学,允许非常有用的实验,以解决在体内的分子机制。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院P30:奥布莱恩中心(DK 079337)的核心资源。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vascular Clamps | Fine Science Tools | 00396-01 (Size B-1) | |
Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | |
10-0 Needled microsuture | AROSurgical | TK-107038 | |
Straight scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5620 | |
Low temperature cauterizer | Beaver-Visitec International | 8441000 | |
Self retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 |
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