Summary
Мы описываем технику, в которой часть брюшной аорты от мыши пересаживается ортотопически чуть ниже почечных артерий в аллогенных и сингенных получателя. Эта техника может быть полезна в исследованиях, в которых трансплантация крупных артерий одинакового размера считается выгодным.
Abstract
Сосудистые процедур, связанных с анастомозов у мыши, как правило, считается трудным и в значительной степени зависит от мастерства отдельных хирурга. В значительной степени это верно, но есть ряд важных принципов, которые могут уменьшить сложность этих процедур и повышения воспроизводимости. Ортотопической трансплантации аорты является отличной процедурой, в которой для изучения этих принципов, потому что она включает в себя только два конца в конец анастомоза, но требует хорошей техникой наложения швов и обработки судов для последовательного успеха. Эта процедура начинается с закупки длина брюшной аорты от донора животных, с последующим разделением родной аорты у получателя. Закупаются аорты помещается между разделенными концами получателя аорты и пришивается на место с помощью конца в конец анастомозов. Для достижения этой цели успешно требует высокой степени концентрации, хорошие инструменты, твердая рука, и понимание того, как легкососудистой мыши могут быть повреждены, в результате тромбоза. Изучение этих важных принципов является то, что занимает большую часть времени начинающих при изучении микрохирургии в мелких грызунов. На протяжении всего этого протокола, мы говорим об этих важных моментах. Эта модель может быть использована для изучения сосудистых заболеваний в различные экспериментальные системы 1-8. В контексте показанный здесь, это наиболее часто используется для изучения после трансплантации сосудистых заболеваний, общих долгосрочных осложнений твердых трансплантации органов, в которых гиперплазии интимы происходит в аллотрансплантата. Основным преимуществом модели является то, что она облегчает количественный анализ морфометрических и пересаженные судно лежит прилегающих к эндогенным судна, которое может служить в качестве дополнительного контроля 9. Техника показано здесь чаще всего используется для мышей весом 18-25 граммов. Мы накопили большую часть нашего опыта использования C57BL/6J, BALB / CJ, и C3H/HeJ штаммов.
Protocol
1. Предоперационной подготовки
- Хирургические процедуры, независимо от того, насколько тщательно сделано, приводит к значительному стрессу. Чтобы свести к минимуму последствия такого стресса и увеличить запасы, животные должны содержаться в виварии, по крайней мере 72 часа перед использованием 10,11.
- Хирургические инструменты, марля, и тампоны должны быть стерильными. Это не обязательно использовать стерильные перчатки обеспечение только кончики шва инструментов прикосновение или операционного поля.
- Для гемостаза, крайне важно, чтобы зажимное давление минимально необходимых. Повреждения судна из-за чрезмерного давления или грубое обращение будет вызывать тромбозы, в результате чего задние ноги паралич, ишемия кишечника, и смерти в течение 24 часов. Мы обнаружили, что с помощью зажимов с давлением не более 2 г / см 2 устраняет проблему. Эти зажимы, указанных в таблице 1. Зажим давление указано в спецификации для зажимов сделаны высокого качества хирургических инструментальныхт производителями. Мы обнаружили, что недорогие одноразовые зажимы или хомуты универсально оказывают слишком большое давление.
- Расположение обеспечения судов, а также относительного расположения брюшной аорты и нижней полой вены (НПВ) являются деформации зависит. Вы также найдете небольшие различия между отдельными мышей, особенно в том месте, коллатеральных сосудов.
2. Донор операции
- Мыши могут быть наркозом изофлураном (1.5-2.5% индукции, 1,0% содержания в воздухе) или с фенобарбиталом (55-65 мг / кг). Пентобарбитала накладывает срок (до 1,5 часов), но и обеспечивает хирургу с возможностью поворота животных для лучшего доступа, если требуется. Анестезия время может быть продлено до 2 часов, помещая 2-3 капли анестетика при необходимости на кишечнике и печени во время операции. Кетамин / ксилазина (100 мг / кг массы тела в течение кетамин и 7 мг / кг для Ксилазин, ф) также может быть использована хорошо подготовленных хирургов, которые окп завершить процедуру пределах от 1 до 1,5 часа, но он имеет более узкий спектр безопасных доз. В США применение фенобарбитала стало более проблематичным в последние годы из-за короткого поставок. Крайне важно, что глубина анестезии контролировать, чтобы быть уверенным, что достаточно. Ноги-пинча рефлекс является лучшим показателем адекватной глубины, но следует также отметить, частоты дыхания и других движений, а также.
- После анестезии индукции, используют для удаления волос гель или бритву для удаления волос на вентральной брюшной полости.
- Установите животных на операционном платы с использованием лабораторных ленту, чтобы держать его в распластавшись положение. Металлические доски операционной позволяет использовать грелку под ним обеспечить температуру поддержку во время операции. Мы вручную регулировать температуру грелку, которая потребительского класса устройство для домашнего использования. Температура поддерживается между 35-38 °. Металлические доски операционных также легко стерилизовать между процедурами.
- Лечить области с использованием дезинфицирующих средств, как хлоргексидин, затем этанолом стирки. Повторяйте эту процедуру три раза, чтобы обеспечить адекватное лечение. Это будет также удалить остатки частей разреза волосы, если они присутствуют.
- Использование ножниц делают разрез через стенку тела, чтобы разоблачить брюшной полости.
- Используйте ватный тампон, нажмите на внутренности в сторону, чтобы разоблачить крупных сосудов брюшной полости. Внутренности размещены на кусок марли, который смоченным теплым солевым держать его влажным.
- Используя тупой диссекции, очень внимательно анализировать брюшной аорты от окружающих тканей. Будьте очень осторожны в рассекает судна от нижней полой вены. Там будет одна или несколько отраслей, таких как поясничный артерии, которая должна быть тщательно сняты и обезболивающий укол. В разделе расчлененный аорты должна быть ниже почечных сосудов и выше бифуркации аорты в бедренной артерии. Данный раздел может служить донором материала для, как многиес двух получателей, в зависимости от того, сколько ветвления сосудов существуют и размер донора животных.
- Галстук шов чуть ниже почечных артерий и другой чуть выше бифуркации. Используя ножницы разделить аорты, полностью промыть трансплантата с физиологическим раствором, содержащим 200 ЕД / мл гепарина. Очень осторожно провести один конец судна и капать солевой раствор так, что она проходит через сосуд под действием силы тяжести. Не позволяйте пузырьки воздуха проходит через сосуд. Обращайтесь с концами судно как можно меньше, иначе интима могут быть повреждены в результате тромбоза позже. Удалите ее из поля и сразу же поместить его в контейнер с ледяной солевой раствор. Разрешить доноров животных обескровить.
3. Получатель операции
- Анестезию животного, как указано выше, и применять для удаления волос гель или использовать бритву для удаления волос на животе. Незадолго до разреза, мы управлять дозы бупренорфина подкожно в дозе 0,1 мг / кг установить обезболивания.
- MДобавить систему животного на операционном поле с использованием лабораторных ленты. Животное должно быть установлено на этапе операционной теплой, которые помогут поддерживать температуру тела во время операции.
- Применяют гентамицин глазная мазь для глаз, чтобы предотвратить их от высыхания.
- Лечить брюшную полость, а затем этанолом стирки. Повторяйте эту процедуру три раза, чтобы обеспечить адекватное лечение.
- Проверить адекватность анестезии еще раз, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Сделайте срединный разрез через кожу и стенки тела в два этапа, будучи осторожным, чтобы не посягать на ткани под ней.
- Вставьте распределитель провести разрез брюшной полости открытой. Точка сборки винтов к задней конца сохранить большую часть хомута из пути.
- Смочите площади стерильную марлю с физиологическим раствором и поместите его над кишечником. С пальцем мягко на марлю, вставить ватный тампон в кишечнике и аккуратно отражают кишечника к ыязь, чтобы они сидят на вершине марлю. Возьмем другой кусок марли, положите его на кишечник и намочил его с физиологическим раствором.
- Удалите любые жирные ткани, покрывающей аорты и нижней полой вены (НПВ). Будьте нежны. IVC очень хрупкая.
- Осторожно использовать щипцы, чтобы рассекать инфраренальной аорты от НПВ. Очистить площадь достаточно велика, чтобы обеспечить место для двух зажимов с достаточно судна между ними таким образом, что при делении, будет достаточно судна, к которому трансплантат может быть зашита. Когда рассечения, посмотрите на судне филиалов. При необходимости прижигать их с низкими cauterizer температуры.
- Вставьте сосудистый зажим чуть ниже почечных артерий, а другой чуть выше бифуркации.
- Вырезать аорты. Концы аорты, как правило, убрать, оставив пространство около 5 мм. Проверка на гемостаз. Если зажимы работают правильно, только небольшое количество крови должно уйти после разреза. Если кровотечение продолжается, проверьте зажимы, чтобы убедиться, нет ничего интерференцииING с ними. Обратите внимание, что ни один из аорты удаляется. Это просто разделить.
- Промойте обрезанными концами с гепарином солевые (200 ЕД / мл), а затем удалить дополнительные решения с тампоном.
- Tack трансплантат на место с помощью трех разрывных швов на каждом конце. Просто сшить одну сторону анастомоза на каждом конце, а затем заполнить остальные с непрерывным швом или более разрывных швов. От семи до восьми разрывных швов достаточно. Если вы используете швом, убедитесь, что стенки сосуда остается спокойной и что вы не вызвать стеноз в анастомоза.
- Осторожно снимите зажим от краниального конца и посмотреть на герметичность шва на линии. Небольшое количество просачивания в порядке предоставления останавливается в течение примерно одной минуты. Если есть, более того, можно использовать один стежок, чтобы остановить кровотечение.
- Слегка нажмите на аорте выше анастомоза сайт с увлажненными аппликатора хлопка, а затем удалить второй зажим. Аккуратно нажмите ивыпустить пару раз и убедитесь, что аорта появляется патент. Трансплантат будет перфузировались немедленно и импульса должна быть видна.
- Снимите марлю покрытие кишечника и переместить их обратно на место. Избегайте скручивания кишечника и поддержания нормальной анатомической ориентации.
- Закрыть мышечного слоя использовании 5-0 Викрил.
- Закрыть кожу с помощью 5-0 или 6-0 проленовой.
- Лечение мышей подкожно carprophen в дозе 5 мг / кг для увеличения обезболивания перед завершением анестезии.
- Дайте мыши 0,5-0,8 мл физиологического раствора подкожно.
- Наведите в нагретую клетку, чтобы восстановиться. Следить за ним внимательно во время восстановления, чтобы убедиться, что он идет на поправку нормально. 2-3 часов после операции, мышь должна будет вести себя относительно нормально. В 12 ч после операции, лечить животных с бупренорфин подкожно в дозе 2 мг / кг для обезболивания. Если в любое время, животное сгорбившись, шуметь или экспонирование ограниченный диапазон движения, исследовать проблему. Еслиокончательная причина не может быть установлен и закреплен, животные должны быть умерщвлены в институциональных протоколов. В 24 часов животное должно получить очередную дозу carprophen подкожно в дозе 5 мг / кг. Паралич задних ног указывает не удалось анастомоза или тромб. В этой ситуации, животное должно быть умерщвлены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана аортального протеза. Белые стрелки обозначают шов линии. Патент трансплантат покажем видимых импульсов. Рисунок 2 показывает типичный эксперимент, в котором получатель выживания последовало в течение 56 дней. Одна группа состояла из дикого типа (C57BL / 6 х FVB) получателя мышей пересаживают с BALB / с аортой. Другая группа, обозначенная "КО" состоит из получателей (C57BL / 6 х FVB), дефицитные по выражению гемоксигеназы-1, что приводит к тромбозу трансплантатов в течение 24 часов. Примечательно, что это приводит к гибели всех получателей, как показано на рисунке. Рисунок 3 показывает, эхо измерений ВАХ и брюшной аорты в нормальных животных и трансплантации реципиенту. Обратите внимание, что прививка является патент и похожа на не-пересаженных аорты.
Рисунок 1.Вид пересаженных аорты. Белые стрелки обозначают шов линии.
Рисунок 2. Kaplan-Meier изображения выживаемость после трансплантации аорты в двух группах мышей пересаживают с аорты от BALB / с мышью. "КО" обозначает получателей дефицит выражение гемоксигеназы-1, в результате чего тромбоз аорты трансплантатов в течение 24-48 часов. "WT" обозначает дикого типа помета. Печатается по: Окись углерода спасает гемоксигеназы-1-дефицитных мышей с артериальным тромбозом в аллогенной трансплантации аорты, Чэнь B, L Го, Вентилятор C, Bolisetty S, R Джозеф Райт М., Агарвал, Джордж JF. Am J Pathol. 2009 Июл, 175 (1) :422-9 с разрешения Elsevier.
FigurE 3. Эхо изображение нижней полой вены (НПВ) и брюшной аорты в естественных условиях в нормальной мыши (левая панель) и в аорте получателя трансплантата (правая панель). Изображения были получены с инструментом Visualsonics Vevo 660. Звездочки обозначают просвета сосудов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мышь моделей аорты трансплантации обеспечивают ряд преимуществ, потому что мыши очень хорошо определены immunogenetically 9,12,13, и они могут быть легко манипулировать, чтобы изменять их экспрессии специфических генов, если это необходимо. Как отмечалось во введении, сосудистая хирургия у мыши гораздо сложнее, чем большинство моделей из-за размеров судов. Даже великий артерий, таких как аорта, как правило, не более 100-200 мкм, внутренний диаметр, так что манипулирование этих судов требует значительных навыков и ловкости 8,14. Наиболее распространенные осложнения наблюдались в этой операции на тех, кто только начинают внедрять системы задние ноги паралич, как правило, вызваны тромбозом в результате травмы интимы при грубом обращении или зажима. Большинство из зажимов на рынок на рынок компаний, которые продают инструментов, подходящих для микрохирургии создают слишком много давления, которые будут использоваться для мышей, с давлением как правило, превышает 25 г / см 2. CLAм мы используем, гладкие, с давлением 2 г / см 2, давление которой вполне достаточно для достижения гемостаза и не повредить сосуды. Некоторые хирурги предпочитают использовать шов, а не зажимами. Мы не рекомендуем эту практику, потому что это метод, который в значительной степени зависит от умения хирурга, чтобы измерить давление и правильный, на наш взгляд, может способствовать более низкого успеха. С практикой, выживаемость 90% или лучше ожидать не следует.
Наложение швов технику на конец-в-конец анастомоза является одним из важнейших навыков, которые приобретаются с опытом. В зависимости от опыта работы с хирургической техники и ловкости рук, полное знание может быть достигнуто через 50-100 процедур. Более поздние исследования показывают, альтернативных технологий для анастомозы могут стать доступными в будущем 15.
Основным ограничением этой процедуры, как и большинство микрохирургических операций у мышей, что высокий уровень мастерстванеобходимых для успешного выполнения и лиц без отличную мелкой моторики никогда не может достичь высокого уровня владения языком. Однако, с практикой, большинство людей может достичь приемлемого уровня выживания. Небольшой размер тканей также приводит к дополнительным ограничениям, поскольку размер трансплантата очень мала, поэтому количество материала для последующего анализа является предельным. Наибольшее преимущество этой модели является также характеризуется иммуногенетики мышей, широкая доступность многочисленных инбредных линий трансгенных мышей, и мышах, что позволяет очень полезны эксперименты по решению молекулярных механизмов в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет основного ресурса NIH P30 О'Брайен центр (DK 079 337).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vascular Clamps | Fine Science Tools | 00396-01 (Size B-1) | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | |
| 10-0 Needled microsuture | AROSurgical | TK-107038 | |
| Straight scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5620 | |
| Low temperature cauterizer | Beaver-Visitec International | 8441000 | |
| Self retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 |
References
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J. Heart Lung Transpl. 18, 946-951 (1999).
- Calise, D., et al. Orthotopic aortic transplantation in rodents by the sleeve technique: a model system for the study of graft vascular disease. Transpl. Proc. 33, 2369-2370 (2001).
- Thomsen, M., et al. An orthotopic aortic graft mouse model to study the immunopathology of chronic vascular rejection. Transpl. Proc. 34, 2833-2835 (2002).
- Benza, R. L., George, J. F. Aortic graft transplantation in mice. J. Heart Lung Transpl. 21, 1319-1321 (2002).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. The Journal of surgical research. 111, 171-176 (2003).
- Cho, H. R., et al. Improved surgical technique for heterotopic aortic transplantation in mice. J. Korean Med. Sci. 22, 12-15 (2007).
- Zhong, R. Organ transplantation in mice: current status and future prospects. Microsurgery. 19, 52-55 (1999).
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transpl. 24, 2003-2014 (2005).
- Gorska, P. Principles in laboratory animal research for experimental purposes. Med Sci Monit. 6, 171-180 (2000).
- Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. Am. J. Vet. Res. 43, 1654-1657 (1982).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
- Chen, B., et al. Carbon monoxide rescues heme oxygenase-1-deficient mice from arterial thrombosis in allogeneic aortic transplantation. Am. J. Pathol. 175, 422-429 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transpl. Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chang, E. I., et al. Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels. Nature medicine. 17, 1147-1152 (2011).
