Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ortotop Aorta Transplantation i möss för att studera vaskulär sjukdom

Published: November 28, 2012 doi: 10.3791/4338

Summary

Vi beskriver en teknik där en sektion av bukaorta från en mus transplanteras ortotopiskt till strax nedanför de renala artärerna i en allogen eller syngen mottagare. Denna teknik kan vara användbar i studier där transplantation av stora artärer av enhetlig storlek bedöms fördelaktig.

Abstract

Vaskulära procedurer involverande anastomoser i mus i allmänhet tros vara svårt och mycket beroende på skickligheten hos den individuella kirurgen. Detta är till stor del sant, men det finns ett antal viktiga principer som kan minska svårigheten av dessa förfaranden och förbättra reproducerbarheten. Ortotop aorta transplantation är ett utmärkt förfarande där att lära sig dessa principer eftersom det innebär bara två end-to-end-anastomoser, men kräver god suturering teknik och hantering av de fartyg konsekvent framgång. Detta förfarande inleds med upphandling av en längd av bukaorta från en donator djur, följt av uppdelning av inhemska aorta hos mottagaren. Den upphandlade aorta placeras sedan mellan de delade ändarna av mottagande aorta och sys på plats med end-to-end-anastomoser. För att uppnå detta mål framgångsrikt kräver en hög grad av koncentration, bra verktyg, en stadig hand och en uppskattning av hur lättvaskulatur av en mus kan skadas, vilket resulterar i trombos. Att lära dessa viktiga principer är det upptar det mesta av nybörjare när lär mikrokirurgi i små gnagare. Under hela detta protokoll hänvisas till dessa viktiga punkter. Denna modell kan användas för att studera vaskulär sjukdom i en mängd olika experimentella system 1-8. I samband visas här, är det oftast används för att studera efter transplantation kärlsjukdom, en gemensam långsiktig komplikation av organtransplantation, i vilken intimal hyperplasi inträffar inom allograft. Den främsta fördelen med modellen är att det underlättar kvantitativa morfometriska analyser och den transplanterade kärlet ligger intill den endogena kärl, som kan tjäna som en ytterligare kontroll 9. Tekniken som visas här används oftast för möss som väger 18-25 gram. Vi har samlat det mesta av vår erfarenhet med C57BL/6J, BALB / CJ, och C3H/HeJ stammar.

Protocol

1. Presurgical Förberedelser

  1. Kirurgiska ingrepp, oavsett hur omsorgsfullt gjort, resulterar i betydande stress. För att minimera effekterna av sådan stress och att maximera reserver, bör djuren hållas i terrariet minst 72 timmar före användning 10,11.
  2. Kirurgiska verktyg, gasväv, och kompresser måste vara sterila. Det är inte nödvändigt att använda sterila handskar ger endast tips av instrument beröring sutur eller den operativa fältet.
  3. För hemostas, är det viktigt att kläm tryck är absolut nödvändigt. Skador på kärlet på grund av högt tryck eller ovarsam hantering orsakar trombos, vilket resulterar i hind-ben förlamning, tarm ischemi, och död inom 24 timmar. Vi har funnit att användning av klämmor med ett tryck av inte mer än 2 g / cm 2 eliminerar problemet. Dessa klämmor noteras i tabell 1. Clamp tryck anges i specifikationerna för klämmor tillverkade av hög kvalitet kirurgiska instrut tillverkare. Vi har funnit att billiga klämmor eller disponibel klämmor allmänt utövar för mycket tryck.
  4. Placeringen av kollaterala kärl liksom de relativa lägena för den abdominala aortan och vena cava inferior (IVC) är stammen beroende. Du hittar också små variationer mellan enskilda möss, särskilt i läge säkerheter fartyg.

2. Donator Drift

  1. Möss kan vara bedövas med isofluran (1,5-2,5% induktion, 1,0% underhåll i luft) eller med pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital fastställs en tidsgräns (upp till 1,5 timmar), men ger kirurgen med möjlighet att rotera djur för bättre tillgång, om så önskas. Anestesi tid kan förlängas upp till 2 timmar genom att placera 2-3 droppar av bedövningsmedlet vid behov på tarmen eller levern under operationen. Ketamin / xylazin (100 mg / kg kroppsvikt för ketamin och 7 mg / kg för xylazin, ip) kan också användas av välutbildade kirurger som can slutf inom 1 till 1,5 timme, men den har en smalare säker dosintervall. I USA har användningen av pentobarbital blivit mer problematisk under de senaste åren på grund av korta leveranser. Det är viktigt att djupet av anestesi övervakas för att vara säker på att det är tillräckligt. Tån-nypa reflex är den bästa indikatorn på adekvat djup men man bör också notera andningsfrekvens och andra rörelser också.
  2. Efter anestesi induktion, använd en hårborttagningsprodukter gel eller en rakapparat för att ta bort hår på den ventrala buken.
  3. Montera djuret på operationsbordet kortet med laboratorium tejp för att hålla den i en spread eagled läge. En metallisk drift ombord medger användning av en värmedyna under den för att tillhandahålla stöd temperatur under operationen. Vi kontrollerar manuellt temperatur värmedyna, som är en konsument-grade enhet för hemmabruk. Temperaturen hålles mellan 35-38 °. Den metalliska operativa styrelsen är också lätt att sterilisera mellan förfarandena.
  4. Desinficera området med ett desinfektionsmedel som klorhexidin, följt av en tvätt etanol. Upprepa denna procedur tre gånger, för att säkerställa tillräcklig desinfektion. Detta kommer också att ta bort alla kvarvarande skurna bitar av hår, om det finns.
  5. Använda sax göra ett snitt genom kroppsväggen för att exponera den abdominala viscera.
  6. Använd en bomullspinne, tryck inälvorna åt sidan för att exponera de stora kärlen i buken. Inälvorna placeras på en bit gasväv som fuktas med varm saltlösning för att hålla den fuktig.
  7. Använda trubbig dissektion, mycket noggrant dissekera bukaortan bort från den omgivande vävnaden. Var mycket försiktig vid dissekera kärlet bort från den nedre hålvenen. Det kommer att finnas en eller flera grenar, såsom ländryggen artär, som måste noggrant lyftas och flamberats. Den del av dissekerade aorta bör under njurkärl och över bifurkationen av aorta i den femorala artärer. Detta avsnitt kan fungera som givare material för så mångas två mottagare, beroende på hur många förgrenade kärl finns och storleken på donatordjuret.
  8. Knyt en sutur strax under njurartärerna och en annan precis ovanför bifurkationen. Använda sax delar aortan, helt skölj transplantatet med saltlösning innehållande 200 U / ml heparin. Mycket försiktigt tag ena änden av fartyget och droppa den saltlösning så att den går genom kärlet genom tyngdkraften. Låt inte luftbubblor löper genom kärlet. Hantera ändarna av fartyget så lite som möjligt annars intiman kan skadas vilket resulterar i trombos senare. Ta bort den från fältet och omedelbart placera den i en behållare med iskall saltlösning. Låt donatordjuret att exsanguinate.

3. Mottagare Drift

  1. Söva djuret enligt ovan och tillämpa en hårborttagningsprodukter gel eller använda en rakapparat för att ta bort hår på magen. Strax före snittet vi administrera en dos av buprenorfin subkutant vid 0,1 mg / kg till etablera analgesi.
  2. Mount djuret på operationsbordet fältet med laboratorie tejp. Djuret måste monteras på en varm driftsskedet som bidrar till att upprätthålla kroppstemperaturen under operationen.
  3. Applicera gentamycin oftalmisk salva till ögonen för att hindra dem från uttorkning.
  4. Desinficera buken, följt av en tvätt etanol. Upprepa denna procedur tre gånger, för att säkerställa tillräcklig desinfektion.
  5. Kontrollera lämpligheten av anestesi gång innan du fortsätter till nästa steg.
  6. Gör en mittlinjesnitt genom huden och kroppen väggen i två steg, försiktigt så att inte inkräkta på vävnaderna under.
  7. Sätt in en spridare för att hålla buksnitt öppen. Rikta skruvmontering mot den bakre änden för att hålla huvuddelen av klämman ur vägen.
  8. Blöt en kvadrat med steril gasbinda med saltlösning och placera den över tarmarna. Med fingret lätt på gasväv, sätt en bomullstuss i tarmarna och försiktigt reflekterar tarmarna över till side så de sitter på toppen av gasväv. Ta en annan bit gasbinda, placera den på tarmen och fukta den med saltlösning.
  9. Ta bort alla fettvävnaden som täcker aorta och nedre hålvenen (IVC). Var försiktig. IVC är mycket bräcklig.
  10. Försiktigt använda pincett för att dissekera den infrarenala aortan från IVC. Rensa ett område stort nog för att ge plats för två klämmor med tillräckligt fartyg mellan dem så att, om det indelas, kommer det att finnas tillräckligt med fartyg som transplantatet kan sys. När dissekera, leta efter fartyg grenar. Om nödvändigt bränna dem med en låg temperatur cauterizer.
  11. Sätt en vaskulär klämma strax under njurartären och en annan precis ovanför bifurkationen.
  12. Skär aorta. Ändarna av aortan vanligtvis tillbaka och lämnar ett utrymme av ca 5 mm. Kontrollera om hemostas. Om klämmorna fungerar korrekt bör endast en liten mängd blod fly efter snittet. Om blödningen fortsätter, kontrollera klämmorna för att vara säker ingenting är störING med dem. Observera att ingen av aortan avlägsnas. Det är bara delat.
  13. Skölj de kapade ändarna med hepariniserad saltlösning (200 U / ml) och sedan ta bort den extra lösningen med en trasa.
  14. Klibb graften på plats med hjälp av tre diskontinuerliga suturer vid varje ände. Bara sy ena sidan av anastomos i varje ände, och sedan fylla i resten med en kontinuerlig drift sutur eller mer diskontinuerliga suturer. Sju till åtta diskontinuerliga suturer är tillräcklig. Om du använder en löpande sutur, vara säker på att kärlväggarna förblir avslappnad och att du inte orsakar stenos vid anastomos.
  15. Ta försiktigt bort klämman vid den kraniala änden och leta efter läckor på suturen linjer. En liten mängd läckage är OK förutsatt att det stannar inom ca en minut. Om det är mer än så, är det möjligt att använda en enda stygn för att stoppa blödningen.
  16. Tryck försiktigt på aorta ovanför anastomos platsen med en våt bomull applikator, och ta sedan bort den andra klämman. Tryck försiktigt ochsläpper ett par gånger och kontrollera att aorta visas patentet. Transplantatet ska perfunderas omedelbart och en puls ska vara synliga.
  17. Ta bort gasväv täcker tarmarna och flytta dem på plats. Undvik vridning av tarmen och bibehålla normal anatomisk orientering.
  18. Stäng muskel lager med 5-0 Vicryl.
  19. Stäng huden med 5-0 eller 6-0 Prolene.
  20. Behandla musen subkutant med carprophen vid 5 mg / kg att öka analgesi innan avslutning anestesi.
  21. Ge musen 0,5-0,8 ml koksaltlösning subkutant.
  22. Placera musen i en uppvärmd bur för att återhämta sig. Övervaka det noga under återhämtning för att vara säker att det återhämtar sig normalt. 2-3 timmar efter operation, bör musen ska bete sig relativt normalt. Vid 12 timmar efter operationen, behandla djuret med buprenorfin subkutant vid 2 mg / kg för smärtlindring. Om, vid något tillfälle, är djuret böjd, vilket gör buller eller uppvisar ett begränsat utbud av rörelse, undersöka problemet. Omen slutgiltig orsak inte kan fastställas och fixeras, bör djuret avlivas per institutionella protokoll. Vid 24 timmar djuret bör få en annan dos av carprophen subkutant vid 5 mg / kg. Bakben förlamning indikerar ett misslyckat anastomos eller en tromb. I denna situation bör djuret avlivas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar en aortagraft. De vita pilarna betecknar suturen linjer. Ett patent transplantat visar en synlig puls. Figur 2 visar ett typiskt experiment i vilket mottagande överlevnad följdes under en period av 56 dagar. En grupp bestod av vildtyp (C57BL / 6 x FVB) mottagande möss transplanterade med BALB / c-aorta. Den andra gruppen, betecknad "KO" består av mottagare (C57BL / 6 x FVB) som saknar expression av heme oxygenas-1, vilket resulterar i trombos av transplantaten inom 24 timmar. Noterbart, resulterar detta i död av alla mottagare som visas i figuren. 3 visar Figur eko mätningar av IVC och bukaortan i en normal djur och i en transplantatmottagare. Observera att transplantatet är patent och liknande utseende som det icke-transplanterade aorta.

Figur 1
Figur 1.En vy av ett transplanterat aorta. De vita pilarna betecknar suturen linjer.

Figur 2
Figur 2. Kaplan-Meier skildringar av överlevnad efter transplantation aorta i två grupper av möss transplanterade med aorta från en BALB / c-mus. "KO" betecknar mottagare som saknar uttrycket av heme oxygenas-1, vilket resulterar i trombos av de aorta transplantaten inom 24-48 timmar. "WT" betecknar vildtyp kullsyskon. Utdrag ur: Kolmonoxid räddar heme oxygenas-1-brist möss från arteriell trombos i allogen aorta transplantation Chen B Guo L, Fläkt C Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. 2009 juli, 175 (1) :422-9 med tillstånd från Elsevier.

Figur 3
Figure 3. Echo avbildning av den nedre hålvenen (IVC) och bukaortan in vivo i en normal mus (vänstra panelen) och i en aorta transplantatmottagare (högra panelen). Bilderna producerades med en Visualsonics Vevo 660 instrument. Asterisker betecknar lumen av kärlen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Musmodeller av aorta transplantation ger ett antal fördelar, eftersom möss är mycket väl definierade immunogenetically 9,12,13, och de kan lätt manipuleras för att förändra deras uttryck av specifika gener, om så önskas. Såsom noterats i inledningen, är vaskulär kirurgi i mus svårare än de flesta modeller på grund av storleken på fartygen. Även de stora artärerna, såsom aortan är vanligtvis inte mer än 100-200 um i innerdiameter, så manipulera dessa kärl kräver en betydande mängd av skicklighet och fingerfärdighet 8,14. Den vanligaste komplikationen observerats i denna operation av dem just börjat implementera systemet hind-leg förlamning, vanligen orsakade av trombos till följd av skada intima av ovarsam hantering eller fastspänning. De flesta av de klämmor som saluförs av företag som säljer verktyg lämpliga för mikrokirurgi skapar alltför mycket tryck som skall användas för möss, med tryck vanligen större än 25 g / cm 2. CLAMPS vi använder är smidig, med ett tryck på 2 g / cm 2, ett tryck som är precis tillräckligt för att uppnå hemostas och inte skadar fartygen. Vissa kirurger föredrar att använda sutur stället klämmor. Vi rekommenderar inte denna praxis, eftersom det är en metod som är mycket beroende av förmågan hos kirurgen att bedöma rätt tryck och i vår uppfattning kan bidra till en lägre framgång. Med praktiken bör överlevnad på 90% eller bättre kan förväntas.

Suturering teknik för end-to-end-anastomoser är en viktig färdighet som förvärvas med erfarenhet. Beroende på tidigare erfarenhet med kirurgiska tekniker och fingerfärdighet kan fullt kompetens uppnås efter 50-100 procedurer. Nyare studier tyder alternativa tekniker för anastomoser kan bli tillgängliga i framtiden 15.

Den primära begränsningen av detta förfarande är, liksom de flesta mikrokirurgiska förfaranden möss att en hög nivå av skicklighet ärkrävs för ett framgångsrikt genomförande och individer utan goda finmotorik kan aldrig uppnå en hög kompetensnivå. Men med träning kan de flesta individer att uppnå en acceptabel överlevnad. Den lilla storleken av vävnaderna resulterar också i ytterligare begränsningar eftersom storleken av transplantatet är mycket liten, så att mängden material för efterföljande analys är begränsande. Den största fördelen med modellen är de väl kännetecknas Immunogenetics av möss, den stora tillgången på många inavlade stammar, transgena möss och möss knockout, vilket möjliggör mycket användbara experiment för att ta itu med molekylära mekanismer in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av kärnan resurs NIH P30 O'Brien centrum (DK 079.337).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vascular Clamps Fine Science Tools 00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps Fine Science Tools 11293-00
10-0 Needled microsuture AROSurgical TK-107038
Straight scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5620
Low temperature cauterizer Beaver-Visitec International 8441000
Self retaining retractor World Precision Instruments 14240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
  2. Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J. Heart Lung Transpl. 18, 946-951 (1999).
  3. Calise, D., et al. Orthotopic aortic transplantation in rodents by the sleeve technique: a model system for the study of graft vascular disease. Transpl. Proc. 33, 2369-2370 (2001).
  4. Thomsen, M., et al. An orthotopic aortic graft mouse model to study the immunopathology of chronic vascular rejection. Transpl. Proc. 34, 2833-2835 (2002).
  5. Benza, R. L., George, J. F. Aortic graft transplantation in mice. J. Heart Lung Transpl. 21, 1319-1321 (2002).
  6. Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. The Journal of surgical research. 111, 171-176 (2003).
  7. Cho, H. R., et al. Improved surgical technique for heterotopic aortic transplantation in mice. J. Korean Med. Sci. 22, 12-15 (2007).
  8. Zhong, R. Organ transplantation in mice: current status and future prospects. Microsurgery. 19, 52-55 (1999).
  9. George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transpl. 24, 2003-2014 (2005).
  10. Gorska, P. Principles in laboratory animal research for experimental purposes. Med Sci Monit. 6, 171-180 (2000).
  11. Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. Am. J. Vet. Res. 43, 1654-1657 (1982).
  12. Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
  13. Chen, B., et al. Carbon monoxide rescues heme oxygenase-1-deficient mice from arterial thrombosis in allogeneic aortic transplantation. Am. J. Pathol. 175, 422-429 (2009).
  14. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transpl. Proc. 5, 733-735 (1973).
  15. Chang, E. I., et al. Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels. Nature medicine. 17, 1147-1152 (2011).

Tags

Medicin 69 anatomi fysiologi kirurgi kärlkirurgi möss pulsåder aorta transplantation kärlsjukdom aorta transplantation ortotop mus kärlsjukdom modeller
Ortotop Aorta Transplantation i möss för att studera vaskulär sjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, L., Agarwal, A., George, J. F.More

Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease. J. Vis. Exp. (69), e4338, doi:10.3791/4338 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter