Aortica trapianto ortotopico in Mouse per lo studio della malattia vascolare

Summary

Descriviamo una tecnica in cui viene trapiantato una sezione dell'aorta addominale di un topo ortotopicamente a appena sotto le arterie renali di un destinatario allogenici o singenici. Questa tecnica può essere utile in studi in cui si considera il trapianto di grandi arterie di dimensioni uniformi vantaggiosa.

Abstract

Procedure vascolari coinvolgono anastomosi nel topo sono generalmente considerati difficili e fortemente dipendente dalla abilità del chirurgo individuale. Questo è in gran parte vero, ma ci sono un certo numero di principi importanti che possono ridurre la difficoltà di queste procedure e migliorare la riproducibilità. Trapianto ortotopico aortica è una procedura eccellente per imparare questi principi perché si tratta di solo due end-to-end anastomosi, ma richiede una buona tecnica di sutura e la gestione delle navi per il successo costante. Questa procedura inizia con l'acquisto di una lunghezza dell'aorta addominale da un donatore, seguita dalla divisione della aorta nativa nel ricevente. L'aorta procurato viene poi collocato tra le estremità divise dell'aorta destinatario e suturato in posizione usando end-to-end anastomosi. Per raggiungere questo obiettivo richiede con successo un elevato grado di concentrazione, buoni strumenti, una mano ferma e un apprezzamento di quanto facilmente ilvascolare di un mouse può essere danneggiato, causando trombosi. Imparare questi importanti principi è quello che occupa la maggior parte del tempo il principiante quando si impara microchirurgia in piccoli roditori. In questo protocollo, si fa riferimento a questi punti importanti. Questo modello può essere usato per studiare la malattia vascolare in una varietà di differenti sistemi sperimentali ^1-8. Nel contesto qui illustrato, è più spesso utilizzato per lo studio di post-trapianto malattia vascolare, una comune complicanza a lungo termine del trapianto di organo solido in cui iperplasia intimale si verifica all'interno del allotrapianto. Il vantaggio principale del modello è che facilita quantitative analisi morfometriche e la nave trapiantato giace contigua alla nave endogeno, che può servire come un ulteriore controllo ^9. La tecnica qui illustrato è più spesso utilizzato per i topi pesano 18-25 grammi. Abbiamo accumulato la maggior parte della nostra esperienza con il C57BL/6J, BALB / CJ, e ceppi C3H/HeJ.

Protocol

1. Preparazione prechirurgica

1. Le procedure chirurgiche, non importa quanto fatto con attenzione, portano a notevole stress. Per ridurre al minimo gli effetti dello stress e tale da massimizzare le riserve, gli animali dovrebbero essere mantenute nel vivaio per almeno 72 ore prima dell'uso ^10,11.
2. Strumenti chirurgici, garze e tamponi devono essere sterili. Non è necessario usare guanti sterili forniscono solo le punte della sutura tocco strumenti o il campo operatorio.
3. Per emostasi, è imperativo che le pressioni di serraggio sono il minimo necessario. Danni alla nave a causa della pressione eccessiva o un trasporto sicuro provoca trombosi, con conseguente paralisi della gamba posteriore-, ischemia intestinale, e la morte entro 24 ore. Abbiamo trovato che usando morsetti con una pressione non superiore a 2 g / cm ² elimina il problema. Questi morsetti sono indicati nella tabella 1. Pressioni di serraggio sono indicate nelle specifiche per pinze fatte da strumentazione di alta qualità chirurgicit produttori. Abbiamo scoperto che i morsetti a buon mercato o morsetti monouso universalmente esercitare una pressione eccessiva.
4. La posizione dei vasi collaterali nonché le posizioni relative della aorta addominale e la vena cava inferiore (IVC) sono ceppo dipendenti. Troverete anche piccole variazioni tra singoli topi, in particolare la posizione di vasi collaterali.

2. Donatori di funzionamento

1. Topi possono essere anestetizzato con isoflurano (induzione 1,5-2,5%, 1,0% di manutenzione in aria) o con pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital impone un limite di tempo (fino a 1,5 ore), ma fornisce al chirurgo la possibilità di ruotare l'animale per un migliore accesso, se desiderato. Tempo di anestesia può essere esteso fino a 2 hr mettendo 2-3 gocce di anestetico quando necessario sul intestino o fegato durante l'intervento chirurgico. Ketamina / xilazina (100 mg / kg di peso corporeo per chetamina e 7 mg / kg per TMA, ip) può essere utilizzato anche da ben addestrati chirurghi che can completare la procedura entro 1 o 1,5 ore, ma ha una gamma più ristretta sicuro dosi. Negli Stati Uniti, l'uso di pentobarbital è diventato più problematico in questi ultimi anni a causa di forniture brevi. È indispensabile che la profondità dell'anestesia essere monitorati per essere certi che sia sufficiente. La punta-pinch riflesso è il migliore indicatore di profondità adeguata, ma si deve anche notare il tasso di respirazione e di altri movimenti come bene.
2. Dopo l'induzione dell'anestesia, utilizzare un gel depilatori o di un rasoio per eliminare i peli sull'addome ventrale.
3. Montare l'animale sul tavolo operativo con del nastro di laboratorio per tenerlo in una posizione a gambe divaricate. A bordo operativo metallica permette l'utilizzo di un cuscinetto riscaldante sotto per fornire supporto temperatura durante l'intervento chirurgico. Abbiamo controllare manualmente la temperatura della piastrina riscaldante, che è un tipo consumer unità per uso domestico. La temperatura viene mantenuta tra 35-38 °. Il consiglio operativo metallico è anche facile da sterilizzare tra le procedure.
4. Disinfettare la zona con un disinfettante come clorexidina, seguita da un lavaggio con etanolo. Ripetere questa procedura per tre volte, per assicurare una adeguata disinfezione. Questo sarà anche rimuovere eventuali pezzi tagliati residui di capelli, se presente.
5. Utilizzando le forbici praticare un'incisione attraverso la parete del corpo per esporre i visceri addominali.
6. Usare un tampone di cotone, spingere i visceri di lato per esporre i grossi vasi dell'addome. Le viscere sono posti su un pezzo di garza che viene bagnata con soluzione salina calda per mantenerlo umido.
7. Utilizzando scollamento, molto attentamente sezionare l'aorta addominale lontano dal tessuto circostante. Fare molta attenzione nel sezionare la nave lontano dalla vena cava inferiore. Ci saranno uno o più rami, come ad esempio l'arteria lombare, che devono essere accuratamente sollevati ed cauterizzato. La sezione di aorta sezionato dovrebbe essere inferiore ai vasi renali e sopra la biforcazione dell'aorta nelle arterie femorali. Questa sezione può servire come materiale donatore per il maggior numero dis due destinatari, a seconda di quante ramificazione navi esistono e la dimensione dell'animale donatore.
8. Legare una sutura appena sotto le arterie renali e l'altra appena sopra la biforcazione. Forbici utilizzando dividono l'aorta, lavare completamente l'innesto con soluzione salina contenente 200 U / ml di eparina. Attentamente tenere una estremità del vaso e gocciolare la soluzione salina in modo che scorra attraverso il recipiente per gravità. Non lasciare bolle d'aria correre attraverso il vaso. Gestire le estremità della nave il meno possibile altrimenti l'intima può essere danneggiato causando trombosi tardi. Toglierlo dal campo e subito riporlo in un contenitore di soluzione salina ghiacciata. Lasciare l'animale donatore exsanguinate.

3. Destinatario di funzionamento

1. Anestetizzare l'animale di cui sopra e applicare un gel depilatori o utilizzare un rasoio per eliminare i peli sull'addome. Appena prima della incisione abbiamo somministrare una dose di buprenorfina per via sottocutanea a 0,1 mg / kg per stabilire analgesia.
2. Mim porto l'animale sul campo operatorio con del nastro di laboratorio. L'animale deve essere montato su una fase operativa calda che aiuta a mantenere la temperatura corporea durante il funzionamento.
3. Applicare una pomata oftalmica gentamicina per gli occhi per evitare che si secchi.
4. Disinfettare l'addome, seguito da un lavaggio con etanolo. Ripetere questa procedura per tre volte, per assicurare una adeguata disinfezione.
5. Verificare l'adeguatezza dell'anestesia nuovamente prima di procedere alla fase successiva.
6. Effettuare una incisione mediana attraverso la pelle e la parete del corpo in due fasi, facendo attenzione a non ledere i tessuti sottostanti.
7. Inserire un divaricatore per tenere l'incisione addominale aperta. Puntare il gruppo vite verso l'estremità posteriore per mantenere la maggior parte del morsetto di mezzo.
8. Bagnare un quadrato di garza sterile con soluzione salina e metterla sopra l'intestino. Con il dito delicatamente sulla garza, inserire un tampone di cotone sotto gli intestini e delicatamente riflettono l'intestino verso il side in modo che siano seduti in cima alla garza. Prendi un altro pezzo di garza, appoggiarlo su intestini e bagnare con soluzione fisiologica.
9. Rimuovere il tessuto adiposo che copre l'aorta e la vena cava inferiore (IVC). Sii gentile. L'IVC è molto fragile.
10. Delicatamente usare il forcipe per sezionare l'aorta sottorenale dal IVC. Cancellare un'area sufficientemente grande da fornire spazio per due pinze con vaso abbastanza tra di loro in modo tale che, se diviso, ci sarà abbastanza recipiente cui l'innesto può essere suturata. Quando dissezione, cercare rami dei vasi. Se necessario li cauterizzare con un cauterizer bassa temperatura.
11. Inserire una pinza vascolare appena sotto l'arteria renale e un altro appena sopra la biforcazione.
12. Tagliare l'aorta. Le estremità dell'aorta solitamente ritrae, lasciando uno spazio di circa 5 mm. Verificare la presenza di emostasi. Se le pinze funzionano correttamente, solo una piccola quantità di sangue deve fuoriuscire dopo il taglio. Se l'emorragia continua, controllare i morsetti per essere non ci sia nulla interferenzezione con loro. Notare che nessuna delle aorta viene rimossa. È semplicemente diviso.
13. Sciacquare le estremità tagliate con soluzione fisiologica eparinizzata (200 U / ml) e quindi rimuovere la soluzione in più con un tampone.
14. Tack l'innesto in posizione con tre punti di sutura discontinui a ciascuna estremità. Solo suturare un lato della anastomosi a ciascuna estremità, e quindi compilare il resto con una sutura continua in esecuzione o più suture discontinui. Sette-otto punti di sutura discontinui è sufficiente. Se si utilizza una sutura continua, assicurarsi che le pareti dei vasi rimanere rilassato e che non causano stenosi dell'anastomosi.
15. Attenzione rimuovere il morsetto alla fine cranica e cercare le perdite alle linee di sutura. Una piccola quantità di infiltrazione è bene fornire al suo arresto nel giro di circa un minuto. Se vi è più di questo, è possibile utilizzare un singolo punto per fermare l'emorragia.
16. Premere delicatamente sulla aorta al di sopra del sito di anastomosi con un applicatore di cotone bagnato, e quindi rimuovere il secondo morsetto. Premere delicatamente erilasciare un paio di volte e controllare che l'aorta appare brevetto. L'innesto saranno perfusi immediatamente un impulso deve essere visibile.
17. Rimuovere la garza che copre gli intestini e spostarli in posizione. Evitare di torsione dell'intestino e mantenere normale orientamento anatomico.
18. Chiudere lo strato muscolare con Vicryl 5-0.
19. Chiudere la pelle con 5-0 o 6-0 prolene.
20. Trattare il mouse per via sottocutanea con carprophen a 5 mg / kg per aumentare analgesia prima di terminare l'anestesia.
21. Dare il 0,5-0,8 ml di soluzione salina per via sottocutanea del mouse.
22. Posizionare il mouse in una gabbia riscaldata per recuperare. Monitorare con attenzione durante il recupero per essere sicuri che si sta riprendendo normalmente. 2-3 ore dopo l'intervento chirurgico, il mouse dovrebbe essere relativamente comportarsi normalmente. A 12 ore dopo l'intervento, trattare l'animale con buprenorfina per via sottocutanea a 2 mg / kg per l'analgesia. Se, in qualsiasi momento, l'animale è curvo, facendo rumore o che presenta una gamma limitata di movimento, studiare il problema. Seuna causa definitiva non possono essere definiti e stabiliti, l'animale deve essere eutanasia per i protocolli istituzionali. A 24 ore l'animale deve ricevere un'altra dose di carprophen sottocutanea a 5 mg / kg. Paralisi delle zampe posteriori indica una anastomosi fallito o un trombo. In questa situazione, l'animale deve essere eutanasia.

Representative Results

La figura 1 mostra una protesi aortica. Le frecce bianche indicano le linee di sutura. Un innesto brevetto mostra un impulso visibile. Figura 2 indica un tipico esperimento in cui è seguita la sopravvivenza destinatario per un periodo di 56 giorni. Un gruppo costituito da topi riceventi wild-type (C57BL / 6 x FVB) trapiantati con BALB / c aorta. L'altro gruppo, designato "KO" consiste di destinatari (C57BL / 6 x FVB) carenti nell'espressione di eme ossigenasi-1, che comporta trombosi degli innesti in 24 ore. In particolare, il risultato è la morte di tutti i destinatari, come mostrato nella figura. Figura 3 mostra echo misurazioni della IVC e dell'aorta addominale in un animale normale e in un ricevente il trapianto. Si noti che l'innesto è brevetto e di aspetto simile alla non-trapianto dell'aorta.

Figura 1.Una vista di una aorta trapiantato. Le frecce bianche indicano le linee di sutura.

Figura 2. Kaplan-Meier raffigurazioni di sopravvivenza dopo trapianto aortica in due gruppi di topi trapiantati con aorta da un topo BALB / c. "KO" designa destinatari carenti nell'espressione di eme ossigenasi-1, che comporta trombosi degli innesti aortici entro 24-48 ore. "WT" designa le wild-type cucciolata. Ristampato da: Monossido di carbonio salva eme ossigenasi-1-carente topo da trombosi arteriosa in allogenico aortica trapianto, Chen B, Guo L, Ventilatore C, Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. 2009, 175 (1) :422-9 con il permesso di Elsevier.

Figure 3. Echo imaging della vena cava inferiore (IVC) e aorta addominale in vivo in un topo normale (pannello di sinistra) e in un ricevente di trapianto aortico (pannello destro). Le immagini sono state prodotte con strumento VisualSonics Vevo 660. Asterischi indicano il lume dei vasi.

Discussion

Modelli murini di trapianto aortica forniscono una serie di vantaggi poiché i topi sono molto ben definiti immunogenetically ^9,12,13, e possono essere facilmente manipolati per alterare l'espressione di geni specifici, se desiderato. Come accennato nell'introduzione, chirurgia vascolare nel topo è più difficile che maggior parte dei modelli a causa delle dimensioni delle navi. Anche i grandi arterie, come l'aorta sono di solito non più di 100-200 micron di diametro interno, così manipolando questi vasi richiede una notevole quantità di abilità e destrezza ^8,14. La complicanza più comune osservata in questo tipo di chirurgia da quelli appena iniziato ad implementare il sistema è posteriore-paralisi delle gambe, di solito causata da trombosi a seguito di lesioni di intima da uso improprio o di bloccaggio. La maggior parte delle pinze commercializzati da aziende che vendono strumenti adatti per microchirurgia creare troppa pressione da utilizzare per i topi, con pressioni di solito superiori a 25 g / cm ^2. Il claMPS usiamo sono lisce, con una pressione di 2 g / cm ^2, una pressione che è appena sufficiente per ottenere l'emostasi e non danneggiare i vasi. Alcuni chirurghi preferiscono utilizzare sutura piuttosto che pinze. Non si consiglia questa pratica perché è un metodo che è fortemente dipendente dalla capacità del chirurgo per misurare la pressione corretta e, a nostro avviso, può contribuire ad un tasso di successo inferiore. Con la pratica, i tassi di sopravvivenza del 90% o superiore dovrebbe essere previsto.

Sutura tecnica per gli end-to-end anastomosi è una capacità critica che si acquisisce con l'esperienza. A seconda del precedente esperienza con le tecniche chirurgiche e destrezza manuale, competenza completa può essere raggiunta dopo 50-100 procedure. Studi più recenti suggeriscono tecnologie alternative per anastomosi possono diventare disponibili in futuro ^15.

Il limite principale di questa procedura è, come la maggior parte delle procedure di microchirurgia nei topi, che un alto livello di abilità ènecessario per l'esecuzione di successo e gli individui, senza eccellenti capacità motorie non può mai raggiungere un elevato livello di conoscenza della lingua. Tuttavia, con la pratica, la maggior parte delle persone possono ottenere un tasso accettabile di sopravvivenza. La piccola dimensione dei tessuti comporta anche ulteriori vincoli perché la dimensione dell'innesto è molto piccola, quindi la quantità di materiale per la successiva analisi è limitante. Il più grande vantaggio di questo modello è il immunogenetica ben caratterizzati di topi, l'ampia disponibilità di numerosi ceppi inbred, topi transgenici e topi knockout, consentendo esperimenti molto utili per affrontare i meccanismi molecolari in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240