Summary
Het gebruik van Cerenkov Luminescentie Imaging (CLI) voor de bewaking van preklinische behandeling van kanker wordt hier beschreven. Deze methode maakt gebruik van Cerenkov Straling (CR) en optische beeldvorming (OI) om radioactief gemerkt sondes visualiseren en biedt dus een alternatief voor PET in preklinische therapeutische monitoring en screening van geneesmiddelen.
Abstract
In moleculaire beeldvorming, positron emissie tomografie (PET) en optische (OI) zijn twee van de belangrijkste en dus meest gebruikte modaliteiten 1-3. PET wordt gekenmerkt door zijn uitstekende gevoeligheid en kwantificering mogelijkheid tijdens OI is opmerkelijk voor niet-straling, relatief lage kosten, korte scantijd, high throughput, en ruime beschikbaarheid tot basisvoorzieningen onderzoekers. Echter, beide modaliteiten hebben hun tekortkomingen ook. PET lijdt aan een slechte ruimtelijke resolutie en hoge kosten, terwijl de OI is meestal beperkt tot preklinische toepassingen omwille van de beperkte penetratie, samen met prominente verstrooiing optische signalen door de dikte van levende weefsels.
Onlangs is een brug tussen PET en OI heeft zich met de ontdekking van Cerenkov Luminescentie Imaging (CLI) 4-6. CLI is een nieuwe beeldvormende modaliteit die Cerenkov Straling (CR) maakt gebruik van om de afbeelding radionucliden met OI instrumenten. Russische Nobel LaurEATE Alekseyevich Cerenkov en zijn collega's oorspronkelijk ontdekt CR in 1934. Het is een vorm van elektromagnetische straling bij een geladen deeltje beweegt met een snelheid superluminale in een diëlektrisch medium 7,8. Het geladen deeltje, of positron of elektron verstoort het elektromagnetische veld van het medium door het verplaatsen van de elektronen in de atomen. Na het passeren van de verstoring fotonen worden uitgezonden als de verplaatste elektronen terug naar de grondtoestand. Zo werd een 18 F verval schatting gemiddeld 3 fotonen produceren in water 5.
Sinds de opkomst is CLI onderzocht voor het gebruik in verschillende toepassingen, zoals preklinische in vivo tumor imaging, reportergen beeldvorming, radiotracer ontwikkeling multimodale beeldvorming onder andere 4,5,9,10,11. De belangrijkste reden waarom CLI heeft genoten veel succes tot nu toe is dat deze nieuwe technologie gebruik maakt van de lage cost en ruime beschikbaarheid van OI om de afbeelding radionucliden, die vroeger af te beelden alleen door duurdere en minder beschikbare nucleaire beeldvormende technieken zoals PET.
Hier geven we de methode waarbij CLI kanker therapie te volgen. Onze groep heeft onlangs onderzocht deze nieuwe toepassing en gevalideerd de haalbaarheid van een proof-of-concept studie 12. We hebben aangetoond dat CLI en PET uitstekende correlaties tentoongesteld in verschillende tumor xenotransplantaten en probes voor medische beeldvorming. Dit is in overeenstemming met het algemene beginsel van CR dat CLI wezen dezelfde radionucliden PET visualiseert. We selecteerden Bevacizumab (Avastin; Genentech / Roche) als onze therapeutisch middel omdat het een bekende angiogeneseremmer 13,14. Rijping van deze technologie in de nabije toekomst kan worden beoogd een significant effect op preklinische ontwikkeling, screening, alsook therapie controle van patiënten die behandelingen.
Protocol
1. Tumor Model
- Cultuur H460 cellen (American Type Culture Collection) in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine (Invitrogen Life Technologies). Er zij opgemerkt dat de keuze van cellijnen, voedingsbodems, plaatsen van inoculatie, aantal xenografts per muis en andere overwegingen gelden worden aangepast aan de doelen van een bepaald onderzoek. Hier presenteren we u alleen een specifiek project het ontwerp om te dienen als een illustratie.
- Handhaven cellijnen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C en ga naar vers medium elke andere dag.
- Wanneer een 75% confluente monolaag van cellen gevormd, los de monolaag met trypsine en dissociëren cellen in een enkele celsuspensie voor verdere celkweek.
- Schorsen ongeveer 1 x 10 6 H460 cellen in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; Invitrogen) en subcutaan implantaat inlinks en rechts schouders van naakt muizen (vrouwelijke athymische naakt-muizen (nu / nu), 4 - 6 weken oud, Charles River Laboratories, Inc.)
- Toestaan tumoren groeien tot 150 - 200 mm 3. Het duurt ongeveer 2 weken H460 tumorxenotransplantaten groeien tot deze grootte. Caliper standaard meting uitgevoerd om tumorgrootten volgen.
- Wanneer tumoren het ideale grootte van de tumor dragende muizen zijn nu klaar voor de behandeling en in vivo beeldvorming via zowel PET-en CLI bereiken.
2. PET
- Voer de PET studies volgens dit schema of een variant daarvan afhankelijk van de specifieke project (figuur 1) 12. Een aantal factoren kunnen invloed hebben op de vormgeving van het rooster, waaronder, maar niet beperkt tot, tumor xenograft keuze van cellijnen, antikankergeneesmiddelen, en doseringsschema. Hier presenteren we u alleen een specifieke beeldvorming schema. De CLI studies worden uitgevoerd volgens dehetzelfde schema als die van de PET studies met CLI uitgevoerd onmiddellijk na de overeenkomstige PET. Hierbij moet worden opgemerkt dat het doel van de PET studies is hoofdzakelijk voor validatie van de CLI resultaten. Voor gewone gebruikers die alleen maar willen OI instrumenten te gebruiken voor imaging radioactief gemerkt sondes, geen PET is noodzakelijk. Echter, als men doet verlangen PET validatie moet worden benadrukt dat PET-en CLI-instrumenten moeten zich binnen zeer dicht voor de validatie om succesvol te zijn vanwege de korte halfwaardetijd van 18 F (109,77 min).
- Verdeel muizen in behandelings-en controlegroepen (n ≥ 3 elk). Behandel muizen in de behandelde groep met 2 injecties van bevacizumab van 20 mg / kg op dag 0 en 2. Dag 0 wordt bepaald door de eerste injectie. Merk op dat op dag -1 een pre-scan worden uitgevoerd via zowel PET en CLI.
- Kleine dieren PET van tumor-dragende muizen wordt uitgevoerd met een R4 knaagdiermodel scanner (Siemens Medical Solutions USA, Inc.)
- Verdoven alle muizen met 2% isofluraan (Aerrane, Baxter) en injecteren 3'-deoxy-3'-18 F-fluorothymidine (18 F-FLT, 7,3 tot 8,0 MBq [198 tot 215 uCi]) via de staartader. De PET probe wordt verdund in PBS vóór injectie.
- Na 1 uur, weer verdoven muizen en plaats verdoofde muizen gevoelig en vlakbij het centrum van het gezichtsveld van de kleine dieren PET-scanner.
- Verkrijgen van drie minuten statische scans en reconstrueren de beelden door een 2-dimensionale geordende-subsets verwachting maximaal algoritme. Achtergrondcorrectie niet nodig.
- Teken regio's van belang (ROI, 5 pixels voor coronale en transaxiale plakjes) over de tumoren op de verval-gecorrigeerde hele lichaam coronale beelden. Om de maximale tellingen per pixel per minuut van de ROI en converteren naar tellingen per milliliter per minuut met behulp van een ijkconstante. Met de aanname van een weefsel dichtheid van 1 g / ml, converteert u de ROI's te tellenper gram per minuut. Bepaal image ROI afkomstige% ID / g waarden te delen counts per gram per minuut toegediende dosis. Attenuatiecorrectie niet nodig.
3. CLI
- CLI wordt uitgevoerd met een IVIS Spectrum systeem (Caliper Life Sciences). Verwerven en analyseren van beelden worden uitgevoerd met Living Image 3.0 software (Caliper Life Sciences). Golflengte opgelost spectrale imaging wordt uitgevoerd met een 18-set smalbandige emissie filter (490 - 850 nm). Nogmaals, voor elke muis, voert CLI onmiddellijk na PET om de hoeveelheid radioactief verval minimaliseren indien de PET studies zijn opgenomen in het protocol.
- Plaats dieren in een lichtdichte kamer onder isofluraan anesthesie. Meerdere muizen kunnen tegelijkertijd worden geplaatst om de doorvoer te verhogen.
- Acquire beelden met behulp van 3 min. belichtingstijd (f / stop = 1, binning = 4). Gebruik dezelfde verlichting instellingen (lampspanning, filters, f / stop, gezichtsveld, Binning) om alle beelden te verwerven. Gebruik de dorsale huid om de signaalintensiteit van weefsel achtergrond berekenen. Normaliseren fluorescentie-emissie van fotonen per seconde per vierkante centimeter per steradiaal (p / s / cm 2 / sr).
4. Representatieve resultaten
Visuele vergelijking van CLI en PET beelden kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd. Na de eenmaking van de schaal bar aan beelden van dezelfde modaliteit en plaats CLI-en PET-beelden naast elkaar te zien is in dit representatief panel (Figuur 2A) dat zowel CLI en PET sterk gedaald signalen van H460 xenotransplantaten in behandelde muizen van voorbehandeling onthuld tot dag 3 suggereert significant therapeutisch effect. Ter vergelijking werden matig verhoogd tot ongewijzigd signalen waargenomen bij onbehandelde muizen gedurende dezelfde periode (data niet getoond). Door visuele inspectie alleen kan men constateren dat er een goede consistentie tussen tumor contrasten die zijn visueleseerd van CLI en PET. In feite is dit visuele correlatie heeft voldoende resolutie om centrale necrose van de tumor secundair aan de behandeling tegen kanker regime (gelieve vergelijken de CLI-en PET-beelden van Dag 3) laten zien. De imaging bevindingen kwantificering valideren en correlatie analyse kan worden uitgevoerd.
Kwantificering van CLI en PET beelden en een eenvoudige montage via lineaire regressie blijkt dat de twee modaliteiten inderdaad een uitstekende correlatie (Figuur 2B, R2 = 0,9309 voor 18 F-FLT gehybridiseerd behandelingsgroep) was. Met name in al onze CLI en PET imaging studies met verschillende tumormodellen en andere antikankergeneesmiddelen de hellingen van de fits zijn ook opmerkelijk afsluiten, wat erop wijst een uitstekende pasvorm van lineaire regressie zelfs van gebundelde gegevens (data niet getoond). Beide representatieve beelden worden aangepast van onze vorige publicatie 12.
er.within-page = "always"> 
Figuur 1. Schema van de experimentele opzet van PET en CLI studies. Tumoren werden bilateraal geïmplanteerd in schoudergebied en toegestaan te groeien tot 150-200 mm 3 en tumor-dragende muizen werden onderworpen aan in vivo beeldvorming via PET en CLI op dag -1, 1 en 3. Bevacizumab behandeling werd uitgevoerd met 2 injecties van 20 mg / kg op dag 0 en 2.
Figuur 2. (A) In vivo CLI en PET beelden van muizen die xenografts behandeld met H460 Bevacizumab vóór behandeling (pre-scan) en na behandeling (dag 3). (B) overeenkomstige kwantitatieve analyse van CLI en PET resultaten (n = 3) en de correlaties. Afbeeldingen aangepast van (6).arge.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLI is in opkomst als een veelbelovende moleculaire beeldvormende techniek die mogelijkheden heeft gevonden in tal van fundamenteel wetenschappelijk onderzoek toepassingen en zelfs klinisch gebruik 4,5,15,16,17. De belangrijkste voordelen van CLI ten opzichte van traditionele nucleaire beeldvormende technieken zoals PET gevolg zijn van het gebruik van de OI-instrumenten, die gemakkelijker te gebruiken, gekenmerkt door korte acquisitie tijd en hoge doorvoer, aanzienlijk goedkoper en meer op grote schaal beschikbaar voor onderzoekers. Bovendien, wat sets CLI, afgezien van OI in het algemeen is het gebruik van β-emitting gelabelde moleculen als probes voor medische beeldvorming, waarvan er vele zijn goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA), in tegenstelling tot traditionele OI agenten. Met deze unieke en wenselijke eigenschappen, heeft CLI snel oogstte aandacht van het gebied van moleculaire beeldvorming. Toch zijn mogelijkheden in preklinische en klinische toepassingen zijn nog niet volledig onderzocht.
Kankertherapie controle een van de gebiedenwaar CLI kan een aantal belangrijke utility. Het is een zeer belangrijk dat de sleutel tot de ontwikkeling probe, drug screening en zelfs maat kankertherapie voor patiënten. Momenteel wordt preklinische kankertherapie controle nagenoeg uitsluitend via nucleaire beeldvormende technieken zoals PET. Daarom CLI biedt een zeer aantrekkelijk alternatief voor PET, met name gezien het feit dat er een uitstekende correlatie tussen CLI-en PET-beelden. Nog een ander voordeel van CLI voor therapie controle ligt in het feit dat CLI kan afbeelding niet alleen β +-emitters, maar ook β - emitters zoals 32p, 90Y en 131 I, die klinisch relevant.
Echter, CLI is niet zonder gebreken. De afhankelijkheid van OI instrumenten dicteert dat CLI lijdt aan een aantal tekortkomingen die inherent zijn aan optische beeldvorming, zoals signaalverzwakking en verstrooiing in levende weefsels. Bovendien de specifieke spectrum vanCR resulteert ook in beperkte signaalintensiteit en vervolgens de dieper het signaal van lichaamsoppervlak, de lagere gevoeligheid en hoe slechter de kwantificering vermogen 6. Echter, terwijl de tekortkomingen kunnen worden bekeken significant te zijn, kan men grotendeels omzeilen deze obstakels in preklinisch onderzoek door het gebruik van kleine dieren zoals muizen. Wat nog belangrijker is, zijn er minstens een paar van klinische gebieden die mogelijk kunnen profiteren van de CLI kankertherapie monitoring. Monitoring oppervlakkige ziekte-entiteiten, zoals dermatologische inflammatoire aandoeningen en kanker kan dienen als een goed voorbeeld van. Bovendien ziekte entiteiten die diep bereiken met de charge-coupled device of glasvezel gebaseerde technieken kunnen de uitstekende gevoeligheid en kwantificering vermogen van CLI ook. Nog een andere spannende mogelijkheid ligt in het gebruik van CLI te helpen chirurgen anatomische en functionele informatie over tumoren te verkrijgen in de operatiekamer. Twee recente proof-of-concept studies hebben aangetoond detectie en verwijdering van tumoren in muizen met intraoperatieve beeldgeleiding dankzij CLI 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij erkennen de steun van het National Cancer Institute (NCI) R01 CA128908 en Stanford Medical Scholar Research Fellowship. Geen enkele andere potentiële belangenconflicten die relevant zijn voor dit artikel werd gemeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H460 Cell Line | American Type Culture Collection | ATCC Number: HTB-177 | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen Life Technologies | 12633-012 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10091-148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15640-055 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Life Technologies | 10010-023 | |
| Female Athymic Nude Mice | Charles River Laboratories, Inc. | Strain Code: 088 | |
| Bevacizumab (Avastin) | Genentech/Roche | N/A | |
| MicroPET Rodent R4 | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | N/A | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter | Baxter Number: AHN3637 | |
| IVIS Spectrum | Caliper Life Sciences | N/A |
References
- Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219 (2), 316 (2001).
- Chen, K., Chen, X. Positron emission tomography imaging of cancer biology: current status and future prospects. Semin. Oncol. 38 (1), 70 (2011).
- Solomon, M., Liu, Y., Berezin, M. Y., et al. Optical imaging in cancer research: basic principles, tumor detection, and therapeutic monitoring. Med. Princ. Pract. 20 (5), 397 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Miao, Z., et al. Molecular Optical Imaging with Radioactive Probes. PLoS One. 5 (3), e9470 (2010).
- Robertson, R., Germanos, M. S., Li, C., et al. Optical imaging of Cerenkov light generation from positron-emitting radiotracers. Phys. Med. Biol. 54 (16), N355 (2009).
- Xu, Y., Liu, H., Cheng, Z. Harnessing the power of radionuclides for optical imaging: Cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 52 (12), 2009 (2011).
- Cerenkov, P. Visible emission of clean liquids by action of g-radiation. Dokl Akad Nauk SSSR. 2, 451 (1934).
- Cerenkov, P. A. Visible radiation produced by electrons moving in a medium with velocities exceeding that of light. Phys Rev. 52 (4), 0378 (1937).
- Boschi, F., Calderan, L., D'Ambrosio, D., et al. In vivo 18F-FDG tumour uptake measurements in small animals using Cerenkov radiation. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 38 (1), 120 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Liu, S., et al. Optical imaging of reporter gene expression using a positron-emission-tomography probe. J. Biomed. Opt. 15 (6), 060505 (2010).
- Park, J. C., Yu, M. K., An, G. I., et al. Facile preparation of a hybrid nanoprobe for triple-modality optical/PET/MR imaging. Small. 6 (24), 2863 (2010).
- Xu, Y., Chang, E., Liu, H., et al. Proof-of-concept study of monitoring cancer drug therapy with cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 53 (2), 312 (2012).
- Ellis, L. M. Bevacizumab. Nat. Rev. Drug Discov. , Suppl S8. (2005).
- Hochster, H. S. Bevacizumab in combination with chemotherapy: first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer. Semin. Oncol. 33, Suppl 5 . 10. (2006).
- Dothager, R. S., Goiffon, R. J., Jackson, E., et al. Cerenkov radiation energy transfer (CRET) imaging: a novel method for optical imaging of PET isotopes in biological systems. PLoS One. 5 (10), e13300 (2010).
- Hu, Z., Liang, J., Yang, W., et al. Experimental Cerenkov luminescence tomography of the mouse model with SPECT imaging validation. Opt. Express. 18 (24), 24441 (2010).
- Park, J. C., Il An, G., Park, S. I., et al. Luminescence imaging using radionuclides: a potential application in molecular imaging. Nucl. Med. Biol. 38 (3), 321 (2011).
- Holland, J. P., Normand, G., Ruggiero, A., et al. Intraoperative imaging of positron emission tomographic radiotracers using Cerenkov luminescence emissions. Mol. Imaging. 10 (3), 177 (2011).
- Intraoperative imaging of tumors using Cerenkov luminescence endoscopy: a feasibility experimental study. J. Nucl. Med. Liu, H., Carpenter, C. M., Jiang, H., et al. , (2012).
