Transplantation orthotopique aortique chez la souris pour l'étude des maladies vasculaires

Summary

Nous décrivons une technique dans laquelle une section de l'aorte abdominale d'une souris est transplanté orthotopique juste au-dessous des artères rénales dans un receveur allogène ou syngéniques. Cette technique peut être utile dans les études où la transplantation de grandes artères de taille uniforme est jugée avantageuse.

Abstract

Procédures vasculaires impliquant des anastomoses chez la souris sont généralement considérées comme difficiles et très dépendante de l'habileté du chirurgien. C'est en grande partie vrai, mais il ya un certain nombre de principes importants qui peuvent réduire la difficulté de ces procédures et d'améliorer la reproductibilité. Greffe aortique orthotopique est un excellent procédé pour apprendre ces principes, car elle ne concerne que deux de bout en bout anastomoses, mais nécessite une bonne technique de suture et la manutention des navires pour un succès constant. Cette procédure débute par l'acquisition d'une longueur de l'aorte abdominale à partir d'un animal donneur, suivie par la division de l'aorte native chez le receveur. L'aorte procuré est ensuite placé entre les extrémités séparées de l'aorte destinataire et suturé en place à l'aide de bout en bout anastomoses. Pour atteindre cet objectif avec succès nécessite un haut degré de concentration, de bons outils, d'une main ferme, et une appréciation de la facilité avec laquellevascularisation d'une souris peuvent être endommagés, entraînant une thrombose. L'apprentissage de ces principes importants est ce qui occupe la majeure partie du temps du débutant lors de l'apprentissage microchirurgie chez les petits rongeurs. Tout au long de ce protocole, nous nous référons à ces points importants. Ce modèle peut être utilisé pour étudier les maladies vasculaires dans une variété de différents systèmes expérimentaux ^1-8. Dans le contexte présenté ici, il est le plus souvent utilisé pour l'étude de post-greffe vasculaire, une commune complication à long terme de la transplantation d'organe solide dans lequel l'hyperplasie intimale se produit au sein de l'allogreffe. Le principal avantage de ce modèle est qu'il facilite les analyses morphométriques quantitatives et le navire se trouve transplanté contiguë à la cuve endogène, qui peut servir comme un contrôle supplémentaire ^9. La technique présentée ici est le plus souvent utilisé pour les souris pesant 18-25 grammes. Nous avons accumulé plus de notre expérience dans l'utilisation de la C57BL/6J, BALB / cJ, et les souches C3H/HeJ.

Protocol

1. Préparation préopératoire

1. Les interventions chirurgicales, peu importe avec quel soin fait, entraînent un stress important. Pour minimiser les effets de ce stress et de maximiser les réserves, les animaux doivent être maintenus dans le vivarium pendant au moins 72 heures avant de l'utiliser ^10,11.
2. Instruments chirurgicaux, compresses et tampons doivent être stériles. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des gants stériles ne fournissant que les extrémités de la suture tactile ou instruments du champ opératoire.
3. Pour l'hémostase, il est impératif que les pressions de serrage sont le minimum nécessaire. Dommages au navire en raison d'une pression excessive ou une manipulation brutale provoque une thrombose, ce qui entraîne une paralysie patte postérieure, ischémie intestinale, et la mort dans les 24 heures. Nous avons trouvé que l'utilisation de pinces avec une pression de pas plus de 2 g / cm ² élimine le problème. Ces pinces sont indiquées dans le tableau 1. Pressions de serrage sont indiqués dans le cahier des charges pour les pinces faites par l'instrumentation de haute qualité chirurgicauxfabricants de t. Nous avons constaté que bon marché pinces ou des pinces jetables universellement exercer trop de pression.
4. L'emplacement des vaisseaux collatéraux ainsi que les positions relatives de l'aorte abdominale et la veine cave inférieure (VCI) sont la souche dépendante. Vous y trouverez également des petites variations entre les souris individuelles, en particulier dans la localisation des vaisseaux collatéraux.

2. Fonctionnement des bailleurs de fonds

1. Les souris peuvent être anesthésiés à l'isoflurane (1,5-2,5% par induction, le maintien 1,0% dans l'air) ou avec du pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital impose une limite de temps (jusqu'à 1,5 heures), mais permet au chirurgien la possibilité de rotation de l'animal pour un meilleur accès, si désiré. Durée de l'anesthésie peut être étendue jusqu'à 2 h en plaçant 2-3 gouttes d'anesthésique en cas de besoin sur l'intestin ou le foie pendant la chirurgie. La kétamine / xylazine (100 poids corporel mg / kg pour la kétamine et 7 mg / kg pour xylazine, ip) peut également être utilisé par les chirurgiens bien formés qui can terminer la procédure délai de 1 à 1,5 heures, mais il a une portée plus étroite dose sûre. Aux États-Unis, l'utilisation du pentobarbital est devenue plus problématique ces dernières années en raison de fournitures de courte durée. Il est impératif que la profondeur de l'anesthésie être surveillés pour être certain que c'est suffisant. Le réflexe de pied-pincement est le meilleur indicateur de la profondeur adéquate, mais il faut aussi noter le taux de respiration et des mouvements d'autres aussi.
2. Après l'induction de l'anesthésie, utilisez un gel dépilatoire ou un rasoir pour enlever les poils sur l'abdomen ventral.
3. Montez l'animal sur le plateau d'exploitation en utilisant du ruban de laboratoire pour le maintenir dans une position bras et jambes écartés. Plaque métallique de fonctionnement permet d'utiliser un coussin chauffant en dessous pour fournir un appui température pendant la chirurgie. On contrôler manuellement la température du coussin chauffant, qui est une unité de consommation de qualité pour l'utilisation à domicile. La température est maintenue entre 35-38 °. Le conseil d'exploitation métallique est aussi facile à stériliser entre les procédures.
4. Désinfecter la zone en utilisant un désinfectant comme la chlorhexidine, suivie d'un lavage à l'éthanol. Répétez cette procédure trois fois, pour assurer une désinfection adéquate. Cela va également supprimer tous les morceaux coupés résiduelles de cheveux, si elle est présente.
5. L'aide de ciseaux faire une incision à travers la paroi du corps d'exposer les viscères abdominaux.
6. Utilisez un coton-tige, pousser les viscères sur le côté pour exposer les gros vaisseaux de l'abdomen. Les viscères sont placés sur un morceau de gaze qui est humidifié avec une solution saline chaude pour le garder humide.
7. Utilisation dissection, très soigneusement disséquer l'aorte abdominale loin du tissu environnant. Soyez très prudent dans la dissection du navire à partir de la veine cave inférieure. Il y aura une ou plusieurs branches, telles que l'artère lombaire, qui doit être soigneusement levées et cautérisée. La section de l'aorte disséquée devraient être inférieurs aux vaisseaux rénaux et au-dessus de la bifurcation de l'aorte dans les artères fémorales. Cette section peut servir de matériel de donneur pour autant unes deux bénéficiaires, selon le nombre de vaisseaux arborescents existent et la taille de l'animal donneur.
8. Attachez un fil de suture juste au-dessous des artères rénales et l'autre juste au-dessus de la bifurcation. L'aide de ciseaux diviser l'aorte, entièrement rincer la greffe avec une solution saline contenant 200 U / ml d'héparine. Très soigneusement tenir une extrémité de la cuve et goutte à goutte la solution saline de sorte qu'il passe à travers le récipient par gravité. Ne laissez pas les bulles d'air de fonctionner à travers le vaisseau. Manipuler les extrémités de l'enceinte aussi peu que possible par ailleurs de l'intima peuvent être endommagés entraînant une thrombose ultérieure. Retirez-la du terrain et placez-la immédiatement dans un récipient de solution saline glacée. Permettre à l'animal donneur à être exsangue.

3. Fonctionnement du destinataire

1. Anesthésier l'animal comme ci-dessus et appliquer un gel dépilatoire ou utiliser un rasoir pour enlever les poils sur le ventre. Juste avant l'incision nous administrer une dose de buprénorphine sous-cutanée à raison de 0,1 mg / kg de mettre en place une analgésie.
2. Montant de l'animal sur le champ opératoire avec du ruban laboratoire. L'animal doit être monté sur une platine de fonctionnement chaud qui permettra de maintenir la température du corps pendant l'opération.
3. Appliquer une pommade ophtalmique gentamycine pour les yeux pour les empêcher de se dessécher.
4. Désinfecter l'abdomen, suivie d'un lavage à l'éthanol. Répétez cette procédure trois fois, pour assurer une désinfection adéquate.
5. Vérifier l'adéquation de l'anesthésie une fois de plus avant de passer à l'étape suivante.
6. Faire une incision médiane à travers la peau et la paroi du corps en deux étapes, en prenant soin de ne pas empiéter sur les tissus en dessous.
7. Insérez un épandeur de tenir l'incision abdominale ouverte. Pointer l'ensemble de vis vers l'extrémité arrière afin de maintenir l'essentiel de la pince hors de la voie.
8. Mouillez un carré de gaze stérile de sérum physiologique et le placer sur les intestins. Avec votre doigt doucement sur la toile, insérer un coton-tige dans les intestins et doucement reflètent les intestins au cours de la side ils sont assis sur le dessus de la gaze. Prenez un autre morceau de gaze, placez-le sur les intestins et le mouiller avec du sérum physiologique.
9. Retirez tout le tissu adipeux couvrant l'aorte et la veine cave inférieure (VCI). Soyez doux. L'IVC est très fragile.
10. Doucement utiliser une pince à disséquer l'aorte sous-rénale de la VCI. Effacer une zone assez grande pour faire place à deux pinces avec réservoir suffisamment entre eux de telle sorte que, lorsqu'elle est divisée, il y aura assez de navires pour lesquels la greffe peut être suturée. Lorsque la dissection, chercher des branches vasculaires. Si nécessaire, les cautériser avec un cauterizer basse température.
11. Insérez un clamp vasculaire juste en dessous de l'artère rénale et une autre juste au-dessus de la bifurcation.
12. Coupez l'aorte. Les extrémités de l'aorte se rétracter habituellement, en laissant un espace d'environ 5 mm. Vérifier l'hémostase. Si les pinces fonctionnent correctement, seule une petite quantité de sang doit s'échapper après la coupe. Si le saignement persiste, vérifiez les pinces être que rien n'est interférencestion avec eux. Notez qu'aucun de l'aorte est retiré. Il est simplement divisé.
13. Rincer les extrémités coupées avec du sérum physiologique hépariné (200 UI / ml), puis retirez la solution supplémentaire avec un coton-tige.
14. Tack le greffon en place en utilisant trois sutures discontinues à chaque extrémité. Juste suturer un côté de l'anastomose à chaque extrémité, puis remplissez le reste avec une suture continue en cours d'exécution ou plusieurs sutures discontinues. Sept à huit points de suture discontinues est suffisante. Si vous utilisez un surjet, assurez-vous que les parois des vaisseaux rester détendu et que vous n'avez pas provoquer une sténose de l'anastomose.
15. Retirez délicatement la pince à l'extrémité crânienne et rechercher les fuites sur les lignes de suture. Une petite quantité d'infiltration est OK à condition qu'elle s'arrête à environ une minute. S'il ya plus que cela, il est possible d'utiliser un seul point d'arrêter le saignement.
16. Appuyez doucement sur l'aorte au-dessus du site d'anastomose avec un coton humidifié, puis retirez la pince seconde. Appuyez doucement etlibérer un couple de fois et vérifier que l'aorte apparaît brevet. Le greffon sera perfusé immédiatement et une impulsion doit être visible.
17. Retirez la gaze couvrant les intestins et les ramener en place. Eviter la torsion de l'intestin et de maintenir une orientation anatomique normale.
18. Fermez la couche musculaire en utilisant 5-0 Vicryl.
19. Fermez la peau en utilisant 5-0 ou 6-0 prolène.
20. Traiter la souris sous-cutanée avec carprophen à 5 mg / kg d'augmenter l'analgésie avant de mettre fin anesthésie.
21. Donner la souris 0,5 à 0,8 ml de solution saline sous-cutanée.
22. Placez la souris dans une cage chauffée à récupérer. Il surveiller attentivement lors de la récupération pour être sûr qu'il se remet normalement. 2-3 h après la chirurgie, la souris doit se comporter relativement normalement. A 12 h post-op, traiter l'animal avec la buprénorphine sous-cutanée de 2 mg / kg pour l'analgésie. Si, à tout moment, l'animal est courbé, faisant du bruit ou présentant une gamme limitée de mouvement, d'enquêter sur le problème. Siune cause définitive ne peut être établie et fixée, l'animal devrait être euthanasié conformément aux protocoles institutionnels. À 24 h l'animal devrait recevoir une autre dose de carprophen sous-cutanée de 5 mg / kg. Paralysie des pattes postérieures indique une anastomose échoué ou un thrombus. Dans cette situation, l'animal devrait être euthanasié.

Representative Results

La figure 1 montre un greffon aortique. Les flèches blanches indiquent les lignes de suture. Une greffe de brevet montrent une impulsion visible. La figure 2 montre une expérience typique dans laquelle la survie du receveur a été suivie pendant une période de 56 jours. Un groupe se composait de souris receveuses de type sauvage (C57BL / 6 x FVB) transplantées avec des souris BALB / c aorte. L'autre groupe, dénommé «KO» se compose de bénéficiaires (C57BL / 6 x FVB) déficientes en expression de l'hème oxygénase-1, ce qui entraîne une thrombose des greffons dans les 24 heures. Notamment, cela se traduit par la mort de tous les bénéficiaires, comme indiqué sur la figure. Figure 3 montre l'écho des mesures de la veine cave inférieure et l'aorte abdominale chez un animal normal et chez un receveur de greffe. Notez que la greffe est brevets et semblable en apparence à l'aorte non greffé.

Figure 1.Une vue d'une aorte transplantée. Les flèches blanches indiquent les lignes de suture.

Figure 2. Kaplan-Meier des représentations de la survie après la transplantation aortique en deux groupes de souris transplantées avec l'aorte d'une souris BALB / c. «KO» désigne les bénéficiaires déficientes dans l'expression de l'hème oxygénase-1, ce qui entraîne une thrombose des greffons aortiques au sein de 24-48 heures. "WT" désigne la même portée de type sauvage. Tiré de: Monoxyde de carbone sauvetages hème oxygénase-1-souris déficientes de thrombose artérielle chez allogénique aortique transplantation, Chen B, L Guo, Ventilateur C, Bolisetty S, R Joseph, MM Wright, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. Août 2009, 175 (1) :422-9 avec la permission d'Elsevier.

Figure 3. Echo imagerie de la veine cave inférieure (VCI) et de l'aorte abdominale in vivo chez la souris normale (à gauche) et chez un receveur de greffe aortique (panneau de droite). Les images ont été réalisées avec un instrument Visualsonics Vevo 660. Les astérisques indiquent la lumière des vaisseaux.

Discussion

Des modèles murins de transplantation aortique fournir un certain nombre d'avantages parce que les souris sont très bien définies immunogénétiquement ^9,12,13, et ils peuvent être facilement manipulés pour modifier l'expression de gènes spécifiques, si désiré. Comme indiqué dans l'introduction, la chirurgie vasculaire chez la souris est plus difficile que la plupart des modèles en raison de la taille des navires. Même les grandes artères, comme l'aorte sont généralement pas plus de 100-200 pm de diamètre intérieur, de sorte manipuler ces navires nécessite une quantité importante d'habileté et de dextérité ^8,14. La complication la plus fréquente observée dans ce type de chirurgie par ceux qui commencent tout juste à mettre en œuvre le système est patte postérieure paralysie, généralement causée par une thrombose résultant d'une lésion de l'intima par une manipulation brutale ou de serrage. La plupart des colliers commercialisés par les entreprises qui vendent des outils appropriés pour la microchirurgie de créer trop de pression pour être utilisé pour les souris, avec des pressions généralement supérieures à 25 g / cm ^2. Le clamps que nous utilisons sont lisses, avec une pression de 2 g / cm ^2, une pression qui est juste assez pour obtenir l'hémostase et de ne pas endommager les vaisseaux. Certains chirurgiens préfèrent utiliser suture plutôt que de pinces. Nous ne recommandons pas cette pratique, car il s'agit d'une méthode qui dépend fortement de la capacité du chirurgien à mesurer la pression correcte et, à notre avis, peuvent contribuer à un faible taux de réussite. Avec la pratique, les taux de survie de 90% ou plus doit être prévu.

Suture technique pour les anastomoses bout-en-bout est une compétence essentielle qui est acquis avec l'expérience. Selon l'expérience préalable avec les techniques chirurgicales et la dextérité manuelle, la maîtrise complète peut être obtenue après 50 à 100 procédures. Des études plus récentes suggèrent technologies alternatives pour anastomoses pourraient être disponibles dans l'avenir ^15.

Le principal inconvénient de cette procédure est, comme la plupart des procédures de microchirurgie chez la souris, d'un haut niveau de compétence estnécessaires à l'exécution réussie et les individus sans d'excellentes habiletés motrices fines peuvent ne jamais atteindre un niveau de compétence élevé. Cependant, avec la pratique, la plupart des individus peuvent atteindre un taux de survie acceptable. La petite taille des tissus entraîne également des contraintes supplémentaires en raison de la taille du greffon est très faible, de sorte que la quantité de matière pour une analyse ultérieure est limitatif. Le plus grand avantage de ce modèle est l'immunogénétique bien caractérisées de la souris, la grande disponibilité de nombreuses souches consanguines, souris transgéniques et des souris knock-out, ce qui permet des expériences très utiles pour aborder les mécanismes moléculaires in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240