Orthotopic Aorta Transplantasjon i Mus for studiet av vaskulær sykdom

Summary

Vi beskriver en teknikk der en seksjon av abdominal aorta fra en mus er transplantert orthotopically til like under de renale arterier i en allogen eller syngeneic mottaker. Denne teknikken kan være nyttig i studier hvor transplantasjon av store arterier av lik størrelse anses fordelaktig.

Abstract

Vaskulære prosedyrer som involverer anastomoser i musen er generelt antatt å være vanskelig og svært avhengig dyktighet av enkelte operatør. Dette er i stor grad sant, men det er en rekke av viktige prinsipper som kan redusere vanskeligheten av disse rutinene og forbedre reproduserbarheten. Orthotopic aorta transplantasjon er en utmerket prosedyre der for å lære disse prinsippene fordi det innebærer bare to ende-til-ende anastomoser, men krever god suturing teknikk og håndtering av fartøyene for konsekvent suksess. Denne prosedyren begynner med anskaffelse av en lengde av abdominal aorta fra en donor dyr, fulgt av delingen av de innfødte aorta i mottakeren. Den anskaffet aorta plasseres deretter mellom de delte ender av mottakerens aorta og sutureres på plass ved hjelp av ende-til-ende anastomoser. For å oppnå dette målet vellykket krever en høy grad av konsentrasjon, gode verktøy, en stødig hånd, og en styrking av hvor lettvaskulatur av en mus kan bli skadet, noe som resulterer i trombose. Lære disse viktige prinsippene er hva opptar det meste av nybegynner tid når man lærer mikrokirurgi i små gnagere. Gjennom denne protokollen, henviser vi til disse viktige punktene. Denne modellen kan brukes til å studere vaskulær sykdom i en rekke forskjellige eksperimentelle systemer ^1-8. I sammenheng vist her, er det oftest brukt for studiet av post-transplantasjon vaskulær sykdom, en felles langsiktig komplikasjon av organtransplantasjon der intimal hyperplasi oppstår innenfor allograft. Den primære fordelen med den modellen er at det letter kvantitative morfometriske analyser og transplanterte fartøyet ligger tilstøtende til den endogene fartøyet, som kan tjene som en ekstra kontroll ^9. Teknikken som vises her er oftest brukt for mus veier 18-25 gram. Vi har samlet de fleste av vår erfaring med C57BL/6J, BALB / CJ, og C3H/HeJ stammer.

Protocol

1. Presurgical Forberedelse

1. Kirurgiske prosedyrer, uansett hvor nøye gjort, fører til betydelig stress. For å minimere virkningene av slik belastning og for å maksimere reserver, bør dyrene holdes i vivarium minst 72 timer før bruk ^10,11.
2. Kirurgisk verktøy, gasbind, og vattpinner må være sterile. Det er ikke nødvendig å bruke sterile hansker tilby bare tuppene av instrumenter berøring sutur eller operative feltet.
3. For hemostase, er det viktig at clamping presset er minimum nødvendig. Skade på fartøyet på grunn av overdrevent trykk eller røff behandling vil forårsake trombose, som resulterer i bakben ben lammelse, tarm ischemi, og død innen 24 hr. Vi har funnet at bruk klemmer med et trykk ikke mer enn 2 g / cm ² eliminerer problemet. Disse klemmene er nevnt i tabell 1. Clamp presset er angitt i spesifikasjonene for klemmer laget av høykvalitets kirurgiske instrut produsenter. Vi har funnet ut at billig klemmer eller engangs klemmer universelt øve for mye press.
4. Plasseringen av kollaterale kar samt relative plasseringer av den abdominale aorta og vena cava inferior (IVC) er stamme avhengige. Du vil også finne små variasjoner mellom individuelle mus, spesielt i plasseringen av kollaterale kar.

2. Donor Drift

1. Mus kan være bedøvet med isofluran (1,5-2,5% induksjon, 1,0% vedlikehold i luft) eller med pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital pålegger en tidsbegrensning (opptil 1,5 timer), men gir kirurgen med alternativet av roterende dyret for bedre tilgang, om ønsket. Anestesi tid kan forlenges opp til 2 hr ved å plassere 2-3 dråper av bedøvelse ved behov på tarmen eller leveren under operasjonen. Ketamin / xylazin (100 mg / kg kroppsvekt for Ketamin og 7 mg / kg for xylazin, ip) kan også brukes av veltrente kirurger som can fullføre innen 1 til 1,5 time, men det har en smalere trygg doseområde. I USA, har bruken av pentobarbital blitt mer problematisk i de senere årene på grunn av korte forsyninger. Det er avgjørende at anestesidybden overvåkes for å være sikker på at det er tilstrekkelig. Tåen-pinch refleks er den beste indikatoren på tilstrekkelig dybde, men en bør også merke pusterytme og andre bevegelser i tillegg.
2. Etter anestesi induksjon, bruke det riktige gel eller en barbermaskin å fjerne hår på ventral magen.
3. Monter dyret på operasjonsbordet bord ved hjelp av laboratoriet tape til å holde det i et oppslag-eagled posisjon. En metallisk Ruten bord tillater bruk av en varmepute under den for å gi temperatur støtte under operasjonen. Vi manuelt styre temperaturen varmeputen, som er en forbruker-grade enhet for hjemme-bruk. Temperaturen opprettholdes mellom 35-38 °. Den metalliske drift Styret er også lett å sterilisere mellom prosedyrer.
4. Desinfisere området med et desinfeksjonsmiddel som klorheksidin, etterfulgt av en etanol vask. Gjenta denne fremgangsmåten tre ganger, for å sikre tilstrekkelig desinfeksjon. Dette vil også fjerne eventuelle rester snitt biter av hår, hvis det finnes.
5. Bruke saks gjøre et snitt gjennom kroppen veggen for å avsløre abdominal viscera.
6. Bruk en bomullspinne, trykk i magen til siden for å avsløre de store fartøyene i magen. Innvoller er plassert på et stykke av gasbind som er fuktet med varmt saltvann å holde det fuktig.
7. Ved hjelp av stump disseksjon, veldig nøye dissekere abdominal aorta bort fra omkringliggende vev. Vær svært forsiktig i dissekere skipet vekk fra den mindreverdige vena cava. Det vil være en eller flere grener, som lumbar arterien, som må være nøye løftes og cauterized. Den delen av dissekert aorta bør være under de renale fartøyene og over bifurkasjonen av aorta i de femorale arterier. Denne delen kan tjene som donor materiale for så manges to mottakere, avhengig av hvor mange forgrening fartøyer eksisterer og størrelsen av donor dyret.
8. Knyt en sutur rett under nyrearteriene og en annen like over bifurkasjon. Bruke saks dele aorta, fullt skyll graftet med saltvann inneholdende 200 U / ml heparin. Svært nøye hold ene enden av fartøyet og dryppe den saltholdige løsningen slik at den renner gjennom beholderen ved hjelp av tyngdekraften. Ikke la luftbobler kjøre gjennom karet. Håndter endene av skipet så lite som mulig ellers intima kan skades resulterer i trombose senere. Fjern den fra feltet og umiddelbart plassere den i en beholder med iskald saltvann. La donor dyr til exsanguinate.

3. Mottaker Drift

1. Anesthetize dyret som ovenfor og bruke en hårfjerningskrem gel eller bruke en barbermaskin til å fjerne hår på magen. Like før innsnittet vi administrere en dose av buprenorfin subkutant ved 0,1 mg / kg for å etablere analgesi.
2. Mount dyret på operasjonsbordet feltet ved hjelp av laboratoriet tape. Dyret skal monteres på en varm brukstiden som vil bidra til å opprettholde kroppstemperaturen under operasjonen.
3. Påfør gentamycin ophthalmic sårsalve til øynene for å hindre dem fra å tørke ut.
4. Desinfisere magen, etterfulgt av en etanol vask. Gjenta denne fremgangsmåten tre ganger, for å sikre tilstrekkelig desinfeksjon.
5. Sjekk tilstrekkeligheten av anestesi igjen før du går videre til neste trinn.
6. Gjør en midtlinjesnitt gjennom huden og kroppen veggen i to etapper, være forsiktig med å støte på vev under.
7. Sett inn en sprederen å holde abdominal snitt åpen. Pek skruen montering mot bakenden for å holde mesteparten av klemmen ut av veien.
8. Fukt en firkant med steril kompress med saltvann og legg den over i tarmen. Med fingeren forsiktig på gasbind, sette inn en bomullspinne under tarmen og forsiktig reflektere tarmen over til side så de sitter på toppen av gasbind. Ta et stykke gasbind, plassere den på tarmen og våt det med saltvann.
9. Fjern eventuelle fettvev som dekker aorta og vena cava inferior (IVC). Være forsiktig. Den IVC er svært skjøre.
10. Forsiktig bruk tang å dissekere infrarenal aorta fra IVC. Slett et areal stort nok til å gi plass til to klemmer med nok fartøy mellom dem slik at når delt, vil det være nok fartøy som graftet kan sutureres. Når dissekere, se etter fartøy grener. Om nødvendig cauterize dem med en lav temperatur cauterizer.
11. Sett inn en vaskulær klemme like under nyrearteriestenose og en annen like over bifurkasjon.
12. Kutt aorta. Endene av aorta vil vanligvis trekke, forlater et mellomrom på omtrent 5 mm. Sjekk for hemostase. Hvis klemmene arbeider riktig, bør bare en liten mengde blod flykte etter kuttet. Hvis blødningen fortsetter, sjekk at klemmene for å være sikker på at ingenting er interferensing med dem. Merke seg at ingen av aorta fjernes. Det er bare oppdelt.
13. Skyll kuttet endene med heparinisert saltvann (200 U / ml) og deretter fjerne den ekstra oppløsningen med en bomullspinne.
14. Tack pode på plass ved hjelp av tre usammenhengende sting i hver ende. Bare suture en side av anastomosen i hver ende, og deretter fylle resten med en kontinuerlig kjøring sutur eller mer diskontinuerlige suturer. Syv til åtte diskontinuerlige suturer er tilstrekkelig. Hvis du bruker en løpende sutur, vær sikker på at fartøyet vegger forblir avslappet og at du ikke forårsaker stenose på anastomose.
15. Fjern forsiktig klemmen på kraniale enden og se etter lekkasjer på suture linjene. En liten mengde av sigevann er OK å gi det stopper innen ca et minutt. Hvis det er mer enn det, er det mulig å bruke en enkelt søm for å stoppe blødningen.
16. Klem forsiktig på aorta over anastomosestedet med en fuktet bomull applikator, og deretter fjerne den andre klemmen. Trykk forsiktig ogslipper et par ganger, og kontroller at aorta vises patent. Transplantasjonen blir perfused umiddelbart og en puls skal være synlig.
17. Fjerne gasbind dekker tarmen og flytte dem tilbake på plass. Unngå vridning av tarmen og opprettholde normal anatomisk orientering.
18. Lukk muskel lag med 5-0 Vicryl.
19. Lukk huden ved hjelp av 5-0 eller 6-0 prolene.
20. Unn musen subkutant med carprophen ved 5 mg / kg for å øke analgesi før terminerende anestesi.
21. Gi musen 0.5 til 0.8 ml saltvann subkutant.
22. Plasser musen i en oppvarmet bur å gjenopprette. Overvåke det nøye under utvinning for å være sikker på at det er på bedringens normalt. 2-3 timer etter operasjonen, bør musen skal oppføre relativt normalt. Ved 12 timers post-op, behandle dyret med buprenorfin subkutant ved 2 mg / kg for analgesi. Hvis det på noe tidspunkt, er dyret bøyd, noe som gjør støy eller stille et begrenset utvalg av bevegelse, undersøke problemet. Hvisen definitiv årsak ikke kan etableres og fast, bør dyret avlives per institusjonelle protokoller. Ved 24 timer ble dyret skal motta en annen dose av carprophen subkutant ved 5 mg / kg. Bakben lammelse indikerer en mislykket anastomose eller en trombe. I denne situasjonen bør dyret avlives.

Representative Results

Figur 1 viser en pulsåretransplantasjonen. De hvite pilene betegne suture linjene. Et patent pode viser en synlig puls. Fig. 2 indikerer et typisk eksperiment hvor mottaker overlevelse ble fulgt i en periode på 56 dager. En gruppe besto av vill-type (C57BL / 6 x FVB) mottaker mus transplantert med BALB / c aorta. Den andre gruppen, betegnet "KO" består av mottakere (C57BL / 6 x FVB) mangelfull i uttrykk av heme oxygenase-1, noe som resulterer i trombose av grafts innen 24 timer. Spesielt, dette resulterer i død av alle mottakere, som vist i figuren. Figur 3 viser echo målinger av IVC og abdominal aorta i en normal dyr og i en transplantasjon mottaker. Merk at transplantatet er patent og ligner på det ikke-transplanterte aorta.

Figur 1.En visning av et transplantert aorta. De hvite pilene betegne suture linjene.

Figur 2. Kaplan-Meier fremstillinger av overlevelse etter aorta transplantasjon i to grupper av mus transplantert med aorta fra en BALB / c mus. "KO" betegner mottakerne mangelfull i uttrykket av heme oksygenase-1, noe som resulterer i trombose av aorta grafts innen 24-48 timer. "WT" betegner villtype kullsøsken. Gjengitt fra: Karbonmonoksid redder heme oxygenase-1-mangelfull mus fra arteriell trombose i allogen aorta transplantasjon, Chen B, Guo L, Fan C, Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. 2009 Jul; 175 (1) :422-9 med tillatelse fra Elsevier.

Figure 3. Echo avbildning av mindreverdige vena cava (IVC) og abdominal aorta in vivo i en normal mus (venstre panel) og i en aorta transplantasjon mottaker (høyre panel). Bildene ble produsert med en Visualsonics Vevo 660 instrument. Asterisker betegne lumen av skipene.

Discussion

Musemodeller av aorta transplantasjon gir en rekke fordeler fordi mus er svært godt definert immunogenetically ^9,12,13, og de ​​kan lett manipuleres til å endre sitt uttrykk av spesifikke gener, om ønskelig. Som nevnt i innledningen, er vaskulær kirurgi hos mus vanskeligere enn de fleste modeller på grunn av størrelsen av skipene. Selv store arterier, som aorta er vanligvis ikke mer enn 100 til 200 mikrometer i indre diameter, så manipulere disse fartøyene krever en betydelig mengde av dyktighet og fingerferdighet ^8,14. Den vanligste komplikasjonen observert i denne operasjonen av de akkurat begynt å implementere systemet er hind ben lammelse, vanligvis forårsaket av trombose som følge av skade på intima av tøff behandling eller fastspenning. De fleste av de klemmer som markedsføres av selskaper som selger verktøy egnet for mikrokirurgi lage for mye press å bli brukt for mus, med press vanligvis større enn 25 g / cm ^2. CLAMPS vi bruker er glatt, med et trykk på 2 gm / cm ^2, et trykk som er akkurat nok til å stoppe blødninger og ikke skade skipene. Noen kirurger foretrekker å bruke sutur fremfor klemmer. Vi anbefaler ikke denne praksisen fordi det er en metode som er svært avhengig av evnen til kirurgen for å måle riktig trykk og etter vårt syn, kan bidra til en lavere suksessrate. Med praksis, bør overlevelse på 90% eller bedre kan forventes.

Suturing teknikk for ende-til-ende anastomoser er en kritisk ferdighet som er ervervet med erfaring. Avhengig tidligere erfaring med kirurgiske teknikker og fingerferdighet, kan hele ferdigheter oppnås etter 50-100 prosedyrer. Nyere studier tyder på alternative teknologier for anastomoser kan bli tilgjengelig i fremtiden ^15.

Den primære begrensning med denne prosedyren er, som de fleste mikrokirurgiske prosedyrer i mus, at en høy grad av dyktighet ernødvendig for en vellykket gjennomføring og enkeltpersoner uten gode motoriske ferdigheter kan aldri oppnå en høy grad av profesjonalitet. Men med praksis, kan de fleste individer oppnå en akseptabel overlevelse. Den lille størrelsen av vevene resulterer også i ytterligere begrensninger fordi størrelsen av graftet er svært liten, slik at mengden av materiale for senere analyse er begrensende. Den største fordelen med modellen er de godt karakteriserte immunogenetics av mus, den store tilgjengeligheten av mange innavlede stammer, transgene mus og knockout mus, noe som åpner for svært nyttige eksperimenter for å ta molekylære mekanismer in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240