Summary
Brug af Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for overvågning af præklinisk kræftbehandling er beskrevet her. Denne fremgangsmåde drager fordel af Cerenkov stråling (CR) og optisk billeddannelse (OI) for at visualisere radioaktivt mærkede prober og tilvejebringer således et alternativ til PET i prækliniske terapeutisk overvågning og lægemiddelscreening.
Abstract
I molekylær billeddannelse, er positronemissionstomografi (PET) og optisk billeddannelse (OI) to af de vigtigste og dermed mest anvendte modaliteter 1. PET er karakteriseret ved sin fremragende følsomhed og kvantificering evne mens OI er bemærkelsesværdig for ikke-stråling, relativt lave omkostninger, korte scanningstid, high throughput, og bred tilgængelighed til grundlæggende forskere. Men begge modaliteter har deres mangler så godt. PET lider af dårlig rumlig opløsning og høje omkostninger, mens OI hovedsagelig er begrænset til prækliniske anvendelser på grund af dens begrænsede vævspenetration sammen med fremtrædende spredende optiske signaler gennem tykkelsen af levende væv.
For nylig en bro mellem PET og OI er kommet med opdagelsen af Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) 2-4. CLI er en ny afbildningsmodalitet der udnytter Cerenkov Radiation (CR) til billede radionuklider med OI instrumenter. Russisk Nobel laureate Alekseyevich Cerenkov og hans kolleger oprindelig opdaget CR i 1934. Det er en form for elektromagnetisk stråling, når en ladet partikel bevæger sig med en overlystunnel hastighed i et dielektrisk medium 5. Den ladede partikel, enten positron eller elektron, forstyrrer det elektromagnetiske felt af mediet ved at forskyde elektronerne i sine atomer. Efter at have passeret af afbrydelsen fotoner udsendes som de fordrevne elektroner tilbage til grundtilstanden. For eksempel blev en 18 F henfald forventes at producere et gennemsnit på 3 fotoner i vand 3.
Siden sin opståen, er CLI blevet undersøgt for dens anvendelse i en række af prækliniske anvendelser, herunder in vivo-tumorafbildning, reportergen billeddannelse, radiotracer udvikling, multimodalitet billeddannelse bl.a. 2,3,6. Den vigtigste grund til, at CLI har haft stor succes indtil videre, er, at denne nye teknologi udnytter de lave omkostninger og wide tilgængeligheden af OI til billede radionuklider, der anvendes, der skal afbildes kun dyrere og mindre tilgængelig nukleare billeddiagnostiske metoder såsom PET.
Her præsenterer vi Metoden med at bruge CLI til at overvåge kræft medicinsk behandling. Vores gruppe har for nylig undersøgt denne nye applikation og valideret dets gennemførlighed af et proof-of-concept studie 7. Vi viste, at CLI og PET udviste fremragende sammenhænge på tværs af forskellige tumorxenotransplantater og billedbehandling sonder. Dette er i overensstemmelse med det overordnede princip om CR at CLI væsentlige visualiserer de samme radionuklider som PET. Vi valgte Bevacizumab (Avastin, Genentech / Roche) som vores terapeutisk middel, fordi det er en velkendt angiogeneseinhibitor 8. Modning af denne teknologi i den nærmeste fremtid kan forestille sig at have en betydelig indvirkning på præklinisk udvikling af lægemidler, screening, såvel som terapi overvågning af patienter, der får behandling.
Protocol
1. Tumormodel
- Kultur H460-celler (American Type Culture Collection) i RPMI 1640 medium suppleret med 10% kalvefosterserum og 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen Life Technologies). Det skal bemærkes, at valg af cellelinier, dyrkningsmedier placeringen af inokulation, antal xenotransplantater per mus, og andre overvejelser er alle skal tilpasses målene i en særlig undersøgelse. Her vil vi kun præsentere ét specifikt projekt design til at tjene som en illustration.
- Opretholde cellelinier i en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C og skifte til frisk medium hver anden dag.
- Når et 75% sammenflydende monolag af celler er dannet, tages af monolaget med trypsin og dissociere celler til en enkelt-cellesuspension for yderligere cellekultur.
- Suspendere ca 1 × 10 6 H460 celler i phosphatbufret saltvand (PBS, Invitrogen) og implantatet subkutant ibåde venstre og højre skuldre nøgne mus (hun athymiske nøgne mus (nu / nu), 4-6 uger gamle, Charles River Laboratories, Inc.).
- Tillad tumorer at vokse til 150-200 mm3. Det tager ca 2 uger for H460 tumorxenotransplantater at vokse til denne størrelse. Standard caliper måling udføres for at spore tumorstørrelser.
- Når tumorer nå den ideelle størrelse de tumorbærende mus er nu klar til behandling og in vivo-afbildning ved hjælp af både PET-og CLI.
2. PET
- Udfør PET-undersøgelser i henhold til denne tidsplan eller enhver variation af det, afhængigt af det konkrete projekt (figur 1) 7. En række faktorer kan påvirke udformningen af tidsplanen, herunder, men ikke begrænset til, valg af tumor xenograft cellelinier, anticancerlægemidler og dosis. Her vil vi kun præsentere ét specifikt imaging tidsplan. CLI studier, der skal udføres i overensstemmelse medsamme tidsplan som de af de PET-undersøgelser med CLI umiddelbart efter den tilsvarende PET. Det skal også her bemærkes, at formålet med PET-undersøgelser er primært til validering af CLI resultater. For almindelige brugere, der bare ønsker at benytte OI instrumenter til billeddannelse radioaktivt mærkede prober, er ikke PET nødvendig. Hvis man imidlertid ikke ønsket PET validering det skal understreges, at PET-og CLI instrumenter være placeret i meget tæt nærhed til validering blive en succes på grund af den korte halveringstid af 18F (109,77 min).
- Opdel mus i behandlingsgrupper og kontrolgrupper (n ≥ 3 hver). Behandling af mus i behandlingsgruppen med 2 injektioner af bevacizumab på 20 mg / kg på dag 0 og 2.. Dag 0 er defineret ved den første injektion. Bemærk, at på dag -1 a pre-scanning skal udføres via både PET-og CLI.
- Small-dyr PET af tumor-bærende mus skal udføres med en R4 gnavermodel scanner (Siemens Medical Solutions USA, Inc.).
- Bedøve alle mus med 2% isofluran (Aerrane, Baxter) og injicere 3'-deoxy-3'-18F-fluorthymidin (18 F-FLT, 7,3-8,0 MBq [198-215 uCi]) via halevenen. PET-probe skal fortyndes i PBS inden injektion.
- Efter 1 time bedøve musene igen og placeres bedøvede mus udsat og i nærheden af midten af synsfeltet for de små dyr PET-scanner.
- Opnå tre-minutters statiske scanninger og rekonstruere billederne ved en 2-dimensional ordnet-delmængder forventning maksimal algoritme. Baggrund korrektion er ikke nødvendig.
- Tegn områder af interesse (ROI'er, 5 pixels for koronale og transaksial skiver) over tumorerne på henfald-korrigerede hele kroppen coronal billeder. Opnå de maksimale tællinger per pixel per minut fra ROIs og konvertere til tællinger per milliliter per minut ved anvendelse af en kalibreringskonstant. Med antagelsen af en væv massefylde på 1 g / ml, konvertere ROIs til tæller per gram per minut. Bestem billede ROI-afledte% ID / g-værdier ved at dividere tællinger pr gram per minut ved injicerede dosis. Dæmpning korrektion er ikke nødvendig.
3. CLI
- CLI skal udføres med et IVIS Spectrum system (Caliper Life Sciences). Erhvervelse og analyse af billederne skal udføres under anvendelse af levende billede 3.0 software (Caliper Life Sciences). Bølgelængde-løst spektral billeddannelse skal udføres under anvendelse af en 18-set smalbåndet emissionsfilter (490-850 nm). Igen, for hver mus, udføre CLI umiddelbart efter PET for at minimere mængden af radioaktivt henfald, hvis PET-undersøgelser er inkluderet i protokollen.
- Placer dyr i en lystæt kammer under isofluran anæstesi. Flere mus kan placeres samtidigt at forøge gennemløbet.
- Erhverve billeder med 3 min eksponeringstid (f / stop = 1, binning = 4). Brug de samme belysning indstillinger (spænding i lampen, filtre, f / stop, synsfelter, binning) at erhverve alle billeder. Anvende den dorsale hudområde beregne signal intensitet baggrunden væv. Normalisere fluorescensemission til fotoner per sekund per centimeter tildannet pr steradian (p / s / cm 2 / sr).
4. Repræsentative resultater
Visuel sammenligning af CLI og PET-billeder kan let udføres. Efter samlende skalalinjen tværs billeder fra samme modalitet og sted CLI og PET billeder ved siden af hinanden kan man se i denne repræsentativt panel (figur 2A), at både CLI og PET afslørede faldt betydeligt signaler fra H460 xenotransplantater i behandlede mus fra forbehandling til dag 3, hvilket tyder på signifikant terapeutisk virkning. Til sammenligning var moderat forøget til uændrede signaler observeret i ubehandlede mus i samme tidsperiode (data ikke vist). Ved visuel inspektion alene kan man iagttage, at der er en god konsistens mellem tumor kontraster, der visualized fra CLI og PET. Faktisk har denne visuelle korrelation tilstrækkelig opløsning til at vise central nekrose af tumoren sekundær til anticancer behandling (Sammenlign venligst CLI og PET-billeder fra dag 3). At validere billeddannende resultater kvantificeringer og korrelationsanalyse kan udføres.
Kvantificering af CLI og PET-billeder og en enkel montering via lineær regression viste, at de to modaliteter faktisk havde en fremragende korrelation (figur 2B, R2 = 0,9309 for 18F-FLT probet behandlingsgruppe). Især i alle vores CLI og PET billeddiagnostiske undersøgelser med forskellige tumor-modeller og forskellige anticancerlægemidler skråningerne af anfald er også bemærkelsesværdigt tæt, hvilket antyder en god pasform af lineær regression, selv om alle data er conglomerated (data ikke vist). Begge repræsentative billeder er tilpasset fra vores tidligere publikation 7.
inden-page = "altid"> 
Figur 1. Skematisk af eksperimentel design af PET og CLI undersøgelser. Tumorer blev implanteret bilateralt i skulderområdet og lodes vokse til 150-200 mm3, og tumor-bærende mus blev udsat for in vivo-afbildning ved hjælp af PET og CLI på dag -1, 1 og 3. Bevacizumab behandling blev udført med 2 injektioner af 20 mg / kg på dag 0 og 2..
Figur 2. (A) In vivo CLI og PET-billeder af mus, der bærer H460 xenotransplantater behandlet med Bevacizumab før behandling (præ-scan) og efter behandling (dag 3). (B) tilsvarende kvantitative analyse af CLI og PET resultater (n = 3) og deres korrelationer. Billeder tilpasset fra (6).e.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLI fremstår som en lovende molekylær billeddannelse teknik, der har fundet potentialer i mange grundlæggende videnskab forskning applikationer og endda klinisk brug 2,3,9. De store fordele ved CLI frem for traditionelle nukleare billeddiagnostiske metoder såsom PET stammer fra brugen af OI instrumenter, som er lettere at bruge, der er kendetegnet ved korte erhvervelse tid og high throughput, væsentligt billigere, og mere bredt tilgængelige for forskere. Derudover hvad adskiller CLI bortset fra OI i almindelighed er dens brug af β-udledende mærkede molekyler som billedbehandling sonder, hvoraf mange er blevet godkendt af Food and Drug Administration (FDA), i modsætning til traditionelle OI midler. Med disse unikke og ønskelige egenskaber, har CLI hurtigt høstet opmærksomhed fra området molekylær billeddannelse. Alligevel sine potentialer i prækliniske og kliniske applikationer er endnu ikke undersøgt til bunds.
Cancer terapi overvågning er et af de områder, hvor CLI kan have nogle væsentlig anvendelighed. Det er et meget vigtigt område, som er nøglen til probe udvikling, lægemiddelscreening, og selv skræddersy cancerterapi for patienterne. I øjeblikket er præklinisk kræftbehandling kontrol, der udføres næsten udelukkende via nukleare billeddiagnostiske metoder såsom PET. Derfor CLI giver et meget attraktivt alternativ til PET, navnlig i betragtning af, at der er en fremragende korrelation mellem CLI og PET-billeder. Endnu en anden fordel ved CLI til terapi overvågning ligger i det faktum, at CLI kan billedet ikke kun β +-emittere, men også β - emittere, såsom 32P, 90Y, og 131 I, som alle er klinisk relevant.
Men CLI er ikke uden fejl. Afhængigheden OI instrumenter dikterer, at CLI lider nogle mangler, der er uløseligt forbundet med optisk billeddannelse, såsom signal dæmpning og spredning i levende væv. Desuden den særlige spektrum af CR ogsåresulterer i begrænset signalintensitet og efterfølgende, jo dybere signalet fra kroppens overflade, jo lavere følsomhed, og dårligere kvantificering kapacitet 4. Men mens de mangler kan ses at være signifikant, kan man i vid udstrækning uden om disse forhindringer i præklinisk forskning ved anvendelse af små dyr, såsom mus. Hvad vigtigere er, er der mindst et par af kliniske områder, der potentielt kan drage fordel af CLI cancerterapi overvågning. Overvågning overfladiske sygdom enheder såsom dermatologiske inflammatoriske tilstande og kræft kan tjene som et godt eksempel. Endvidere sygdomsenheder der er dybt endnu tilgængelige ved ladningskoblet indretning eller fiberoptiske teknikker kan anvende den fremragende følsomhed og kvantificering evne CLI også. Endnu en spændende mulighed ligger i at bruge CLI at hjælpe kirurgen indhenter anatomisk og funktionel information om tumorer i operationsstuen. To nylige proof-of-concept studier have påvist påvisning og resektion af tumorer i mus med intraoperativ billede vejledning takket være CLI 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi anerkender støtte fra National Cancer Institute (NCI) R01 CA128908 og Stanford Medical Scholar Research Fellowship. Ingen anden potentiel interessekonflikt med relevans for denne artikel blev rapporteret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H460 Cell Line | American Type Culture Collection | ATCC Number: HTB-177 | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen Life Technologies | 12633-012 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10091-148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15640-055 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Life Technologies | 10010-023 | |
| Female Athymic Nude Mice | Charles River Laboratories, Inc. | Strain Code: 088 | |
| Bevacizumab (Avastin) | Genentech/Roche | N/A | |
| MicroPET Rodent R4 | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | N/A | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter | Baxter Number: AHN3637 | |
| IVIS Spectrum | Caliper Life Sciences | N/A |
References
- Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219 (2), 316 (2001).
- Chen, K., Chen, X. Positron emission tomography imaging of cancer biology: current status and future prospects. Semin. Oncol. 38 (1), 70 (2011).
- Solomon, M., Liu, Y., Berezin, M. Y., et al. Optical imaging in cancer research: basic principles, tumor detection, and therapeutic monitoring. Med. Princ. Pract. 20 (5), 397 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Miao, Z., et al. Molecular Optical Imaging with Radioactive Probes. PLoS One. 5 (3), e9470 (2010).
- Robertson, R., Germanos, M. S., Li, C., et al. Optical imaging of Cerenkov light generation from positron-emitting radiotracers. Phys. Med. Biol. 54 (16), N355 (2009).
- Xu, Y., Liu, H., Cheng, Z. Harnessing the power of radionuclides for optical imaging: Cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 52 (12), 2009 (2011).
- Cerenkov, P. Visible emission of clean liquids by action of g-radiation. Dokl Akad Nauk SSSR. 2, 451 (1934).
- Cerenkov, P. A. Visible radiation produced by electrons moving in a medium with velocities exceeding that of light. Phys Rev. 52 (4), 0378 (1937).
- Boschi, F., Calderan, L., D'Ambrosio, D., et al. In vivo 18F-FDG tumour uptake measurements in small animals using Cerenkov radiation. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 38 (1), 120 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Liu, S., et al. Optical imaging of reporter gene expression using a positron-emission-tomography probe. J. Biomed. Opt. 15 (6), 060505 (2010).
- Park, J. C., Yu, M. K., An, G. I., et al. Facile preparation of a hybrid nanoprobe for triple-modality optical/PET/MR imaging. Small. 6 (24), 2863 (2010).
- Xu, Y., Chang, E., Liu, H., et al. Proof-of-concept study of monitoring cancer drug therapy with cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 53 (2), 312 (2012).
- Ellis, L. M. Bevacizumab. Nat. Rev. Drug Discov. , Suppl S8. (2005).
- Hochster, H. S. Bevacizumab in combination with chemotherapy: first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer. Semin. Oncol. 33, Suppl 5 . 10. (2006).
- Dothager, R. S., Goiffon, R. J., Jackson, E., et al. Cerenkov radiation energy transfer (CRET) imaging: a novel method for optical imaging of PET isotopes in biological systems. PLoS One. 5 (10), e13300 (2010).
- Hu, Z., Liang, J., Yang, W., et al. Experimental Cerenkov luminescence tomography of the mouse model with SPECT imaging validation. Opt. Express. 18 (24), 24441 (2010).
- Park, J. C., Il An, G., Park, S. I., et al. Luminescence imaging using radionuclides: a potential application in molecular imaging. Nucl. Med. Biol. 38 (3), 321 (2011).
- Holland, J. P., Normand, G., Ruggiero, A., et al. Intraoperative imaging of positron emission tomographic radiotracers using Cerenkov luminescence emissions. Mol. Imaging. 10 (3), 177 (2011).
- Intraoperative imaging of tumors using Cerenkov luminescence endoscopy: a feasibility experimental study. J. Nucl. Med. Liu, H., Carpenter, C. M., Jiang, H., et al. , (2012).
