Orthotopen Aortic Transplantation in Mäuse für das Studium der Vascular Disease

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren, bei dem ein Abschnitt der Bauchaorta von einer Maus transplantiert orthotopisch wird knapp unterhalb der Nierenarterien in einer allogenen oder syngenen Empfänger. Diese Technik kann in Untersuchungen, bei denen die Transplantation von grossen Arterien von einheitlicher Größe als vorteilhaft erachtet wird nützlich.

Abstract

Vaskulären Verfahren, die in der Maus Anastomosen gelten im Allgemeinen als schwierig und hängt stark von der Geschicklichkeit des einzelnen Chirurgen. Dies ist weitgehend richtig, aber es gibt eine Reihe von wichtigen Prinzipien, die die Schwierigkeit dieser Verfahren reduzieren und erhöhen Reproduzierbarkeit. Orthotopen aortischen Transplantation ist ein ausgezeichnetes Verfahren, in dem diese Prinzipien lernen, weil es nur zwei End-zu-End-Anastomosen beinhaltet, erfordert jedoch eine gute Nahttechnik und Handhabung der Gefäße für konsistente Erfolg. Dieses Verfahren beginnt mit der Beschaffung einer Länge von Bauchaorta von einem Spender Tier, durch Teilung des nativen Aorta in den Empfänger verfolgt. Die Aorta beschafft wird dann zwischen den geteilten Enden des Empfängers Aorta platziert und vernäht einrastet mit Ende-zu-Ende-Anastomosen. Um dies zu erreichen dieses Ziel erfolgreich erfordert ein hohes Maß an Konzentration, gute Werkzeuge, eine ruhige Hand und eine Aufwertung, wie leicht dieGefäßsystem eines Maus können beschädigt werden, was zu Thrombose. Das Erlernen dieser wichtigen Grundsätze ist es, was nimmt den größten Teil der Anfänger an der Zeit, wenn das Lernen Mikrochirurgie in kleine Nagetiere. In diesem Protokoll, verweisen wir auf diesen wichtigen Punkten. Dieses Modell kann verwendet werden, um vaskuläre Krankheit in einer Vielzahl von verschiedenen experimentellen Systemen ^1-8 untersuchen. Im Rahmen abgebildet, wird es häufig für die Untersuchung von post-Transplantat Gefäßerkrankung, einer langfristigen gemeinsamen Komplikation der Organtransplantation, bei dem Intimahyperplasie erfolgt im Allotransplantat verwendet. Der primäre Vorteil des Modells ist, dass es quantitative morphometrischen Analysen erleichtert und das transplantierte Gefäßes liegt angrenzend an die endogenes Gefäß, welches als zusätzliche Kontrolle ⁹ dienen kann. Die Technik hier gezeigt wird häufig für Mäuse mit einem Gewicht 18-25 Gramm verwendet. Wir haben die meisten unserer Erfahrung gesammelt mit dem C57BL/6J, BALB / cJ und C3H/HeJ Stämme.

Protocol

Ein. Präoperative Vorbereitung

1. Chirurgische Verfahren, egal wie sorgfältig durchgeführt, führen zu erheblichen Belastungen. Um die Auswirkungen von solchen Stress zu minimieren und die Reserven zu maximieren, sollten die Tiere im Vivarium für mindestens 72 Stunden vor Gebrauch ^10,11 aufrechterhalten werden.
2. Chirurgische Instrumente, Gaze, und Tupfer müssen steril sein. Es ist nicht notwendig, sterile Handschuhe, die lediglich die Spitzen der Instrumente Touch Naht oder operativen Bereich zu verwenden.
3. Für die Blutstillung, ist es zwingend notwendig, dass Spannkräfte der minimale notwendig sind. Schäden am Schiff durch übermäßigen Druck oder unsachgemäße Handhabung verursacht Thrombose, was Hinterbein Lähmung, Darm-Ischämie und Tod innerhalb von 24 Stunden. Wir haben gefunden, dass mit Hilfe von Klemmen mit einem Druck von nicht mehr als 2 g / cm ² beseitigt das Problem. Diese Klemmen sind in Tabelle 1 angegeben. Clamp Drücke sind in den Spezifikationen für Klemmen durch hohe Qualität chirurgischen Instru Nichtveröffentlichungt-Herstellern. Wir haben festgestellt, dass preiswerte Klemmen oder Einweg-Klemmen universell üben zu viel Druck.
4. Die Lage der Kollateralen sowie die relativen Positionen der abdominalen Aorta und der Vena cava inferior (IVC) sind Belastungen abhängig. Sie finden auch kleine Variationen zwischen einzelnen Mäusen, insbesondere an der Stelle der kollateralen Gefäßen.

2. Donor Betrieb

1. Mäusen kann mit Isofluran (1,5-2,5% Induktion, 1,0% Wartung in Luft) oder mit Pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital erlegt ein Zeitlimit (bis zu 1,5 h), sondern bietet dem Chirurgen die Möglichkeit des Drehens des Tieres für einen besseren Zugang, wenn gewünscht. Anästhesie Zeit kann bis zu 2 Stunden, indem Sie 2-3 Tropfen des Anästhetikums, wenn sie auf den Darm oder Leber während der Operation notwendig verlängert werden. Ketamin / Xylazin (100 mg / kg Körpergewicht für Ketamin und 7 mg / kg für Xylazin, ip) kann auch von gut ausgebildeten Chirurgen, ca verwendet werdenn den Vorgang abzuschließen innerhalb von 1 bis 1,5 Stunden, aber es hat eine schmalere sicheren Dosisbereich. In den USA hat sich die Verwendung von Pentobarbital geworden problematisch in den letzten Jahren wegen der kurzen Versorgung. Es ist zwingend erforderlich, dass die Tiefe der Anästhesie überwacht, um sicher sein, dass es ausreichend ist. Die Zehe-Pinch-Reflex ist der beste Indikator für ausreichende Tiefe, aber man sollte auch beachten, Atemfrequenz und andere Bewegungen als gut.
2. Nach Narkoseeinleitung, verwenden Sie eine Enthaarungscreme Gel oder einen Rasierer, Haare auf der Bauchseite Bauch zu entfernen.
3. Montieren Sie das Tier auf dem Operationstisch Board mit Labor-Band, um es in einem gespreizt Position zu halten. Eine metallische Platte Betriebssystem erlaubt die Verwendung von einem Heizkissen unterlegen zu unterstützen Temperatur während der Operation bereitzustellen. Wir manuell steuern die Temperatur des Heizkissens, das ein Consumer-Gerät für den Heimgebrauch handelt. Die Temperatur wird zwischen 35 bis 38 ° gehalten. Die metallische Operating Board ist auch einfach, zwischen Verfahren zu sterilisieren.
4. Desinfizieren der Bereich mit einem Desinfektionsmittel wie Chlorhexidin, gefolgt von einer Ethanol waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um ausreichende Desinfektion sicherzustellen. Dadurch werden auch alle restlichen geschnittenen Haar, falls vorhanden.
5. Mit einer Schere einen Einschnitt durch den Körper Wand, um die Bauchorgane aussetzen.
6. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, drücken Sie die Eingeweide an der Seite, um die großen Gefäße des Bauches aussetzen. Die Eingeweide werden auf einem Stück Gaze, die mit warmer Kochsalzlösung benetzt wird, damit es feucht platziert.
7. Mit stumpfen Dissektion, sehr sorgfältig sezieren die Bauchaorta weg von dem umgebenden Gewebe. Seien Sie sehr vorsichtig in der Zerlegung des Schiffes von der Vena cava inferior. Es wird eine oder mehrere Verzweigungen, wie die Lendenwirbel Arterie, die sorgfältig abgehoben werden und muss kauterisiert sein. Der Abschnitt der Aorta seziert sollte unterhalb der Nierengefäße und oberhalb der Bifurkation der Aorta in den femoralen Arterien. Dieser Abschnitt kann als Donor-Material für so manches dienens zwei Empfänger, je nachdem wie viele Verzweigungen Schiffen bestehen und die Größe des Spendertier.
8. Tie eine Naht gerade unter den Nierenarterien und weitere knapp oberhalb der Bifurkation. Mit einer Schere unterteilen die Aorta, vollständig ausspülen Transplantat mit Kochsalzlösung, die 200 U / ml Heparin. Sehr genau festhalten einem Ende des Gefäßes und tropft die Salzlösung, so dass es durch den Behälter durch die Schwerkraft ausgeführt wird. Lassen Sie sich nicht von Luftblasen durch den Behälter laufen. Behandeln der Enden des Gefäßes so wenig wie möglich beschädigt sonst der Intima kann, was zu Thrombose später. Nehmen Sie es aus dem Feld und sofort legen Sie sie in einen Behälter mit eiskalter Kochsalzlösung. Lassen Sie das Spendertier zu exsanguinate.

3. Empfänger Betrieb

1. Anesthetize das Tier wie oben und tragen Sie eine Enthaarungscreme Gel oder verwenden Sie einen Rasierer, Haare auf dem Bauch zu entfernen. Unmittelbar vor dem Einschnitt verwalten wir eine Dosis von Buprenorphin subkutan mit 0,1 mg / kg bis Analgesie etablieren.
2. Mount das Tier auf das OP-Feld durch Labor Band. Das Tier muss an einem warmen Betriebszustand Bühne, die zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur während der Operation montiert werden.
3. Bewerben Gentamycin Augensalbe in die Augen zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen.
4. Desinfizieren Sie den Bauch, mit einem Ethanol waschen gefolgt. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um ausreichende Desinfektion sicherzustellen.
5. Prüfen Sie die Angemessenheit der Narkose noch einmal, bevor Sie mit dem nächsten Schritt.
6. Machen Sie einen Medianschnitt durch die Haut und den Körper Wand in zwei Stufen, man aufpassen, nicht auf das Gewebe unter auftreffen.
7. Legen Sie eine Spreizer zum Halten der Bauchschnitt offen. Weisen die Schraubenanordnung zum Hinterende, um den Großteil der Klemme zu halten aus dem Weg.
8. Befeuchten Sie ein Quadrat von steriler Gaze mit Kochsalzlösung und legen Sie es über den Darm. Vorsichtig mit dem Finger auf die Gaze, legen Sie ein Wattestäbchen in den Darm und sanft spiegeln die Eingeweide über den side so sind sie auf der Gaze sitzen. Nehmen Sie ein Stück Gaze, legen Sie es auf den Darm und nass ist es mit Kochsalzlösung.
9. Entfernen Sie alle Fettgewebe bedeckt die Aorta und die Vena cava inferior (IVC). Seien Sie sanft. Die IVC ist sehr zerbrechlich.
10. Drücken Sie vorsichtig mit der Pinzette infrarenalen Aorta aus der IVC sezieren. Deaktivieren einer Fläche groß genug ist, um Platz für zwei Klemmen mit genügend Behälter zwischen ihnen bereitzustellen, so dass, wenn geteilte, noch genügend Schiffes, auf das Transplantat genäht werden kann. Wenn Sezieren für Gefäßästen aussehen. Ggf. kauterisieren sie mit einer niedrigen Temperatur cauterizer.
11. Legen Sie eine Gefäßklemme unterhalb der Nierenarterie und anderen ein knapp oberhalb der Bifurkation.
12. Schneiden Sie die Aorta. Die Enden der Aorta in der Regel zurückzuziehen, wobei ein Raum von etwa 5 mm. Überprüfen Sie für die Blutstillung. Wenn die Klammern richtig funktioniert, sollte nur eine kleine Menge von Blut nach dem Schnitt zu entkommen. Wenn die Blutung weiterhin besteht, überprüfen Sie die Klemmen um sicherzustellen, dass nichts ist, StörungenING mit ihnen. Beachten Sie, dass keiner der Aorta entfernt wird. Es ist lediglich unterteilt.
13. Spülen Sie die abgeschnittenen Enden mit heparinisierter Kochsalzlösung (200 U / ml) und entfernen Sie dann die zusätzliche Lösung mit einem Tupfer.
14. Tack das Transplantat in Platz mit drei diskontinuierliche Nähte an jedem Ende. Gerade Naht einer Seite der Anastomose an jedem Ende, und füllen Sie dann den Rest mit einem kontinuierlichen fortlaufenden Naht oder mehrere diskontinuierliche Nähten. Sieben bis acht diskontinuierlichen Fäden ausreichend ist. Wenn Sie eine fortlaufende Naht zu verwenden, sicher sein, dass die Gefäßwände entspannt bleiben und dass Sie verursachen keine Stenose an der Anastomose.
15. Entfernen Sie vorsichtig die Klemme am kranialen Ende und suchen Undichtigkeiten an den Nahtlinien. Eine kleine Menge des Sickerwassers ist OK sofern es stoppt innerhalb von etwa einer Minute. Wenn es mehr als das, ist es möglich, eine einzelne Masche verwenden, um die Blutung zu stoppen.
16. Sanft auf die Aorta oberhalb der Anastomose drücken Sie mit einem angefeuchteten Watteträger, und entfernen Sie dann die zweite Klemme. Drücken Sie vorsichtig undlösen ein paar Mal und prüfen, ob die Aorta Patent erscheint. Das Transplantat wird sofort durchblutet werden und ein Impuls sichtbar sein soll.
17. Entfernen Sie die Gaze bedeckt den Darm und verschieben Sie sie zurück an ihren Platz. Vermeiden Verdrehung des Darms und Erhaltung der normalen anatomischen Orientierung.
18. Schließen Sie die Muskulatur mit 5-0 Vicryl.
19. Schließen Sie die Haut mit 5-0 oder 6-0 Prolene.
20. Gönnen Sie die Maus subkutan mit carprophen bei 5 mg / kg zur Analgesie vor der Beendigung Anästhesie verstärken.
21. Geben Sie die Maus 0,5-0,8 ml Kochsalzlösung subkutan.
22. Platzieren Sie die Maus in einem beheizten Käfig zu erholen. Überwachen Sie es sorgfältig während der Wiederherstellung sicher sein, dass es in der Regel erholt. 2-3 Stunden nach der Operation sollten die Maus relativ normal zu verhalten. Nach 12 h post-op, behandeln das Tier mit Buprenorphin subkutan bei 2 mg / kg für die Analgesie. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt wird das Tier gebeugt, Lärm zu machen oder Ausstellen eines begrenzten Bereich der Bewegung, zu untersuchen das Problem. Wenneine definitive Ursache nicht festgestellt und behoben werden, sollte das Tier pro institutionellen Protokollen eingeschläfert werden. Nach 24 Stunden ist die Tier sollte eine weitere Dosis von carprophen subkutan erhalten bei 5 mg / kg. Hinterbein Lähmung zeigt eine fehlgeschlagene Anastomose oder einen Thrombus. In dieser Situation sollte das Tier eingeschläfert werden.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt ein Aortentransplantat. Die weißen Pfeile bezeichnen die Nahtlinien. Ein Patent Transplantat zeigt eine sichtbare Puls. Abbildung 2 zeigt einen typischen Experiment, in dem Empfänger Überlebens für einen Zeitraum von 56 Tagen verfolgt wurde. Eine Gruppe bestand aus Wildtyp (C57BL / 6 x FVB) Empfängermäuse mit BALB / c Aorta transplantiert. Die andere Gruppe mit der Bezeichnung "ko" besteht aus Empfänger (C57BL / 6 x FVB) defizient in der Expression von Hämoxygenase-1, die in Thrombosen der Transplantate in 24 Stunden führt. Insbesondere führt dies zum Absterben aller Empfänger wie in der Figur gezeigt. Abbildung 3 zeigt echo Messungen der IVC und abdominalen Aorta in einer normalen tierischen und bei einem Transplantatempfänger. Beachten Sie, dass das Transplantat-Patent und im Aussehen ähnlich dem nicht transplantierten Aorta ist.

Abbildung 1.Eine Ansicht einer transplantierten Aorta. Die weißen Pfeile bezeichnen die Nahtlinien.

Abbildung 2. Kaplan-Meier-Darstellungen von Überleben nach Aorten Transplantation in zwei Gruppen von Mäusen, die mit Aorta aus einer BALB / c-Maus transplantiert. "Ko" bezeichnet Empfängern defizient in der Expression von Hämoxygenase-1, die in der Aorta Thrombose Transplantate innerhalb von 24-48 h ergibt. "WT" bezeichnet die Wildtyp-Geschwister. Nachdruck aus: Kohlenmonoxid rettet Hämoxygenase-1-defizienten Mäusen von arterieller Thrombose bei allogener Aorten-Transplantation, Chen B, Guo L, Fan C, Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. 2009 Jul; 175 (1) :422-9 mit Genehmigung von Elsevier.

Figure 3. Echobildgebung der unteren Hohlvene (IVC) und abdominalen Aorta in vivo in einer normalen Maus (links) und in einer Aorta Transplantatempfängers (rechts). Die Bilder wurden mit einer VisualSonics Vevo 660 Urkunde. Sternchen bezeichnen die Lumen der Gefäße.

Discussion

Mausmodellen aortischen Transplantation bieten eine Reihe von Vorteilen, da Mäuse sehr gut immunogenetically ^9,12,13 definiert, und sie können leicht manipuliert werden, um ihre Expression spezifischer Gene zu verändern, falls gewünscht. Wie in der Einleitung erwähnt, ist der Gefäßchirurgie in der Maus schwieriger als die meisten Modelle aufgrund der Größe der Gefäße. Selbst die großen Arterien, wie der Aorta sind in der Regel nicht mehr als 100-200 um Innendurchmesser, so Manipulation dieser Schiffe erfordert eine erhebliche Menge an Geschicklichkeit und Fingerfertigkeit ^8,14. Die häufigste Komplikation bei dieser Operation von denen gerade erst an, das System zu implementieren beobachtete Hinterbein Lähmung, in der Regel durch eine Thrombose aus der Verletzung der Intima durch unsachgemäße Handhabung oder Klemmen verursacht. Die meisten der Klemmen von Unternehmen, die geeignete Werkzeuge zu verkaufen für die Mikrochirurgie vermarktet schaffen zu viel Druck auf für Mäuse verwendet werden, mit dem Druck in der Regel größer als 25 g / cm ^2. Die clamps die wir verwenden, glatt, mit einem Druck von 2 g / cm ^2, einem Druck, der gerade genug, um eine Hämostase zu erzielen und nicht beschädigen Behältern erzeugt. Einige Chirurgen bevorzugen Nahtmaterial anstatt Klemmen zu verwenden. Wir empfehlen nicht diese Praxis, weil es eine Methode, die in hohem Maße von der Fähigkeit des Chirurgen, um den richtigen Druck zu messen und aus unserer Sicht, kann auf eine niedrigere Erfolgsrate tragen ist. Mit etwas Übung sollte Überlebensrate von 90% oder besser rechnen.

Nahttechnik für die End-to-End-Anastomosen ist eine kritische Fähigkeit, die mit Erfahrung erworben wird. Je nach Vorerfahrung mit chirurgischen Techniken und manuelle Geschicklichkeit, kann die volle Kompetenz nach 50-100 Verfahren erreicht werden. Neuere Studien legen nahe, alternative Technologien für Anastomosen verfügbar sein werden in der Zukunft ^15.

Die wichtigste Einschränkung dieses Verfahrens ist, wie die meisten mikrochirurgische Eingriffe bei Mäusen, dass ein hohes Maß an Geschick istbenötigt für die erfolgreiche Ausführung und Einzelpersonen ohne exzellente Feinmotorik kann nie erreichen ein hohes Maß an Kompetenz. Doch mit der Praxis können die meisten Menschen eine akzeptable Überlebensrate. Die geringe Größe der Gewebe führt auch zu zusätzlichen Einschränkungen, weil die Größe des Transplantats ist sehr klein, so dass die Menge des Materials für eine nachfolgende Analyse erfolgt einschränkend. Der größte Vorteil des Modells ist die gut charakterisierte Immungenetik von Mäusen, die breite Verfügbarkeit von zahlreichen Inzuchtstämme, transgene Mäuse und Knockout-Mäusen, die für sehr nützliche Experimente zur molekularen Mechanismen in vivo adressieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240